Bacteriana Folha Infiltração Ensaio para Belas Caracterização das respostas de defesa da planta usando o Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Patossistema

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar quantitativamente a resposta imune de Arabidopsis diliana por meio de um ensaio otimizado de infiltração de seringa. Isso é feito usando primeiro a infiltração da seringa para entregar manualmente as bactérias na folha através das aberturas naturais chamadas sada. O segundo passo é obter discos de tecido foliar infectado após o desenvolvimento dos sintomas da doença.

Em seguida, as bactérias são extraídas dos discos foliares por meio de homogeneização de alto rendimento. A etapa final é a diluição em série e manchas em placas de contagem bacteriana para enumerar colônias. Em última análise, o crescimento bacteriano dentro de cada diss foliar pode ser correlacionado à força relativa da resposta imune da planta.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunidade das plantas, como a identificação de genes que contribuem para as respostas de defesa contra o estresse biótico. A principal vantagem desta técnica sobre o método existente é que ela permite a quantificação precisa do crescimento do patógeno no tecido da planta infectada e ajuda a evitar erros experimentais causados pela amostragem de folhas com status de desenvolvimento variado. Este método pode fornecer informações sobre a resposta imune da planta a uma infecção por um patógeno bacteriano virulento e também pode ser aplicado a outros sistemas, como ácido salicílico ou padrões moleculares associados a micróbios desencadeados por respostas imunes.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade em entregar as bactérias na folha sem danos aos tecidos. Demonstrando o seguinte procedimento será pós-doutorando acadêmico hindu e estudantes de pós-graduação shalu e yali. Em breve do meu laboratório, o ensaio para maior suscetibilidade a doenças será demonstrado neste vídeo.

Antes do experimento, prepare as placas de mídia King's B ou KB, faça um litro de meio sólido KB conforme descrito no texto do protocolo e deixe esfriar em uma placa de agitação magnética. Quando o meio é resfriado ao toque a 80% de glicerol, um molar de sulfato de magnésio e estreptomicina no meio, despeje dois tamanhos diferentes de placas de mídia KB. A placa de Petri menor serve como placa de cultura de bactérias primárias e a placa de Petri de estimação maior serve como placa de contagem de bactérias.

Armazene as placas a quatro graus Celsius dois dias antes da sequência do ensaio. PSM ES 43 26. Bactérias de um estoque de glicerol negativo de 80 graus Celsius em uma placa de cultura de bactérias estreptocócicas KB e incubam a 28 graus Celsius por 24 a 48 horas no dia seguinte.

Iniciar a cultura líquida num tubo de ensaio estéril com quatro mililitros de líquido kb contendo 50 microgramas por mililitro de estreptomicina. Agite um 250 RPM a 28 graus Celsius durante a noite. As plantas de Arabidopsis para o experimento são cultivadas sob condições detalhadas no texto do protocolo no mesmo dia em que a cultura bacteriana líquida é iniciada.

Marque as pétalas das folhas número cinco e seis com um marcador rombudo e à prova d'água para facilitar a identificação do tecido infectado na amostragem. Para melhorar a abertura do STA e facilitar a entrada da solução do patógeno na água da folha. As plantas bem, embebendo o apartamento do fundo por 20 minutos.

Após 20 minutos, escorra o excesso de água. A infecção das plantas arabidopsis é realizada. No dia seguinte ao início da cultura líquida.

Transfira a cultura bacteriana para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e gire a 9.600 Gs por dois minutos. À temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet bacteriano com um mililitro de cloreto de magnésio estéril a 10 milimolares dilua a suspensão bacteriana com nove mililitros de cloreto de magnésio a 10 milimolares em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Depois de medir a densidade óptica da bactéria, diluir a bactéria com cloreto de magnésio 10 milimolar até um OD 600 final de 0,0002.

Para o ensaio de infecção por EDS. Uma seringa sem agulha de ponta romba de um mililitro, comumente conhecida como seringa de insulina, é usada para infiltração. Encha a seringa com 0,5 a 0,6 mililitros da solução bacteriana diluída para um controle muito melhor durante o processo de infiltração, não encha a seringa em sua capacidade total.

Exponha a superfície inferior da folha na parte superior do dedo indicador e, com a ajuda do polegar, ajuste suavemente a posição da folha. Posicione a seringa verticalmente contra a superfície da folha para garantir uma distribuição uniforme da pressão para reduzir os danos às folhas. Tente evitar a área da nervura central durante a infiltração.

Empurre lentamente o êmbolo para se infiltrar na solução bacteriana. A entrada de líquido no mesofilo da folha será visualizada conforme indicado pela cor mais escura da folha, infiltrando-se em toda a superfície da folha, mesmo que exija várias tentativas. Quando a infiltração estiver completa, seque suavemente a folha com tecido absorvente para remover a solução extra do patógeno.

Inspecione visualmente o tecido foliar infectado quanto a danos. Deixe as plantas infiltradas secarem por uma a duas horas, devolva as plantas às suas condições originais de crescimento. Pulverize uma cúpula transparente com água e cubra as plantas infectadas por duas horas.

Em seguida, quebre a cúpula para gerar uma abertura de duas a três polegadas e deixe-a ligada durante o restante do experimento de infecção, que geralmente é de três dias. Um dia antes de quantificar o crescimento do patógeno. Seque as placas de mídia KB de 150 milímetros por 15 milímetros.

