Método multifuncional, baseado em Micropipeta de Incorporação e estimulação do bacteriana Mechanosensitive canais iônicos em gotículas de interface Bicamadas

O objetivo geral deste procedimento é reconstituir funcionalmente os canais mezcal em uma interface de gotículas, sistema de bicamada, e examinar a resposta desses canais sensíveis ao mecano a estímulos mecânicos harmônicos. Este método permite o estudo da atividade elétrica mecânica do mutante mescal V 23 T em resposta à excitação mecânica harmônica após a reconstituição em uma interface de gotículas por sistema de camadas. A principal vantagem desta técnica é que ela utiliza as vantagens técnicas da técnica de patch clamp e da interface de gotículas por métodos de camada com a capacidade de ser miniaturizada, bem como a capacidade de controlar a composição química de cada lado da membrana.

Para formular lipossomas, prepare 10 mililitros de uma solução lipídica de dois miligramas por mililitro, adicionando 10 mililitros de tampão cloreto de potássio a 20 miligramas de lipídios sintéticos DPHP adquiridos como pó liofilizado. Certifique-se de que os veículos lipídicos e a solução tampão estejam bem misturados. A mistura deve parecer homogênea e turva quando tudo estiver dissolvido.

Congele a mistura a menos 20 graus Celsius agora descongele completamente a nova mistura lipídica, deixando a mistura descongelar à temperatura ambiente e não em um ambiente aquecido. Após um total de seis ciclos de congelamento e descongelamento, use uma extrusora disponível comercialmente para extrudar os lipídios, forçando toda a suspensão lipídica primeiro através de um filtro de membrana de policarbonato de 0,4 mícron e, em seguida, seis vezes através de um filtro de membrana de 0,1 mícron. Este processo produz partículas com diâmetros próximos a 100 nanômetros.

Para fabricar o reservatório de óleo, faça dois furos opostos na parede de um cilindro de acrílico de duas polegadas de diâmetro e 1,5 centímetro de comprimento. Os furos devem ter um milímetro de diâmetro e um centímetro da parte inferior. Em seguida, faça dois furos de quatro milímetros concêntricos aos furos de um milímetro perfurados anteriormente.

As profundidades dos furos devem ser de um milímetro cada. Tome cuidado para não perfurá-los até o fim. Esses furos são feitos para se encaixar nas juntas de borracha.

Coloque e cole duas juntas de borracha com diâmetros internos de um milímetro nos orifícios maiores para evitar vazamento de óleo. Em seguida, cole a máquina ao cilindro em uma folha de acrílico fina de 10 centímetros por 10 centímetros usando qualquer epóxi multiuso no dia do experimento, corte um comprimento de sete centímetros de fios de prata de 2.250 mícrons de diâmetro e, em seguida, mergulhe suas pontas em alvejante por duas horas. Para formar um revestimento de cloreto de prata, uma cor cinza indica que um revestimento de cloreto de prata foi formado.

Usando um cortador de vidro, divida um capilar de vidro de silicato emprestado de 10 centímetros de comprimento de um milímetro de diâmetro externo e aponte 58 milímetros de diâmetro interno em dois capilares de cinco centímetros. Usando uma seringa de um mililitro com uma agulha de ponta romba de calibre 18, encha os capilares com o hidrogel P-E-G-D-M-A para evitar que o hidrogel hidratado inche para fora do capilar. Mantenha uma folga de três milímetros nas pontas e certifique-se de que não haja bolhas de ar nos capilares.

Insira os eletrodos de prata e cloreto de prata nos capilares cheios de hidrogel. Cure o hidrogel P-E-G-D-M-A através da fotopolimerização de radicais livres após a exposição à luz ultravioleta por dois minutos a um watt usando um ponto ultravioleta, o experimento é montado sob uma gaiola de Faraday aterrada a uma conexão de aterramento no amplificador de remendo. Conecte uma das micropipetas a um suporte de microeletrodo reto que tenha um conector macho.

