Name: Fácil e precisa Mecano-profiling em micropost Arrays (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a quantificar interações mecânicas entre células aderentes e substratos microestruturados usando o software MechProfiler. Esta técnica de mecanobiologia oferece alta capacidade de processamento para pesquisa em câncer.

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Este trabalho foi apoiado pelo Comitê de Tecnologia e Inovação (CTI) Suíça concessão 14796-PFLS-LSCTI. As matrizes MicroPost foram generosamente fornecidas pela MicroDuits GmbH.

1. As células de cultura em micropost matrizes Nota: Todas as etapas devem ser executadas em um gabinete de biossegurança para garantir a esterilidade. Os volumes dadas aqui são para T25 frascos de cultura celular. A cultura de células meio de receita e semeadura de células densidade são otimizados para linhas celulares de cancro do osso HuO9 e M132. <ol><li> Preparar uma cultura de células para a semeadura em uma matriz micropost. <ol><li> Inspeccionar a qualidade de cultura de células, colocando o frasco de cultura sobre um microscópio de luz padrão. Certifique-se de que as células mostram um crescimento e morfologia típicas por estimar quanto do fundo garrafa de cultura é coberto. Uma cobertura de 70% -80% reflecte uma taxa de crescimento saudável. Preste atenção à quantidade de células flutuante uma vez que representam as células mortas e / ou uma cultura mato. </li><li> Tripsinizar as células e por remover o meio de lavagem com 4 ml de solução salina tamponada com fosfato 1x tampão (PBS). Adicionar 0,8 ml de 1x tripsina / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incubar a temperatura ambiente até que a células desalojar, que leva cerca de 2-4 min. Verificar o processo com o microscópio e ocasionalmente bater suavemente o frasco para suportar o desalojamento. </li><li> Adicionar 5 ml de meio de cultura celular (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) / F12 com soro a 10% de bovino fetal (FBS), 1% de penicilina / estreptavidina (Pen / Strep)) para parar a reacção e para lavar as células residuais que ainda se sente na parte inferior do frasco. Em seguida, pipetar esta suspensão cima e para baixo várias vezes, para obter uma mistura homogénea. Certifique-se de pipeta todas as soluções em toda a área de crescimento original do frasco para ganhar uma desalojar eficaz. </li><li> Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifugar-lo usando uma centrífuga de bancada a 0,5 xg durante 3 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio por pipetagem para cima e para baixo 5 vezes. Certifique-se evitar a criação de bolhas ao fazê-lo. </li><li> Determinar a densidade celular utilizando uma câmara de contagem de células e um microsco luzpe. Verifique a suspensão de células na câmara de contagem celular para agregados de células e assegurar a ter apenas as células individuais para a experiência subsequente. Pipeta novamente para cima e para baixo várias vezes se as células tendem a formar agregados para separá-los. </li><li> Dilui-se a suspensão de células com meio suficiente para obter uma solução de células de 25.000 células / ml. Misture bem invertendo o tubo fechado várias vezes. </li></ol></li><li> Prepare uma matriz micropost para semeadura de células. Nota Crítica: Não pipete para a matriz micropost diretamente, pois isso poderia prejudicar os microposts, especialmente quando as bolhas indesejados são introduzidos. Além disso, certifique-se que a matriz micropost não resseca como ocorrendo forças capilares levar a colapso dos microposts. <ol><li> Colocar o substrato de vidro com a matriz micropost viradas para cima em um poço de uma placa de 12 poços, utilizando um par de pinças e molhá-lo por adição de 1 ml de etanol (99%). Incubar à temperatura ambiente durante 20-30 seg. </li><li> Dilui-se o etanolpasso a passo através da adição de cerca de 1 ml estéril água desionizada (água Dl) do lado da aspiração e bem cerca de 1 ml, utilizando uma pipeta de transferência ou o dispositivo de aspiração. Repetir esta etapa, pelo menos, 3 vezes. </li><li> Substituir o-água Dl com tampão PBS, do mesmo modo por adição de aspiração e aproximadamente 1 ml. Repita este passo 3 vezes. </li><li> Substituir o-tampão de PBS com meio por aspiração e a adição de aproximadamente 1 ml de meio. Repita este passo 3 vezes. </li></ol></li><li> Pipete 1 mL de solução de