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Developmental Biology

Uma Introdução ao Envelhecimento e regeneração

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Developmental Biology

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JoVE Science Education Developmental Biology

An Introduction to Aging and Regeneration

2.12: Transplantation Studies

2.14: Invertebrate Lifespan Quantification

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09:14 min

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April 30, 2023

Overview

Os tecidos são mantidos através de um equilíbrio de envelhecimento celular e regeneração. O envelhecimento refere-se à perda gradual da função celular, e a regeneração é o reparo do tecido danificado geralmente mediado por células-tronco adultas ou somáticas pré-existentes. Os cientistas estão interessados em entender os mecanismos biológicos por trás desses dois processos complexos. Ao fazer isso, os pesquisadores podem ser capazes de usar células-tronco somáticas para tratar doenças degenerativas e desenvolver terapias que possam retardar os efeitos do envelhecimento.

Neste vídeo, fornecemos uma breve história do campo do envelhecimento e regeneração, abordando observações feitas na Grécia antiga, bem como experimentos modernos. Algumas das perguntas que estão sendo feitas neste campo, e os métodos proeminentes que estão sendo usados pelos biólogos para respondê-las, são então exploradas. Finalmente, analisamos alguns experimentos específicos que estão sendo realizados nos laboratórios de pesquisa de envelhecimento e regeneração de hoje.

Procedure

Biólogos no campo do envelhecimento e regeneração visam compreender os mecanismos desses dois processos complexos que estão implicados na manutenção da homeostase tecidual.

O envelhecimento, ou “senescência”, envolve deterioração da morfologia celular e perda de funções ao longo do tempo, enquanto a regeneração refere-se à substituição de células envelhecidas ou danificadas. Os tecidos em nossos corpos são mantidos em um delicado equilíbrio entre senescência e regeneração. Embora a maioria dos nossos tecidos tenham uma vida útil finita, alguns deles têm a capacidade de se regenerar totalmente após uma lesão.

Este vídeo discutirá brevemente a história, destacando as principais descobertas no campo, algumas das questões importantes que estão sendo investigadas atualmente, alguns ensaios sendo usados para responder a essas perguntas, e algumas aplicações laboratoriais específicas desses conceitos.

Antes de falar sobre os experimentos atuais que estão sendo conduzidos, vamos dar uma olhada em algumas das descobertas importantes na história da pesquisa de envelhecimento e regeneração.

As primeiras observações de regeneração tecidual ocorreram por volta de 350 A.C., quando Aristóteles notou que os lagartos foram capazes de regenerar suas caudas depois de terem sido cortados.

No século XVIII, a regeneração tecidual tornou-se um tema quente de pesquisa, e três cientistas – R. A. Ferchault de Réaumur, Abraham Trembley e Lazzaro Spallanzani realizaram de forma independente estudos detalhados de regeneração tecidual em lagostim, hidra e newts, respectivamente.

Os principais cientistas ficaram menos interessados no fenômeno de regeneração ao longo do século seguinte, mas no início dos anos 1900 o interesse começou a se acumular no campo relacionado ao envelhecimento. Alexis Carrel, cirurgiã e bióloga francesa, sugeriu que as células cultivadas na cultura eram imortais e podiam se dividir indefinidamente. No entanto, outros cientistas não conseguiram replicar suas afirmações.

Em 1961, Leonard Hayflick e Paul Moorhead demonstraram que, ao contrário do que Carrel alegou, células normais cultivadas na cultura passam por divisão por um número finito de vezes, cerca de 40 a 60, após a qual entram na fase de senescência. Este fenômeno de divisão celular limitada ficou conhecido como o “limite hayflick”.

Os primeiros indícios de um mecanismo para esse limite vieram em 1973, quando o biólogo soviético Alexey Olovnikov reconheceu que a máquina de replicação de DNA não poderia replicar totalmente as extremidades dos cromossomos, chamados telômeros. Ele previu a existência de um mecanismo para manter o comprimento do telômero em células saudáveis e cancerosas.

