Bacteriana Folha Infiltração Ensaio para Belas Caracterização das respostas de defesa da planta usando o

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar quantitativamente a resposta imune de Arabidopsis diliana por meio de um ensaio otimizado de infiltração com seringa. Isso é realizado primeiramente utilizando a infiltração com seringa para entregar manualmente bactérias na folha através das aberturas naturais chamadas sada. O segundo passo é obter discos de tecido foliar infectado após o desenvolvimento dos sintomas da doença.

Em seguida, as bactérias são extraídas dos discos foliares por meio de homogeneização de alto rendimento. O passo final é a diluição em série e semeadura em placas de contagem bacteriana para enumeração de colônias. Em última análise, o crescimento bacteriano em cada disco foliar pode ser correlacionado à intensidade relativa da resposta imune da planta.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunidade vegetal, como a identificação de genes que contribuem para as respostas de defesa contra estresses bióticos. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela permite a quantificação precisa do crescimento do patógeno no tecido vegetal infectado e ajuda a evitar erros experimentais causados pela amostragem de folhas com estados de desenvolvimento variados. Este método pode fornecer informações sobre a resposta imunológica da planta a uma infecção por um patógeno bacteriano virulento, e também pode ser aplicado a outros sistemas, como respostas imunológicas induzidas por ácido salicílico ou por padrões moleculares associados a micróbios.

De modo geral, indivíduos novos neste método terão dificuldade em introduzir as bactérias na folha sem causar danos ao tecido. O procedimento a seguir será demonstrado pela pesquisadora pós-doutoranda Hindu e pelas estudantes de pós-graduação Shalu e Yali. Em breve, do meu laboratório, o ensaio para susceptibilidade aumentada a doenças será demonstrado neste vídeo.

Antes do experimento, prepare placas de meio King's B ou KB; faça um litro do meio sólido KB conforme descrito no texto do protocolo e deixe esfriar em uma placa de agitação magnética. Quando o meio estiver frio ao toque, adicione glicerol a 80%, sulfato de magnésio um molar e estreptomicina ao meio e despeje em dois tamanhos diferentes de placas de meio KB. O recipiente de Petri menor serve como placa primária de cultura bacteriana e o recipiente de Petri maior serve como placa de contagem bacteriana.

Armazene as placas a quatro graus Celsius dois dias antes do streak do ensaio. PSM ES 43 26. Bactérias de um estoque glicerinado a menos 80 graus Celsius em uma placa de cultura bacteriana KB com estreptomicina e incube a 28 graus Celsius por 24 a 48 horas no dia seguinte.

Inicie o cultivo líquido em um tubo de ensaio estéril com quatro mililitros de meio líquido KB contendo 50 microgramas por mililitro de estreptomicina. Agite a 250 RPM a 28 graus Celsius durante a noite. As plantas de Arabidopsis para o experimento são cultivadas em condições detalhadas no texto do protocolo no mesmo dia em que o cultivo bacteriano líquido é iniciado.

Marque as pétalas das folhas número cinco e seis com uma caneta impermeável e ponta grossa para facilitar a identificação do tecido infectado durante a coleta. Para melhorar a abertura de STA e facilitar a entrada da solução do patógeno na água da folha. Umedeça bem as plantas mergulhando a bandeja pela parte inferior por 20 minutos.

Após 20 minutos, drenar a água em excesso. A infecção das plantas de arábide é realizada no dia seguinte ao início do cultivo líquido.

Transfira a cultura bacteriana para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue a 9.600 ×g por dois minutos. À temperatura ambiente, descarte o sobrenatante e ressuspenda o pellet bacteriano com um mililitro de cloreto de magnésio estéril 10 milimolar; dilua a suspensão bacteriana com nove mililitros de cloreto de magnésio 10 milimolar em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Após medir a densidade óptica das bactérias, dilua-as com cloreto de magnésio 10 milimolar até uma densidade óptica final (OD 600) de 0,0002.

Para o ensaio de infecção por EDS. Uma seringa de um mililitro com ponta romba e sem agulha, comumente conhecida como seringa de insulina, é usada para a infiltração. Encha a seringa com 0,5 a 0,6 mililitros da solução bacteriana diluída para um controle muito melhor durante o processo de infiltração; não encha a seringa até sua capacidade total.

Exponha a superfície inferior da folha sobre a parte superior do dedo indicador e, com a ajuda do polegar, ajuste suavemente a posição da folha. Posicione a seringa verticalmente contra a superfície da folha para garantir uma distribuição uniforme da pressão e reduzir danos à folha. Tente evitar a região da nervura central durante a infiltração.

Empurre lentamente o êmbolo para infiltrar a solução bacteriana. A entrada do líquido no mesófilo da folha será visualizada por meio da coloração mais escura da folha; infiltre toda a superfície da folha, mesmo que sejam necessativas várias tentativas. Após a conclusão da infiltração, seque suavemente a folha com papel absorvente para remover a solução excedente do patógeno.

Inspecione visualmente o tecido foliar infectado em busca de danos. Deixe as plantas infiltradas secarem por uma a duas horas e retorne as plantas às suas condições originais de crescimento. Pulverize com água uma cúpula transparente e cubra as plantas infectadas por duas horas.

Em seguida, quebre a tampa para gerar uma abertura de dois a três centímetros e mantenha-a aberta durante o restante do experimento de infecção, que geralmente dura três dias. Um dia antes de quantificar o crescimento do patógeno, pré-seque as placas de meio KB de 150 milímetros por 15 milímetros.