células (25.000 células) na parte superior de cada matriz micropost preparado. Fechar placa multi-poços e transferi-lo para uma incubadora (CO2 5%, 37 ° C). Deixe as células aderir e crescer em cima de microposts para 6 -7 horas. </li><li> Inspecione o processo de adesão, ocasionalmente usando uma luz de um microscópio. Verifique se a maioria das células estão distribuídas em vários microposts. </li></ol> 2. Fixação e coloração de células Nota: Todos os passos evolumes dadas aqui são para um único poço de uma placa de 12 poços. Recomenda-se a processar não mais do que quatro dos doze poços de cada vez para evitar a secagem dos poços após a aspiração de qualquer líquido, o que resultará num colapso das microposts. <ol><li> Aspirar o meio do poço e lavar as células 2x com 1 ml de tampão PBS. Certifique-se a aplicar uma força suave durante a lavagem com PBS para remover os restos celulares que se acumulou na matriz micropost durante a incubação e de separar as células mortas. </li><li> Fixar as células com uma solução de formaldeído tamponada a 0,5 ml de 3,7% durante 5 min. </li><li> Substitua a solução de formaldeído por lavagem das 2x matriz micropost com 1 ml de água DI estéril. </li><li> Corar as células com corante (de 0,05% Azul Brilhante de Coomassie em 50% de água, etanol a 40% e ácido acético a 10%) durante cerca de 90 seg. Lavar o excesso de solução de coloração off 2x com 1 ml de água DI estéril. Adicionar 1 ml de água DI para micropost matriz. </li><li> Verifique resultado coloração utilizando um microscópio de luz. Repita tele coloração passo, se o corpo da célula for muito fraca para ser visualizado. </li><li> Matrizes micropost loja com as células marcadas na parte superior em uma geladeira a 4 ° C. Certifique-se de mantê-los sob a água em todos os momentos. </li></ol> Imagem 3. celular Nota: Passo 4 só se aplica aos microscópios sem infinidade corrigido óptica. <ol><li> Adicionar 2 ml DI-água para uma placa de Petri com um fundo de vidro fino em alta resolução de imagem. </li><li> Transferir matriz micropost usando um par de pinças para o prato de imagens com as microposts voltado para cima. </li><li> Coloque a imagiologia de Petri sobre uma fase móvel de um microscópio de luz. </li><li> Rodar o anel de compensação da lente utilizada para geração de imagens até que o número na escala representa a espessura total de todos os materiais ao longo do percurso óptico para compensar o desfasamento em índices de refracção do substrato de vidro, o elastómero de silicone e o líquido em cima. Isso deve levar a uma aparência brilhante dos micropostsnúcleos. </li><li> Fechar o diafragma do lado da iluminação até 50% e remover quaisquer anéis de contraste de fase a partir do caminho óptico de comutação para um modo de campo brilhante comum. </li><li> Alinhe a matriz micropost que os microposts formar uma linha horizontal através do campo de observação. Definir um ponto de partida (por exemplo, superior esquerdo) e mova a placa de Petri gradual em toda a fase de varredura da matriz micropost enquanto tomar várias imagens. </li><li> Tire todas as imagens com a configuração de resolução mais alta para a câmera usando uma objetiva de 20X ou 40X. Destinam-se a ter uma única célula no centro da imagem. </li><li> Varrer ao longo do eixo Z através do substrato até que as pontas micropost estão no foco. Use a roda de foco fino ajuste do microscópio e transformá-lo no sentido de centrando-se na parte inferior micropost para cerca de 2-3 mm. </li><li> Estabelecer um procedimento de imagem padrão, tomando série de imagens de teste de uma seção matriz varrendo os parâmetros de imagem uma de cada vez (por exemplo, tempo de exposição,configuração de íris, as configurações de lâmpadas etc.). Analisar imagens com MechProfiler e determinar um conjunto de parâmetros adequados para uma análise rápida e confiável. </li></ol> 4. Análise de Imagem com Open Source Software &quot;MechProfiler&quot; Nota: Todas as funções do software pode ser ativado com um dispositivo apontador com o botão esquerdo do mouse. No entanto, um operador treinado irá utilizar as teclas de atalho documentados projetado para ser na metade esquerda do teclado para permitir um processamento de imagem de duas mãos eficiente. <ol><li> Comece análise de imagem software MechProfiler e abrir uma série de imagens que precisam ser analisados, clicando em &quot;Abrir&quot;. </li><li> Introduza