Em seguida, conecte o suporte do microeletrodo ao estágio principal do patch amplifier. Para conectar o estágio principal ao solo, solde um fio de cobre isolado de calibre 18 a um conector apropriado para o estágio principal, monte o estágio principal em um micromanipulador manual de três eixos, primeiro conectando a placa de montagem do estágio principal ao micromanipulador e, em seguida, conectando o estágio principal à placa de montagem. Usando os parafusos apropriados, conecte a segunda micropipeta ao atuador linear por meio de um conector feito em laboratório e, em seguida, monte ambos em um segundo manipulador micrométrico.

As micropipetas devem estar opostas umas às outras, alinhadas e niveladas horizontalmente. Em seguida, em um frasco de vidro, misture 0,1 mililitro dos lipossomas D-P-H-P-C com 0,01 mililitro da solução de lipossomas de protea mescal V 23 T. Usando uma agulha de microenchimento de calibre 34, encha as pontas de ambas as micropipetas com uma solução de proteossomo.

Coloque o reservatório na parte superior de um microscópio vertical e alimente as micropipetas através dos orifícios opostos de um milímetro. Em seguida, encha o reservatório até a superfície com hexadecano para formar as gotículas esféricas na ponta das micropipetas. Use uma terceira micropipeta de vidro de silicato bo de 10 mícrons de diâmetro montada em um manipulador de terceiro micrômetro para dispensar a solução diluída de lipossomas de protea V 23 T mescal nas pontas das micropipetas e formar as gotículas.

Controle o tamanho das gotículas diminuindo ou aumentando o volume conforme desejado e deixe-as descansar por 10 minutos para que as monocamadas se formem completamente. Em seguida, coloque as gotículas em contato por camada. A formação ocorrerá dentro de um a dois minutos.

Depois de configurar o software e o equipamento conforme descrito no protocolo de texto, use um cabo BNC para conectar a saída de um gerador de forma de onda ao interruptor frontal de entrada de comando externo. Envie uma forma de onda triangular de topo de pico de 10 hertz e 500 milivolts para o estágio principal. Usando o manipulador microm.

Mova as micropipetas de vidro horizontalmente para colocar as gotículas em contato até que elas se toquem levemente e espere que ocorra o afinamento da bicamada. A progressão do processo de formação da bicamada pode ser vista visualmente através do microscópio e pode ser monitorada pela medição atual. Ajuste o tamanho da bicamada para cerca de 250 mícrons de diâmetro, controlando a posição da gota montada no atuador usando o manipulador, o tamanho da bicamada pode ser estimado visualmente através do microscópio.

Uma vez que a bicamada tenha se formado e esteja estável, estimule as gotículas enviando um sinal senoidal usando um gerador de funções para estimular a proteína mescal incorporada na bicamada. Envie uma forma de onda senoidal com uma amplitude de pico a pico de 175 mícrons, frequência de 0,2 hertz e ciclo de trabalho de 50% para o controlador de servidor elétrico Pieto. A gravação de corrente atípica em tempo real é mostrada aqui.

A capacitância medida da bicamada aumenta repentinamente, indicando afinamento e formação de bicamadas antes de atingir um estado estacionário. A bicamada pode ser controlada alterando a posição das gotículas quando o DIB é estimulado mecanicamente, mantendo um potencial DC constante através da membrana. O mutante V 23 T do mezcal gera atividades confiáveis, incluindo principalmente estados subcondutores e, ocasionalmente, eventos de abertura total.

O gating ocorre principalmente no pico de compressão, indicando que está relacionado a um aumento na tensão da bicamada, conforme mostrado no gráfico polar. Aqui, destaca-se aqui a capacidade desta técnica de ser utilizada para testar outros tipos de biomoléculas. A etina, que é um canal iônico dependente de tensão, aumenta a permeabilidade da membrana com a aplicação de um potencial transmembrana DC One master.

Essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não quebrar acidentalmente os capilares de vidro ou de outra forma. Você deve reiniciar a configuração e certificar-se de que todos os fios estejam conectados após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de canais ativados por estiramento explorarem novos métodos através dos quais forças externas podem ser transportadas para a porta de canais sensíveis ao mecanismo embutido DIB. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como formar a interface de gotículas por camadas, incorporar canais sensíveis ao mecano nas membranas artificiais e estimular esses canais mecanicamente.