Name: Um método para Lineage Tracing de células da córnea Usando Multi-cor repórter fluorescente Mice (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda o método de rastreamento de linhagem celular na córnea usando camundongos R26R-Confetti fluorescentes multicoloridos. Esta técnica permite estudar dinâmicas de células-tronco epiteliais em regeneração tecidual.

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A RSF recebeu financiamento do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013]) sob o acordo de subvenção n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, bem como da Israeli Science Foundation (218/14).

Declaração de Ética: Neste estudo cuidados com os animais e uso foram conformados com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research. Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética local. 1. Escolha um Cre-recombinase adequados Expressando Rato Strain <ol><li> Fora da grande variedade de linhas transgénicas Cre disponíveis para aquisição 26 e, dependendo do tecido alvo a ser investigado, escolher um ratinho transgénico Cre estirpe em que o gene da recombinase Cre é controlado por um promotor que é específico para o tecido de interesse. Em caso é necessário controle temporal, escolher uma linha de Cre induzível. Nota: Nós escolhemos o tamoxifeno induzível transgene K14-Cre ERT para rotular especificamente células-tronco / progenitoras epiteliais do limbo e córnea 24. Note-se que pode haver diferenças entre as linhagens, como Di Girolamo e colegas de trabalho relataram especificidade de limbo sem expressão da córnea para o seu K14-Cre ERT 22. Uma vantagem de usar indutíveis ratinhos transgénicos Cre é que ele permite a indução da linhagem rastreio em intervalos de tempo versáteis. </li></ol> 2. Escolha um Adequado Br Rato Strain <ol><li> Escolha a cassete Br apropriado, dependendo da pergunta de pesquisa e disponível Cre linha 16,18,20. <ol><li> Se um não-indutível Cre rato estirpe é utilizado, escolha uma cassete Br que não permite contínuas de DNA inversões / excisões e, assim, dar origem a produtos sem saída (por exemplo Br1.0 ou BR1.1) 16. </li></ol></li></ol> 3. Cruze os transgênicos Linhas de interesse <ol><li> Para o protocolo mostrado aqui, atravesse a homozigoto R26R-Confetti estirpe (Br2.1 / Br2.1) com o homozigoto Cre ERT estirpe (ERT Cre / Cre ERT) para obter descendentes hemizigóticas (Br2.1 / +; Cre / +) que estão prontos para rastreamento como todos eles contêm um único alelo Br2.1 mono-allelic linhagem e umalelo Cre único. Nota: Para aumentar a eficiência de marcação, pode-se gerar ratinhos que contêm dois alelos Cre (Br2.1 / +; Cre / Cre), enquanto dois alelos Br2.1 (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) seria aumentar combinações de cor (tal como detalhado em 22). </li></ol> 4. Indução recombinase Cre Nota: A administração de tamoxifeno nestas experiências foi efectuada por injecção intraperitoneal diária, para a duração de 3-4 dias, de modo a induzir a translocação da recombinase Cre ERT para o núcleo de limbo e córnea haste basal K14-positiva / progenitoras células epiteliais. O protocolo seguinte pode ser utilizado para a injecção de quatro ratinhos. Alternativamente, a aplicação tópica de Tamoxifen à superfície ocular produz uma eficiência mais elevada. A solução Tamoxifeno pode ser mantida no escuro a 4 ° C durante até uma semana. Aquece-se a solução antes de usar. <ol><li> Pesar 100 mg de Tamoxifeno e dissolvê-la em 5 mL de óleo de milho aosformar um / ml solução tamoxifeno 20 mg. </li><li> Injectar 200 ul de solução de tamoxifeno (4 mg) por via intraperitoneal a 8 semanas de idade os ratinhos durante 3-4 dias consecutivos. Nota: A solução de tamoxifeno pode ser mantida no escuro a 4 ° C durante até uma semana. Aquece-se a solução antes de usar. </li><li> Para aplicação tópica: pesar 60 mg de Tamoxifeno e dissolvê-lo em 1 ml de óleo de milho de modo a formar uma solução / ml de tamoxifeno 60 mg. Vortex e definir a solução num banho de água com agitação mantido a 65 ° C até que se torne evidente que Deixar no banho até à sua utilização. <ol><li> Aplicam-se cuidadosamente 100 ul da solução de tamoxifeno para cada superfície ocular do rato. </li></ol></li></ol> 5. Preparação do tecido for