Mais tarde, em 1984, Elizabeth Blackburn, Carol Greider e Jack Szostak descobriram que este mecanismo envolvia uma enzima chamada telomerase. Eles demonstraram que a telomerase é responsável pela adição de sequências repetitivas à extremidade 3′ do cromossomo, o que permitiria então que a polimerase de DNA replicasse totalmente as extremidades do cromossomo. Blackburn, Greider e Szostak compartilharam o Prêmio Nobel por essa descoberta em 2009.

Agora que revisamos algumas das descobertas relacionadas ao envelhecimento e à regeneração, vamos olhar para algumas perguntas-chave que estão sendo feitas no campo hoje.

Uma questão importante que está sendo investigada é: como as células envelhecem? Uma teoria predominante do envelhecimento celular é chamada de Teoria Radical Livre. A ideia é que, quando organelas celulares chamadas mitocôndrias realizem respiração oxidativa, subprodutos conhecidos como espécies de oxigênio reativo, ou ROS, são formados. A superprodução dessas moléculas induz o estresse oxidativo, que altera a função das organelas, como as próprias mitocôndrias e o ânticulo endoplasmático, e também pode causar danos ao DNA nuclear. Os cientistas estão interessados em descobrir os mecanismos por trás dessas ocorrências.

Outra pergunta que está sendo feita é: quais são os fatores fisiológicos e ambientais que afetam a vida útil de um organismo? Alguns pesquisadores buscam analisar os efeitos das mudanças ambientais, por exemplo, a restrição calórica, na vida útil de um organismo. Outros pesquisadores estão interessados em identificar genes e vias bioquímicas que regulam o processo de envelhecimento.

Finalmente, os cientistas também estão tentando entender como os tecidos sofrem regeneração espontânea após lesões. Células especiais conhecidas como células-tronco adultas têm sido consideradas instrumentais nesse processo, e alguns pesquisadores estão curiosos sobre a dinâmica dessas células após a lesão. Do ponto de vista clínico, os cientistas estão interessados em investigar como essas células podem ser empregadas em terapias para distúrbios degenerativos.

Agora que você conhece algumas das perguntas que estão sendo feitas no campo, vamos olhar para diferentes ferramentas de pesquisa que os cientistas empregam para responder a essas perguntas.

Uma das formas de medir a idade das células é determinando o comprimento do telômero e a atividade de telomerase. Ambos os parâmetros podem ser medidos usando reação em cadeia de polimerase, ou PCR.

Os cientistas também examinam os marcadores estabelecidos de células senescentes, como β-galactosidase. Isso pode ser feito manchando as células usando ensaios bioquímicos e observando-as sob o microscópio.

Para examinar os fatores que afetam a vida útil do organismo, os cientistas frequentemente usam organismos modelos invertebrados, como vermes ou moscas. As vantagens com esses modelos organismos são seus tempos de geração relativamente curtos, e sua capacidade de ser cultivado em configurações de laboratório simples. Além disso, as manipulações genéticas podem ser facilmente realizadas nesses organismos, que ajudam os cientistas a examinar os papéis dos genes no processo de envelhecimento e longevidade.

Finalmente, o papel das células-tronco adultas na regeneração tecidual pode ser estudado usando várias abordagens. Por exemplo, os cientistas podem rotular células-tronco adultas no tecido alvo com marcadores específicos, que lhes permitem rastrear essas células à medida que o tecido se regenera. Às vezes, os pesquisadores injetam diretamente essas células-tronco multipotentes no tecido danificado para estudar seu papel na reparação após lesões.

Uma vez que você agora conhece alguns dos métodos usados no campo do envelhecimento e regeneração tecidual, vamos olhar para algumas aplicações específicas desses métodos.