Seque as placas mantendo-as à temperatura ambiente por cerca de 24 horas. Processe o tecido infectado após o surgimento de esclerose, indicado pelo amarelecimento do tecido infectado nos genótipos suscetíveis, mas antes do desenvolvimento de lesões necróticas. Para cada genótipo, prepare seis tubos de moagem.

Coloque uma esfera de moagem de aço inoxidável e adicione 500 microlitros de cloreto de magnésio estéril 10 milimolar em cada tubo. Em seguida, retire a folha infectada da planta e retire um disco foliar com um furador de papel de um furo usando pinça de forma aleatória, colocando dois discos foliares de duas plantas diferentes em cada tubo de moagem. Feche os tubos e homogeneíze o tecido com um homogeneizador de alto rendimento na velocidade máxima por 10 minutos.

Repita este processo, se necessário, até que o tecido esteja bem homogeneizado e as soluções fiquem verdes devido à liberação de clorofila das folhas infectadas durante a espera. Para a homogeneização, preencha cada poço nas primeiras seis linhas de uma placa de cultura de 96 poços com 180 microlitros de cloreto de magnésio 10 milimolar. Transfira 20 microlitros da suspensão de tecido moído para cada poço da primeira linha da placa de 96 poços e misture pipetando o líquido para cima e para baixo repetidamente.

Se pequenos fragmentos de tecido entupirem a ponta, corte-a em dois a três milímetros para ajudar a adquirir o volume correto da solução, fornecendo espaço suficiente para a gota na parte superior da placa; posicione o tecido de genótipos diferentes em fileiras alternadas. Para preparar uma diluição seriada de dez vezes, transfira 20 microlitros da suspensão de tecido para a segunda fileira e repita este procedimento até a sexta diluição. Usando ponteiras divididas, transfira 20 microlitros da solução da placa de 96 poços para a placa KB de 150 milímetros por 15 milímetros.

Trabalhe a partir da suspensão mais diluída até a mais concentrada, para que não seja necessário trocar as ponteiras da pipeta entre as diluições. Seque a placa em temperatura ambiente com a tampa entreaberta. Assim que não for mais possível observar líquido na superfície da placa, feche a tampa, inverta e incube a placa em temperatura ambiente.

Incube as placas por 40 a 60 horas até que as colônias fiquem visíveis. Confirme que as bactérias nas placas reflitam a redução previsível na ordem de dez vezes nas unidades formadoras de colônia.

Conte as bactérias antes que elas supercresçam e as colônias se fundam. Determine o número de bactérias na menor diluição que não apresenta colônias sobrepostas. Geralmente, a diluição preferida para contagem conterá entre 10 e 50 colônias, e pode variar entre réplicas técnicas.

Para calcular os níveis de proliferação bacteriana, determine o número de unidades formadoras de colônia por disco foliar utilizando esta fórmula, em que R é o número da linha e T é o número de bactérias em cada réplica técnica. Os dados são então utilizados para produzir um gráfico. Cada ponto de dado é representado como a média de seis réplicas técnicas em uma escala logarítmica.

As barras de erro representam o intervalo de confiança de 95% da média da doença agravada. A suscetibilidade contra P-S-M-E-S 43 26 foi avaliada por infecção com um inóculo com uma OD 600 de 0,0002. Os resultados mostram que os mutantes NPR um traço um altamente suscetíveis apresentam aproximadamente 2,5 log ou 300 vezes mais crescimento do patógeno em comparação com as plantas do tipo selvagem Columbia zero.

O ensaio de infiltração com seringa pode ser modificado para avaliar diferentes camadas da resposta imune. Para avaliar a imunidade induzida pelo ácido salicílico, aplica-se externamente salicilato de sódio para desencadear a resposta imune, a qual é quantificada pelo crescimento do patógeno. A perda de NPR1, que atua como receptor do ácido salicílico e principal co-regulador transcricional de genes-alvo dependentes de ácido salicílico, leva à insensibilidade à aplicação exógena do derivado do ácido salicílico.

Para caracterizar a imunidade desencadeada por padrões moleculares associados a micróbios, as plantas foram previamente tratadas com dois indutores conhecidos. As plantas selvagens do tipo Columbia zero tratadas com FLAG 22 apresentaram uma redução de um log, ou seja, 10 vezes menor, na população bacteriana, enquanto as plantas mutantes FLS dois não conseguiram desencadear o efeito de restrição do crescimento bacteriano. De maneira semelhante, as plantas mutantes EFR foram insensíveis ao pré-tratamento com L 18.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar a resposta imune de Arabidopsis por meio do ensaio de infiltração com seringa. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de monitorar o desenvolvimento da doença e coletar o tecido após o surgimento das lesões. O Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 é um patógeno hemibiotrófico.

Assim, a coleta de amostras deve ser realizada antes da transição para a fase neurotrófica. Após este procedimento, outros métodos, como PCR quantitativa em tempo real e análise sanguínea ocidental, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como qual via de sinalização imune específica está alterada. Não se esqueça de que você está trabalhando com bactérias vivas.

Embora o Pseudomona Senge não seja patogênico para humanos, lembre-se de descartar adequadamente os materiais descartáveis contaminados e as plantas infectadas durante a realização deste procedimento.