todos os parâmetros para a seção &quot;Configurações&quot; dada pelo desenvolvedor de software. Determinar os parâmetros que devem ser personalizada configurada (isto é, limite de contorno e à distância mínima) de acordo com os procedimentos descritos em detalhe no manual de software. </li><li> Analisar imagems um-por-um, cortando-os para a área de interesse, usando &quot;Cortar&quot; (clique e arraste com o botão do mouse pressionado). Clique duas vezes dentro do retângulo desenhado para concluir esta ação. </li><li> Marcação cada contorno celular visível um por um, clicando em &quot;desenhar os contornos de células&quot; e use o cursor de cruz para o desenho, incluindo todos os microposts a célula está ligado a. </li><li> Descarte qualquer microposts indesejados, clicando em &quot;desfazer Mensagens&quot; e usar o cursor de cruz para desenhar. Coloque todos os microposts que pertencem a uma célula do lado de fora da secção de imagem ou que são desviados por qualquer outro motivo, mas não pela célula de interesse. </li><li> Comece a sub-rotina software &quot;Encontre Centróides&quot; pelo clique do mouse. Ajuste a definição direita ao lado do botão &quot;Find Centróides&quot; até que todos os microposts são registradas, o que é visível por uma cruz vermelha em seu centro de filtro. Se a definição de filtro é muito baixa microposts irá ser ignorado, se ele for muito elevado de muposições ltiple será marcada para uma única micropost. Mantenha o filtro definição constante durante uma sessão de análise. </li><li> Use a função de edição manual &quot;Editar Manual&quot; para centroids com múltiplas posições perdidas ou micropost. Use o cabelo do mouse cruz para seleccionar a micropost em questão clicando e arrastando-o do outro lado. Clique duas vezes dentro do retângulo e coloque o marcador vermelho ausente na seção imagem ampliada, que fecha automaticamente. Descarte um tal micropost se ele está fora do contorno celular desenhado (ver passo 4.5) antes de prosseguir. </li><li> Encontre a grade micropost ideal ativando a função &quot;Gerar Grid&quot; com um clique do mouse. Garantir a posição corresponde com a cabeça micropost verdade, mostrado por um anel azul, dentro do contorno celular desenhado. </li><li> Corrija qualquer fabricante grade deslocada dentro da área da célula onde for necessário utilizar a função &quot;Manuel Editar&quot; correspondente com um clique do mouse. Use a mira para selecionar o micropost em question clicando e arrastando-o do outro lado. Clique duas vezes dentro do retângulo que aparece e coloque o marcador azul ausente na seção imagem ampliada, que fecha automaticamente. </li><li> Use o botão &quot;Calcular&quot; deflexões pelo clique do mouse para obter um histograma dos valores de deflexão calculados com base na diferença entre a posição de um micropost dentro da seção de imagem e da grelha ideal gerado. </li><li> Salve a análise completa, incluindo as tabelas de valores por um clique do mouse em &quot;Salvar&quot;. </li><li> Continuar a análise de imagem clicando em &quot;Reset View&quot; e analisar outra seção imagem ou clique do mouse em &quot;Next Imagem&quot;, que convenientemente pode ser feito usando a tecla cursor do teclado direito. </li></ol> 5. Análise de Dados - Mechanoprofiling <ol><li> Abra o arquivo &quot;Results.xls&quot; com um programa de escritório planilha da pasta com as imagens analisadas. Ele contém os dados com all valores calculados, incluindo todos os desvios micropost e medidas de derivados convencionais, tais como o trabalho (isto é, a energia de deformação do substrato) pela célula analisado. </li></ol>

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O autor principal (NG) é cofundador da MicroDuits GmbH, o fornecedor comercial das matrizes de micropostes usadas neste estudo. Nenhum outro autor tem potenciais conflitos de interesse com este trabalho.

Este trabalho visa avançar no campo da microscopia de força de tração, diminuindo substancialmente os obstáculos técnicos e práticos à entrada. Estas barreiras vêm de dois lados. Primeiro e mais importante são os inúmeros desafios técnicos não triviais que devem ser superados para a fabricação reprodutível e comissionar uma matriz micropost experimentalmente. Em segundo lugar, é a necessidade de forma semelhante não trivial para uma análise semi-automatizado de confiança de forças de células únicas - tendo em mente que ...