A lombriga Caenorhabditis elegans tem sido usada como uma plataforma de triagem para identificar mutações genéticas que podem prolongar a vida útil. Aqui, após a sincronização da idade com a ajuda de um protocolo cronometrado de colocação de ovos, os cientistas analisaram o efeito de uma mutação genética na vida útil de um organismo.

Para estudar os mecanismos de regeneração tecidual, existem muitos modelos que envolvem lesões iniciais seguidas da análise de mecanismos regenerativos. Neste exemplo, os cientistas examinaram a regeneração tecidual após a ablação da linha lateral, um componente sensorial chave do sistema nervoso periférico de zebrafish.

Para induzir a ablação, os cientistas trataram peixes com gentamicina. Após o tempo de recuperação designado, os peixes foram despejados na solução de corante vital fluorescente, que mancha as células-tronco neurais. Essas células manchadas foram então quantificadas usando microscopia de fluorescência.

Por fim, os pesquisadores frequentemente injetam células-tronco adultas para induzir a reparação de tecido danificado. Aqui, os cientistas usaram células-tronco multipotentes para induzir a regeneração de tecidos musculares danificados. Para isso, os cientistas geraram modelos de camundongos com músculos danificados do membro traseiro. Em seguida, células-tronco multipotentes foram injetadas diretamente nos músculos danificados. Após a injeção, as células tiveram tempo para proliferar e diferenciar, e sua contribuição para a amenização funcional foi analisada.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE ao campo do envelhecimento e regeneração. Este vídeo analisou destaques históricos do campo, algumas perguntas-chave sendo feitas por biólogos, alguns ensaios proeminentes sendo usados para responder a essas perguntas, e experimentos atuais sendo conduzidos para entender a biologia da senescência e regeneração. Como sempre, obrigado por assistir!

Transcript

Biologists in the field of aging and regeneration aim to understand the mechanisms of these two complex processes that are implicated in maintenance of tissue homeostasis.

Aging, or “senescence,” involves deterioration of cell morphology and loss of functions over time, whereas regeneration refers to replacement of aged or damaged cells. The tissues in our bodies are maintained in a delicate balance between senescence and regeneration. Although most of our tissues have a finite lifespan, some of them do have the capacity to fully regenerate following an injury.

This video will briefly discuss the history, highlighting the key discoveries in the field, some of the important questions that are currently being investigated, some assays being used to answer these questions, and a few specific laboratory applications of these concepts.

Before talking about the current experiments being conducted, let’s take a look at some of the important discoveries in the history of aging and regeneration research.

The first observations of tissue regeneration occurred around 350 B.C., when Aristotle noted that lizards were able to regenerate their tails after they’d been severed.

In the 18th century, tissue regeneration became a hot topic of research, and three scientists – R. A. Ferchault de Réaumur, Abraham Trembley, and Lazzaro Spallanzani-independently carried out detailed tissue regeneration studies in crayfish, hydra, and newts, respectively.

Mainstream scientist became less interested in the regeneration phenomenon over the next century, but in the early 1900s interest started to buildup in the related field of aging. Alexis Carrel, a French surgeon and biologist, suggested that cells grown in culture were immortal and could divide indefinitely. However, other scientists could not replicate his claims.

In 1961, Leonard Hayflick and Paul Moorhead demonstrated that, contrary to what Carrel claimed, normal cells grown in culture undergo division for a finite number of times, about 40 to 60, after which they enter the senescence phase. This phenomenon of limited cell division became known as the “Hayflick limit.”

The first hints of a mechanism for this limit came in 1973, when Soviet biologist Alexey Olovnikov recognized that the DNA replication machinery couldn’t fully replicate the ends of chromosomes, called telomeres. He predicted the existence of a mechanism to maintain telomere length in healthy and cancer cells.