Imaging <ol><li> Sacrifício animais utilizando isoflurano (2% vaporizado em oxigénio) anestesia (confirmar anestesia adequada pela ausência de reflexos) seguido por inalação de CO 2 em pontos de tempo apropriados após a injecção e col Tamoxifenoleccione o tecido relevante. <ol><li> Para estas experiências, enuclear olhos nos seguintes momentos: 1, 4, 8, 12, e 16 semanas após a injecção Tamoxifen. Alcançar enucleação usando uma pinça curva. Pressione as pálpebras, causando o globo ocular saltar para fora da cavidade ocular. Coloque a pinça por trás do globo ocular, segurando o nervo óptico. Puxe delicadamente o globo ocular e retirá-la. Nota: Nesta fase, como descrito abaixo, os tecidos podem ser preparadas para análise wholemount de células marcadas. Cortes de tecido congelados regulares também podem ser preparadas, fixadas em PFA e fotografada como descrito a seguir (ver secção 6 e 22). </li></ol></li><li> Coloque cada olho em um prato de 60 milímetros encheu-se com PBS. </li><li> Sob um microscópio estéreo usando fórceps segurar o olho perto do nervo óptico com a córnea voltado para baixo e usar um bisturi de forma a remover o nervo óptico, músculo e tecido conjuntivo e fazer uma pequena incisão na parte posterior do olho. </li><li> Com uma tesoura primavera cuidadosamente ampliarcortados deixando a lente pop fora e remova a íris com a pinça. </li><li> Aplanar a córnea, fazendo incisões 4-5 radiais a partir do centro para a periferia, usando um bisturi. </li><li> Usar um bisturi para cortar o tecido periférico em excesso para além do limbo. </li><li> Fix córneas em PFA a 4% durante 10 min, em seguida, lavá-los rapidamente com PBS. </li><li> Incubar as amostras com DAPI durante 10 min e lavar rapidamente com PBS. </li><li> Montagem de córneas em lâminas de vidro com o lado epitelial para cima. Coloque uma gota de montagem de mídia em cima da córnea e tampa com uma tampa de vidro. Deixe secar lâminas O / N em RT. Manter as lâminas a 4 ° C. </li></ol> 6. microscopia confocal e Análise de Imagem <ol><li> Use um sistema confocal espectral, que permite a separação das emissões YFP / GFP / CFP. Conjunto de comprimentos de onda de excitação e de emissão de fluorescência em função das proteínas fluorescentes da cassete Br. Escolha o comprimento de onda de excitação mais adequado para cada proteína visando minimizar cruzexcitação. Escolha de emissão gamas estreitas, a fim de minimizar a fuga dos sinais a partir de diferentes proteínas. <ol><li> Para a cassete Br2.1, use o seguinte configurar de excitação de fluorescência (ex) e de emissão (em) como ponto de partida: DAPI - ex 405 nm / em 420-480 nm, CFP - ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm, e RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm. </li></ol></li><li> Para visualizar grandes áreas de tecidos com alta resolução, aquisição de imagens lado a lado. Para os resultados apresentados na Figura 2A-B, imagem toda a córnea através da obtenção de uma matriz de 12 x 12 imagens, isto é, campos adquirir 144 (512 x 512) utilizando 4 canais fluorescentes em cada campo. Ao todo coletar 576 imagens e, em seguida, mesclar. </li><li> Para explorar a localização das células marcadas em diferentes profundidades e estruturas do tecido, adquirir imagens Z-stack de diferentes regiões de interesse. A fim to imagem a profundidade da córnea, adquirir 8 seções ópticas a 3 mm intervalos. Vistas ortogonais das secções recolhidos, bem como projeções de imagens com base em intensidades máximas podem ser construídas utilizando softwares de imagem convencionais 24. </li></ol> 7. Corneal Lesão combinado com tamoxifeno Indução <ol><li> Anestesiar ratos com isoflurano (2% vaporizado em oxigénio) e administrar analgésicos (10 mg / kg, injectado subcutaneamente Carpofen). Confirme anesthetization adequada por falta de resposta aos pés-pitada. </li><li> Pesar 1 g de pó de tamoxifeno e dissolvê-la em 5 mL de DMSO estéril para produzir 200 mg de solução de concentração / ml. </li><li> Aquece-se a solução Tamoxifeno até 65 ° C num banho de água até que a solução se torne clara. Manter a solução em banho até à sua utilização. </li><li> Aplicar pomada ao olho contralateral não tratado para evitar a desidratação durante a anestesia. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado con suficienteperda de consciência para manter decúbito esternal. Não devolva ratos que tinham sido submetidos a olho ferindo a companhia de outros ratos até que esteja totalmente recuperado. Os ratos devem ser cuidadosamente monitorizados após a lesão. Em caso eles perdem mais de 10% do seu peso corporal, sofrem erosão da córnea ou desconforto, a experiência deve ser interrompido. Administração analgésicos Repetir a cada 24 h durante todo o experimento. </li><li> Utilizando uma seringa esterilizada, sem uma agulha ligada a ela; aplicar 200 solução ul Tamoxifen topicamente sobre toda a superfície da córnea de um olho de cada rato. Nota: A solução líquida solidifica rapidamente sobre a superfície do olho, à TA. O efeito da lesão da córnea depende da gravidade da ferida. Após uma aplicação de solução de tamoxifeno / DMSO não há efeitos adversos são observados nos ratos. No caso de aplicações repetidas opacidade da córnea pode ser observada. </li><li> Continue com a preparação do tecido e de imagem (ver seitaíons 5 e 6) em momentos relevantes. Para os resultados apresentados aqui, sacrificar os ratinhos (como detalhado na fase 5.1) uma semana após o ferimento (Figuras 2 e 24). </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Experimentos descrever a linhagem foram realizados durante muitos anos. Os recentes avanços tecnológicos eo surgimento das cepas Confetti rato abriu novos caminhos para a pesquisa. Hoje, os pesquisadores podem se beneficiar de um grande número de linhas disponíveis comercialmente Cre de tecidos específicos, camundongos knockout e ratos transgênicos. Isso fornece uma oportunidade para a concepção de sistemas experimentais versátil para abordar questões científicas com experiência básica, evitando a prática laboriosa, ao fornecer dados robustos e confiáveis. Camundongos R26R-Confetti são uma ferramenta elegante para acompanhar e estudar a natureza eo comportamento das células em um organismo vivo eficiente. O sistema é fácil de estabelecer e permite o rastreamento de linhagem não-invasiva de células individuais durante a embriogênese, caule regeneração celular sob a homeostase, ou sob circunstâncias diferentes, como lesão, inflamação e câncer. Os dados obtidos fornece um descritivas robustaião de sobrevivência de células alvo, a expansão clonal de células e a migração de células, de um modo quantificável. Um passo crítico seria escolher o mouse estirpe genética apropriada que pode permitir de forma confiável rotulagem específica de tecido eficiente em um estágio de desenvolvimento precisa. Uma limitação deste sistema é que, para monitorização de um organismo vivo, o tecido deve ser acessível e transparente. Da mesma forma, o acompanhamento de um tecido grosso dentro de um animal vivo só pode ser facilitada por dois fótons ou microscopia multi-fotão. No entanto, é possível rastreamento de células em secções de tecido post-mortem, e talvez o tecido intacto pode ser estudado após ele ter sido transformado para se tornar transparente pelo método Clareza 32,33. Outra limitação a ser considerado é que embora as células adjacentes que expressam o mesmo fluoróforo provável pertencem à mesma linhagem clonal, é também possível que eles podem ser derivados de origem celular independente que expressa de forma aleatória do mesmo gene fluorescente. Esta possibility se torna muito pouco provável ao usar vários alelos Br para permitir inúmeras combinações de cores. No futuro, combinando o sistema confetes com ferramentas genéticas disponíveis (ou seja, ko, modelos de ratinhos transgénicos e knockin) permitirá o estudo de genes e das suas mutações na saúde e na patologia. Da mesma forma, a linhagem rastreamento sob diferentes perturbações do sistema (ou seja, caule destruição nicho de células, laser mediada ablação de células, o tratamento medicamentoso) trará novos insights sobre o envolvimento de vias de sinalização nas decisões do destino da célula. Em última análise, o uso combinatória de marcação fluorescente e bioluminescência, repórteres genéticos de vias de sinalização e de corte microscopia borda irá fornecer aos pesquisadores um sistema robusto para aprender como as células único responder ao seu redor em seu ambiente nativo.