Ensaios baseados em células sensíveis de Mecano-permitir que células aderentes para investigar, com uma ampla gama de aplicações, que reflectem o papel central que a mecânica pode desempenhar na biologia celular. Estas aplicações costumam se concentrar sobre os mecanismos subjacentes que impulsionam processos subcelulares ou comportamento de células inteiras. Por um lado, os factores ambientais externos tais como a composição da matriz extracelular ou a rigidez da matriz pode afectar dramaticamente a resposta mecânica e biológica de uma célula. 1 O mesmo pode ser observada após a utilização de diversas classes de compostos farmaceuticamente activos, os efeitos dos quais são muitas vezes caracterizados utilizando modelos de cultura de células. 2 sobre as outras propriedades genotípicas de mão, tais como aquelas causadas por mutações genéticas espontâneas ou induzidas experimentalmente, pode induzir alterações acentuadas no fenótipo da célula que estão associadas a alterações na estrutura e na função do citoesqueleto. 3 Estes exemplos têm apenas algumas das muitas possíveistópicos para os quais fenotipagem mecânica de células é relevante, e todos eles foram útil investigado com matrizes micropost. No momento da redação deste artigo, aproximadamente 200 artigos foram publicados descrevendo a interação célula-micropost. Estas obras discutir aspectos teóricos da micropost princípios de deflexão bem como instruções práticas sobre o seu fabrico. O primeiro artigo descrevendo a interação das células e matrizes micropost flexíveis foi publicada por Tan e seus colegas em 2003. 4 Em contraste com a microscopia de força de tração clássica (TFM), onde os substratos macios contínuas são usadas para estimar a contratilidade de células nanonewton escala, Tan et al. descrito um método utilizando múltiplos feixes verticais espaçados feitas de elastómero de silicone. As principais vantagens desta técnica emergem duas características principais. Em primeiro lugar, a fim de alterar a rigidez célula-substrato resulta uma só precisa de mudar as dimensões, mantendo micropostcaso contrário, a composição do substrato constante e evitando-se assim diferenças de topologia de superfície e química. Segundo microposts atuar como molas individuais que podem ser analisados ​​de forma discreta com força e resolução espacial da ordem de adesões focais individuais e pode reduzir os desafios analíticos que são inerentes à análise análoga por padrão TFM. Hoje, a gama de aplicações para matrizes micropost excede em muito apenas o mapeamento de forças por algumas células individuais. Por exemplo, Akiyama relata o uso de um tecido isolado a partir de um vaso dorsal lagarta da traça como um actuador para uma matriz micropost, a fim de desenvolver uma potência muscular autónoma micro-robô inseto. 5 No entanto, a maioria das aplicações publicadas de microposts concentraram-se em estudos de condições médicas, como infecção ou câncer. Por exemplo, matrizes micropost têm sido utilizados para estudar a geração de forças de empacotado pili de tipo IV de Neisseria gonorrhcolónias OEA que está associado com cascatas de sinalização reforço infecção. 6 Outros usaram microposts para estudar as células de câncer de mama tratados com compostos farmacêuticos visando o citoesqueleto. 7 Deflexão de um micropost é muitas vezes descrita usando a teoria clássica do feixe para um cantilever com uma carga final assumindo que a célula atribui apenas à ponta da micropost. Aqui, a força F aplicada que provoca uma deflexão δ depende do micropost &quot;rigidez de flexão&quot; e K é calculado por: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) com E, I, e L sendo o módulo de Young, a área de momento de inércia e do feixe de comprimento, respectivamente. No entanto, os resultados de esta equação só dar uma aproximação geral das forças no trabalho desde feixe de corte e dobra, bem como a deformação de substrato não são levados em accontagem. Considerando que microposts são normalmente feitos de material macio, como polidimetilsiloxano (PDMS) à base de borracha de silicone esses fatores precisam ser incluídos. . Schoen et ai demonstraram a existência de um tal factor de correcção com base na relação do micropost (L / D) e do polímero correspondente coeficiente de Poisson v aspecto 8 É dada a.: <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) Com o t inclinação (v) ser um coeficiente de inclinação que inclui um parâmetro de ajuste = 1,3 como pode ser encontrado no mesmo artigo: <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) Isso significa que a rigidez corrigido de um micropost corr k é o produto da rigidez à flexão pura = k k curvatura e o factor de correcção corrdado por: <img alt="Equação 4" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) Portanto, os cálculos de força da célula deve ser realizada utilizando a variação mais refinada da equação (1) lendo agora: <img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) O impacto da correcção torna-se mais evidente, logo que os valores típicos para dimensões micropost são utilizados. Por exemplo, a 15 mícron de comprimento micropost com uma secção transversal circular e um diâmetro de 5 mm feito de borracha de silicone à base de PDMS leva a um factor de correcção de 0,77 e, por conseguinte, um cálculo não corrigido superestimariam as forças exercidas pelas células 23%. Isso se torna ainda mais grave para microposts com proporções menores. Tradicionalmente, micropost análise de imagem também tem sido baseada na teoria de flexão feixe idealizada. Em 2005, o grupo que foi pioneira no uso de micrmatrizes OPOST publicou um software de análise de imagem adequada para a análise micropost 9 O software exige uma licença de software eo usuário deve tomar três imagens para cada posição.; cada um dos planos superiores e inferiores do micropost em modo de transmissão e outro em modo de fluorescência com a célula corada. Depois de comparar as posições superior e inferior para cada micropost o software determina um campo de força do vetor e calcula os parâmetros relacionados como força por post. Existem outros pacotes de software e os seus princípios de análise são brevemente mencionadas nos artigos correspondentes que os descrevem, mas estes pacotes de software de análise geralmente não estão disponíveis publicamente. 