Seque as placas mantendo-as em temperatura ambiente por cerca de 24 horas. Processe o tecido infectado após o surgimento da esclerose indicada pelo amarelecimento do tecido infectado nos genótipos suscetíveis, mas antes do desenvolvimento de lesões necróticas. Para cada genótipo, prepare seis tubos de moagem.

Coloque uma bola de moagem de aço inoxidável e adicione 500 microlitros de cloreto de magnésio estéril de 10 milimolares em cada tubo. Em seguida, separe a folha infectada da planta e perfure um disco de folha com um furador de papel de um furo usando uma pinça aleatoriamente, coloque dois discos de folhas de duas plantas diferentes em cada tubo de moagem. Sele os tubos, homogeneize o tecido com um homogeneizador de alto rendimento na velocidade máxima por 10 minutos.

Repita esse processo, se necessário, até que o tecido esteja bem homogeneizado e as soluções fiquem verdes devido à liberação de clorofila das folhas infectadas enquanto espera. Para a homogeneização, preencha cada poço nas primeiras seis fileiras de uma placa de cultura de 96 poços com 180 microlitros de cloreto de magnésio 10 milimolares. Transfira 20 microlitros da suspensão de tecido moído para cada poço da primeira fileira da placa de 96 poços e misture pipetando repetidamente o líquido para cima e para baixo.

Se pequenos fragmentos de tecido obstruírem a ponta, corte-a em dois a três milímetros para ajudar a adquirir o volume correto da solução para fornecer espaço suficiente para a gotícula no topo da placa espaçar o tecido de diferentes genótipos em fileiras alternativas. Para preparar uma diluição em série de dez vezes, transfira 20 microlitros de suspensão de tecido para a segunda linha e repita esse procedimento até a sexta diluição. Usando pontas de pipeta divididas, transfira 20 microlitros da solução da placa de parede 96 para a placa KB de 150 milímetros por 15 milímetros.

Trabalhe da suspensão mais diluída para a mais concentrada, por isso não é necessário trocar as pontas da pipeta entre a diluição. Seque o prato em temperatura ambiente com a tampa rachada. Quando não for observado mais líquido na superfície da placa, feche a tampa invertida e incube a placa à temperatura ambiente.

Incube as placas por 40 a 60 horas até que as colônias se tornem visíveis. Confirme se as bactérias nas placas refletem o previsível dez vezes. Queda nas unidades formadoras de colônias.

Conte as bactérias antes que elas cresçam demais e as colônias se fundam. Determinar o número de bactérias na diluição mais baixa que não tem colónias sobrepostas. Normalmente, a diluição preferida a ser contada conterá entre 10 e 50 colônias, podendo variar entre réplicas técnicas.

Para calcular os níveis de proliferação bacteriana, determinar o número de unidades formadoras de colónias por disco foliar utilizando esta fórmula, em que R é o número da linha e T é o número de bactérias em cada replicado técnico. Os dados são então usados para produzir um gráfico. Cada ponto de dados é representado como a média de seis réplicas técnicas em uma escala logarítmica.

Os aerobars representam o intervalo de confiança de 95% da doença aumentada média. A suscetibilidade contra P-S-M-E-S 43 26 foi avaliada pela infecção com um inóculo com OD 600 de 0,0002. Os resultados mostram que os mutantes NPR one dash one altamente suscetíveis têm aproximadamente 2,5 log ou 300 vezes mais crescimento de patógenos em comparação com as plantas Columbia zero do tipo selvagem.

O ensaio de infiltração da seringa pode ser modificado para avaliar diferentes camadas da resposta imune. Para avaliar a imunidade desencadeada pelo ácido salicílico, a aplicação externa de salicilato de sódio é usada para desencadear a resposta imune, que é quantificada pelo crescimento do patógeno. A perda de NPR R um, que funciona como o receptor de ácido salicílico e principal co-regulação transcricional de genes-alvo dependentes de ácido salicílico, leva à insensibilidade à aplicação exógena do derivado do ácido salicílico.

Para caracterizar a imunidade desencadeada por padrão molecular associado a micróbios, as plantas foram pré-tratadas com dois gatilhos conhecidos. FLAG 22 e L 18, as plantas selvagens Columbia zero tratadas com FLAG 22 suportaram uma redução de um log ou 10 vezes na população bacteriana, enquanto as duas plantas mutantes FLS não conseguiram desencadear o efeito de restrição do crescimento bacteriano. Da mesma forma, as plantas mutantes EFR foram insensíveis ao pré-tratamento com L 18.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar a resposta imune da ópsia arábica por meio do ensaio de infiltração da seringa. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de monitorar o desenvolvimento da doença e coletar amostras do tecido após o surgimento da corse. A pseudomona pather cul cola S phos 3, 2 6 é um patógeno hemiatrófico.

Assim, a amostragem deve ser realizada antes da transição para o estágio neurotrófico. Após este procedimento, outros métodos, como PCR quantitativo em tempo real e análise de sangue ocidental, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como qual via de sinalização imunológica específica é perturbada. Não se esqueça de que você está trabalhando com bactérias vivas.

Embora Pseudomona Senge não seja patogênico em humanos, lembre-se de descartar adequadamente os consumíveis contaminados e as plantas infectadas durante a execução deste procedimento.