Later in 1984, Elizabeth Blackburn, Carol Greider, and Jack Szostak discovered that this mechanism involved an enzyme called telomerase. They demonstrated that telomerase is responsible for addition of repetitive sequences to the 3′ end of the chromosome, which would then allow DNA polymerase to fully replicate the chromosome ends. Blackburn, Greider, and Szostak shared the Nobel Prize for this discovery in 2009.

Now that we have reviewed some of the discoveries related to aging and regeneration, let’s look at a few key questions being asked in the field today.

One important question being investigated is: how do cells age? A prevailing theory of cell aging is called the Free Radical Theory. The idea is that, when cell organelles called mitochondria carry out oxidative respiration, byproducts known as reactive oxygen species, or ROS, are formed. Overproduction of these molecules induces oxidative stress, which alters the function of organelles, such as the mitochondria themselves and the endoplasmic reticulum, and can also cause damage to the nuclear DNA. Scientists are interested in discovering the mechanisms behind these occurrences.

Another question that’s being asked is: what are the physiological and environmental factors affecting an organism’s lifespan? Some researchers seek to analyze the effects of environmental changes, for example caloric restriction, on an organism’s lifespan. Other researchers are interested in identifying genes and biochemical pathways that regulate the process of aging.

Finally, scientists are also trying to understand how tissues undergo spontaneous regeneration following injury. Special cells known as adult stem cells have been found to be instrumental in this process, and some researchers are curious about the dynamics of these cells following injury. From a clinical perspective, scientists are interested in investigating how these cells can be employed in therapies for degenerative disorders.

Now that you know some of the questions being asked in the field, let’s look at different research tools that scientists employ to answer these questions.

One of the ways to measure cells’ age is by determining the telomere length and telomerase activity. Both these parameters can be measured using polymerase chain reaction, or PCR.

Scientists also examine the established markers of senescent cells, like β-galactosidase. This can be done by staining the cells using biochemical assays and observing them under the microscope.

For examining the factors affecting organism’s lifespan, scientists often use invertebrate model organisms, such as worms or flies. The advantages with these models organisms are their relatively short generation times, and their ability to be grown in simple laboratory setups. In addition, genetic manipulations can be easily performed in these organisms, which help scientists to examine the roles of genes in the process of aging and longevity.

Finally, the role of adult stem cells in tissue regeneration can be studied using several approaches. For example, scientists can label adult stem cells in the target tissue with specific markers, which enable them to trace these cells as tissue regenerates. Sometimes, researchers directly inject these multipotent stem cells into the damaged tissue to study their role in repair following injury.

Since you now know some of the methods used in the field of aging and tissue regeneration, let’s look at a few specific applications of these methods.

The roundworm Caenorhabditis elegans has been used as a screening platform to identify gene mutations that can prolong lifespan. Here, after age synchronization with the help of a timed egg-laying protocol, scientists analyzed the effect of a gene mutation on an organism’s lifespan.

To study the mechanisms of tissue regeneration, many models are available that involve initial injury followed by analysis of regenerative mechanisms. In this example, scientists examined tissue regeneration following ablation of the lateral line, a key sensory component of the zebrafish peripheral nervous system.

In order to induce ablation, scientists treated fish with gentamicin. After the designated recovery time, the fish were poured into the fluorescent vital dye solution, which stains the neural stem cells. These stained cells were then quantified using fluorescence microscopy.

Lastly, researchers often inject adult stem cells to induce repair of damaged tissue. Here, scientists used multipotent stem cells to induce regeneration of damaged muscle tissues. In order to do that, scientists generated mouse models with damaged hind limb muscles. Then, multipotent stem cells were injected directly into the damaged muscles. Following injection, the cells were given time to proliferate and differentiate, and their contribution to functional amelioration was analyzed.

You’ve just watched JoVE’s introduction to the field of aging and regeneration. This video reviewed historical highlights of the field, some key questions being asked by biologists, a few prominent assays being used to answer those questions, and current experiments being conducted to understand the biology of senescence and regeneration. As always, thanks for watching!

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