10,11 As matrizes micropost concebidos para forças de células de mapeamento pode ser classificada como sendo uma disposição em micropost ortogonal ou um sextavado, o último dos quais têm a vantagem de todas as aberturas equidistantes entre microposts vizinho. Microposts típicos have uma secção transversal circular e as suas dimensões variam de 1,0 um a 10 um de diâmetro e 2 a 50 um de comprimento. 4 Contudo, microposts com secção transversal elíptica ou quadrado também têm sido relatados. 12,13 O uso de misturas à base de silicone PDMS como material de micropost permite a adição de nanopartículas na mistura. Por exemplo a adição de cobalto nano-hastes permite uma ativação magnética do micropost e, assim, dá um outro grau de liberdade para potenciais projetos experimentais. 14 A maioria dos grupos produzir suas matrizes micropost em substratos rígidos planas como tampa de vidro ou dentro de uma placa de Petri. No entanto, Mann e colaboradores relataram recentemente uma matriz micropost formada sobre uma membrana elástica. 15 Esta permite a aplicação de células alongamento forças para células aderentes ao estudar ao vivo de células subcelular respostas dinâmicas em termos de contratilidade celular. O estab e mais amplamente empregadocido processo para fazer matrizes micropost é baseado em litografia macia, tal como descrito nos protocolos de perspicaz Sniadecki e colegas. 16-18 em processos de salas brancas curtas normalizados são utilizados para gerar as microstruturas no topo de uma pastilha de silício utilizando fotorresistente SU8. Isto é seguido por um processo de cópia, em que a borracha de silicone é lançada sobre as estruturas transferindo-se em moldes. Num segundo passo, estes moldes são utilizados para replicar a microestrutura inicial utilizando borracha de silicone sobre um substrato escolhido. No entanto, apesar da grande e crescente número de publicações relacionadas com a sua aplicação, estabelecendo um processo de fabricação para microposts leva tempo considerável, mesmo para especialistas micro-engenharia; há muitas etapas do processo que exigem otimização e adaptação ao ambiente de laboratório específico e layout micropost para se obter um nível de qualidade aceitável. Micropost matrizes comerciais estão agora disponíveis em um pronto-to-uso (&quot;off-the-shelf&quot;) formato com uma qualidade consistentemente alta. Como tal, são uma alternativa ao processo de fabrico complexo e moroso necessário para a produção no local. Neste trabalho uma matriz micropost comercialmente disponível foi utilizado para o mapeamento forças celulares usando uma imagem de microscopia de campo brilhante único. Mais importante este artigo descreve e documenta um software open-source totalmente funcional chamado MechProfiler, que está disponível para download como material suplementar a este manuscrito. Uma versão mantida activamente do software podem também ser encontradas em http://www.orthobiomech.ethz.ch. A combinação de um ensaio de &quot;off-the-shelf&quot; e um software de análise de código aberto compatível reduz significativamente a barreira de entrada para alcançar experimentos precisos TFM. Os pesquisadores não têm acesso a qualquer instalações de sala limpa ou experiência em desenvolvimento de software pode analisar forças celulares com sucesso. Ele permite que um usuário para se concentrar nas mechanosensitivity saída ensaio ao invés de a tecnologia em si, e faz medições de força de tração disponíveis a uma comunidade mais ampla. Além disso, este é um passo importante para preparar o caminho para triagem automática de matrizes micropost. O software de análise de MechProfiler processa imagens no formato de arquivo TIFF, PNG, BMP e JPG. As imagens podem ser tomadas através de fluorescência, contraste de fase, luz ou microscopia de campo brilhante. O programa autônomo é executado em conjunto com o livre Matlab Compiler Runtime (disponível em: Figura 12) e algoritmos subjacentes permitir o processamento de imagem simplificada, que permite ao usuário processar imagens com células únicas ou múltiplas em cerca de 1 min. Além disso, estas células podem ou ser vivo ou &quot;Fixo&quot;. O software MechProfiler é capaz de aumentar significativamente a análise dos dados de transferência por depender de reprodutibilidade das matrizes qualidade micropost comercial, mais especificamente, o padrão &amp; #8220; não desvia &quot;posição de cada post na matriz pode ser presumido contra uma grade ideal (desvios de fabrico para a grade nas matrizes utilizadas para este estudo foram inferiores a 100 nm). Num curto abre uma selecção de ficheiros de imagem para análise, as culturas-los para a região de interesse, define as mensagens abrangidos pelas células ou que necessita de ser descartado, determina as posições de pós, calcula as deflexões / forças contra a grade ideal, e finalmente salva todos os dados específicos de celulares com a possibilidade de exportação, incluindo a uma planilha de escritório padrão.

<table><tbody><tr><td>Frascos de cultura de células T25</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS-buffer</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Médio DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>FBS América do Sul</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina 100x</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de centrífuga de 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de micropostes pré-revestida com Colágeno I/Fibronectina</td><td>MicroDuits</td><td>MPA-col1/FN</td><td>Dimensões do microposte: &Oslash;=6.4&#160; &micro; m, l = 18,2 &micro; m; grade = 13 &micro; m, kcorr=2.87&#160; nN/&micro; m</td></tr><tr><td>Etanol abs p.A.</td><td>Merck</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>Nunc</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formalina, tamponado neutro 10%</td> <td>Sigma</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>Azul brilhante G-250</td><td>Sigma</td><td>27815</td><td>Azul de Coomassie</td></tr><tr><td>Metanol ACS p.A.</td><td>Merck</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>prato de fundo de vidro</td><td>WillCo Wells BV</td><td>GWSb-3522</td><td>35 mm de diâmetro, abertura 22&nbsp; mm</td></tr><tr><td>T-100 Eclipse</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Microscópio invertido</td></tr><tr><td>D3-L3</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Câmera controler</td></tr><tr><td>DS Fi2</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fácil e precisa mecano-profiling em micropost arrays

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Substratos de cultura de células com micropostes flexíveis integrados permitem que o usuário estude as interações mecânicas entre as células e seus arredores imediatos. Particularmente, as interações célula-substrato são o principal interesse. Hoje, as matrizes de micropós-produção são um método bem caracterizado e estabelecido, com uma ampla gama de aplicações que foram publicadas na última década. No entanto, parece haver uma reserva entre os biólogos para adaptar a técnica devido ao longo e desafiador processo de fabricação de micropostes, juntamente com a falta de software facilmente acessível para analisar imagens de células interagindo com micropostes. 
A leitura de força de microposts é surpreendentemente fácil. Um microposte age como uma mola com a célula idealmente presa em sua ponta. Dependendo do tamanho, uma célula aplica força de seu citoesqueleto através de um ou vários pontos de adesão focal ao microposte, desviando assim o microposte. A quantidade de deflexão se correlaciona diretamente com a força aplicada em direção e em magnitude. O número de micropostes cobertos por uma célula e os padrões de pós-deflexão são característicos e permitem a determinação de valores como força por pino e muitos parâmetros biologicamente relevantes que permitem o "perfil mecânico" dos fenótipos celulares.
Um método conveniente para o mecano-profiling é descrito aqui, combinando a primeira geração de microposts disponíveis comercialmente prontos para uso com um pacote de software desenvolvido internamente que agora está acessível a todos os pesquisadores. Como demonstração de aplicação típica, imagens únicas de células de câncer ósseo foram tiradas em microscopia de campo claro para perfil mecânico de modelos de linha celular de metástase. Essa combinação de sensores de força de tração comerciais e software de código aberto para análise permite, pela primeira vez, uma rápida implementação da técnica de micropós-array em trabalhos de laboratório de rotina feitos por usuários não especialistas. Além disso, um processo de análise robusto e simplificado permite que um usuário analise um grande número de imagens de micropós-produção de maneira altamente eficiente em termos de tempo.

A principal vantagem da técnica descrita reside na sua simplicidade e potencial para integração rápida e eficaz para o trabalho de laboratório de rotina. A combinação de alta qualidade conjuntos de sensores comerciais combinados com software de código aberto fornece informações sobre mecano-sensibilidade que seria de outra forma exige o acesso a instalações de salas limpas e conhecimento em profundidade de análise de imagem e desenvolvimento de software. A figura 1 ilustra o fluxo de trabalho do método ...

Descritos são protocolos para quantificar interações mecânicas entre células aderentes e substratos microestruturados. Essas interações estão intimamente ligadas a comportamentos celulares essenciais, incluindo migração, proliferação, diferenciação e apoptose. Os protocolos apresentam um software de análise de imagem de código aberto chamado MechProfiler, que permite a determinação das forças envolvidas para cada micropost.

Fácil e precisa Mecano-profiling em micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

O objetivo geral desta técnica é obter propriedades mecanobiológicas relevantes de células isoladas individuais, visualizando as forças decorrentes de suas interações características com o substrato celular, por meio de microscopia óptica convencional. O método apresentado é uma tecnologia de plataforma para a mecanobiologia. Ele pode auxiliar na investigação de questões fundamentais na pesquisa do câncer, como o papel da contração celular na metástase de células cancerosas.As principais vantagens da técnica são que ela extrai robustamente informações neurobiológicas com pouca necessidade de treinamento do usuário. É compatível com microscopia de luz convencional e é voltada para alto rendimento. Em terceiro lugar, este método fornece informações sobre as propriedades mecanobiológicas de células humanas de câncer ósseo.Ele também pode ser aplicado a tipos celulares autólogos, como células musculares lisas ou cardiomiócitos. Comece colocando o substrato de vidro de forma que o arranjo de microhastes fique voltado para cima, dentro do poço de uma placa de 12 poços; adicione indiretamente um mililitro de etanol a 99% ao poço, de modo que o substrato fique coberto. Certifique-se de que não haja formação de bolhas durante qualquer etapa de manipulação de líquidos e de que o arranjo de microhastes esteja sempre coberto por uma fina camada de líquido.Em seguida, incubar o arranjo à temperatura ambiente por 20 a 30 segundos antes de adicionar um mililitro de água estéril desionizada na lateral do poço. Após a mistura com o etanol, aspirar aproximadamente um mililitro da solução de etanol do poço e adicionar mais um mililitro de água desionizada. Repetir este processo pelo menos três vezes para umedecer a amostra.Em seguida, substitua a água desionizada no poço por PBS da mesma maneira, adicionando e depois aspirando aproximadamente um mililitro por vez, repetindo o processo três vezes. Em seguida, utilize este mesmo procedimento para substituir o PBS pelo meio. Agora que a matriz está coberta com aproximadamente um mililitro de meio, pipete 25.000 células de interesse em um mililitro de meio para dentro do poço contendo a matriz de micropostes preparada.Em seguida, feche a placa de múltiplas poças e transfira-a para uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Deixe as células aderirem e crescerem sobre os microsuportes por seis a sete horas, observando o processo de adesão. Periodicamente, utilizando um microscópio óptico, aspire o meio da pocilha e lave as células duas vezes com um mililitro de PBS.Certifique-se de aplicar força suave durante a lavagem com PBS para remover os detritos celulares acumulados no arranjo de microsuportes durante a incubação e para destacar as células mortas. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de uma solução de formaldeído tamponada a 3,7% por cinco minutos para fixar as células. Depois, remova a solução de formaldeído e lave o arranjo de microsuportes duas vezes usando um mililitro de água estéril desionizada.Para cada lavagem, cubra as células fixadas com corante azul brilhante Kumasi a 0,05% em 50% água, 40% etanol e 10% ácido acético por cerca de 90 segundos, removendo o excesso de solução de coloração com duas lavagens em um mililitro de água desionizada estéril. Em seguida, adicione um mililitro de água desionizada ao arranjo de microhastes e verifique o resultado da coloração em um microscópio óptico. Comece adicionando dois mililitros de água desionizada a uma placa de Petri com fundo de vidro fino usando um par de pinças, transfira o arranjo de microhastes da placa de 12 poços para a placa de imagem com a microhaste voltada para cima.Em seguida, coloque a placa de Petri de imagem sobre a platina móvel de um microscópio óptico. Se a óptica do microscópio não for corrigida para infinito, gire o anel de compensação da lente utilizada para a aquisição de imagens até que o número na escala represente a espessura total de todos os materiais ao longo do caminho óptico. A seguir, remova quaisquer anéis de contraste de fase do caminho óptico para habilitar o modo de campo claro comum e, então, reduza o diafragma do lado de iluminação para 50%. Alinhe a placa de Petri de modo que os micropostes da matriz formem uma linha horizontal ou vertical ao longo do campo de observação.Defina um ponto inicial no canto superior esquerdo e mova a placa de Petri passo a passo ao longo da platina. Varra o arranjo de micropostes enquanto captura diversas imagens de alta resolução com uma objetiva de 20 x ou 40 x. O objetivo é ter uma única célula no centro de cada imagem em cada nova posição.Varra ao longo dos ZXs desde a base do microposte em direção à ponta do microposte até que a ponta esteja em foco, utilizando a roda de ajuste fino do microscópio. Em seguida, abaixe o plano de foco em dois a três mícrons em direção à base do microposte.Inicie carregando o software mec, o perfilador e uma série de imagens que precisam ser analisadas, clicando em abrir e selecionando as imagens. Em seguida, vá até a seção de configurações e insira os parâmetros conforme orientado no manual do software. Depois, analise as imagens uma por uma.Inicie selecionando o botão de recorte e, em seguida, clique e arraste para formar um contorno retangular ao redor da área de interesse. Ao finalizar, clique duas vezes dentro do retângulo desenhado para concluir a ação. Em seguida, selecione desenhar contorno da célula e use o cursor em forma de cruz para traçar um contorno ao redor de todos os microsuportes cobertos pela célula visível na imagem.Descarte quaisquer micro-posts indesejados clicando para descartar as postagens e use o cursor em forma de mira para desenhar. Em seguida, delimite todos os micro-posts que pertencem a uma célula fora da seção da imagem ou que foram desviados por qualquer outro motivo, mas não pela célula de interesse. Depois, clique em Encontrar OIDs para iniciar a subrotina do software.Ajuste a configuração do filtro ao lado do botão encontrar OIDs até que todos os micro-posts sejam registrados, o que é indicado por uma cruz vermelha em seu centro. Se houver múltiplas posições de micro-posts ou posições perdidas, utilize a função de edição manual clicando em editar manualmente e use a mira do mouse para selecionar o micro-post em questão. Dê um duplo clique dentro do retângulo e coloque uma única marca vermelha na seção ampliada da imagem, que será automaticamente fechada.Encontre a grade de micropostes ideal ativando a função de gerar grade com um clique do mouse. Certifique-se de que a posição corresponda à cabeça real do microposte, indicada por um anel azul dentro da linha de contorno da célula desenhada. Em seguida, corrija quaisquer marcadores de grade deslocados dentro da área da célula, conforme necessário.Usando a função de edição manual correspondente com um clique do mouse, utilize a mira para selecionar a pergunta do micro poste clicando e arrastando-a através da imagem. Dê um duplo clique dentro do retângulo que aparece e posicione o marcador azul corrigido na seção ampliada da imagem, que será fechada automaticamente. Em seguida, clique em calcular deflexões para obter um histograma dos valores de deflexão calculados com base na diferença entre a posição de um micro poste dentro da seção da imagem e a grade ideal gerada.Por fim, salve a análise completa, incluindo as tabelas de valores. Continue a análise de imagem clicando em redefinir visualização para analisar outra seção da imagem ou clique em próxima imagem exibida. A seguir, um exemplo de perfilamento menó de duas linhagens celulares de câncer ósseo: células Q oh nove, que possuem baixo potencial metastático, e as células M 132 altamente metastáticas, cultivadas em um mesmo lote de produção.O resultado mostra que as células Q oh nove tendem a aplicar mais força em seus pontos de fixação do que as células altamente metastáticas, ao categorizar os valores de força. Em relação à área celular, observa-se que a força média por célula é maior para as células huo nove em comparação com as M 132. Além disso, a força média por microsuporte aumenta conforme as células se espalham, até que a força média por suporte atinja um valor mais estável.Além das diferenças morfológicas, as variações podem ser quantificadas com resultados interessantes. Por exemplo, em contraste com as células M 132 altamente metastáticas, que tendem a ocupar menos microsuportes, as células HU oh nine apresentam um perfil mais heterogêneo em termos de cobertura dos microsuportes. Em resumo, o perfil Meno para a linhagem celular parental HU oh nine revela que essas células normalmente cobrem uma área maior e aplicam uma força ligeiramente superior aos microsuportes.Enquanto isso, a linhagem celular metastática M 132 e o tipo celular agressivo caracteristicamente cobrem menos microhastes e aplicam menos força por microhaste. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de pipetar com muito cuidado e nunca diretamente sobre a matriz de microhastes. Evite introduzir bolhas, pois elas levam ao colapso das microhastes.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como extrair informações biológicas de células isoladas individuais utilizando microestruturas em combinação com nosso perfil em malha ou software. Aproveite seus resultados.

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