Durante o desenvolvimento embrionário, a morfogénese do tecido e órgão ter lugar através de um programa precisa que pode ser descrito em termos de proliferação celular, a migração celular e especificação linhagem 1-4. Estes processos biológicos estão também envolvidas na manutenção da homeostase dos tecidos adultos, o que requer a regeneração de células estaminais. Rastreamento de linhagem, a identificação e rastreio dos descendentes de um tipo específico de população celular, fornece uma importante ferramenta para o estudo da embriogênese e haste homeostase celular. Com efeito, é cada vez mais a ser utilizado em muitos campos da investigação. Particularmente, o rastreamento linhagem tornou-se uma ferramenta essencial na identificação da origem e destino das células-tronco na homeostasia e câncer desenvolvimento. Isto é porque pode fornecer informação essencial sobre a célula comporta-se como no contexto do tecido ou organismo intacto, com um mínimo de intervenção experimental, em contraste com o isolamento de células e cultura in vitro ou transplantatiem que pode resultar em viés indesejado. Tradicionalmente, os corantes tais como carbocianina solúvel em lípidos, que incorporam-se na membrana plasmática das células, foram utilizadas para o traçado da linhagem. Embora estes tipos de experiências conduziram com sucesso a grandes descobertas e conceitos seminais conformados na biologia do desenvolvimento 5,6, eles têm algumas limitações, incluindo a dificuldade em controlar a especificidade das células alvo, o impacto indesejado do corante no comportamento das células e a diluição do rótulo ao longo do tempo. Nucleotídeo abordagens de rotulagem análogo permitiram documentar a existência de-ciclismo lento &quot;etiqueta reter células&quot; que presumivelmente correspondem às células-tronco quiescentes 7,8. No entanto, embora esta técnica foi demonstrada a presença de células em divisão lenta com base na cinética de proliferação ao longo de um período de tempo limitado não poderia fornecer informações importantes sobre a funcionalidade das células estaminais. Um meth linhagem rastreamento idealmeto- deve minimizar o efeito de rotulagem sobre as propriedades da célula marcada, a sua progenitura, ou os seus vizinhos. Além disso, seria benéfico ter controlo sobre a rotulagem de indução, isto é, ter a capacidade de codificar a população de células de interesse numa fase e tempo de forma dependente, bem como de uma maneira única célula (clonal). Um método de marcação estável e irreversível, que é passada para toda a progenia da célula fundador é importante para que a etiqueta seria retido ao longo do tempo, e não será transferida para as células vizinhas. Mais recentemente, foram desenvolvidas abordagens genéticas da marcação celular. Nestes sistemas, os promotores específicos de células podem ser usadas para desencadear a expressão da recombinase Cre, a fim de remover um bloqueio flanqueado-loxP e permitir a expressão dos genes repórter, tais como a proteína fluorescente verde ou Β-galactosidase genes repórter 9-13. Essa abordagem permite não só o acompanhamento das células e sua progênie, mas também permite celular éolation e caracterização molecular. Rastreamento celular ao nível da célula única tornou-se possível pela indução da expressão de um único gene repórter fluorescente. Uma limitação importante deste sistema é o facto de que apenas quando muito baixa percentagem de células é marcado, é possível separar e rastrear clones individuais. Para superar esta limitação repórteres multicolor pode ser usado. Ao usar rotulagem multicolor, o rastreamento do destino diferencial das células vizinhas no mesmo nicho pode ser alcançado de forma eficiente 14-17. Recentemente, uma variedade de Brainbow (BR) alelos foram desenvolvidos para o rastreio de linhagem experiências, permitindo uma expressão estocástica de vários genes repórter fluorescentes, utilizando o sistema Cre / lox. O sistema Cre / lox consiste da enzima Cre recombinase, o qual reconhece e se liga a sequências de ADN específicas, tais como locais loxP. Após a ligação da recombinase Cre, ocorre recombinação específica do local, que faz com que as sequências de remoção de loxP flanqueado resulting na expressão aleatória de diferentes proteínas fluorescentes (o mecanismo é descrito abaixo). Uma variedade de linhas Br estão disponíveis para uso (ver comentários 16,18,19). As principais diferenças entre as estirpes Br incluem: (i) as diferenças no número de genes fluorescentes incluídos na cassete, variando de 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) a 4 (BR1.1, Br2.1) genes fluorescentes , (ii) a presença de locais lox mutuamente orientados para permitir a inversão do gene (Br2.0-2.1), (iii) o tipo de locais lox utilizados, e (iv) a expressão ou silêncio da expressão do gene fluorescente antes da activação Cre. O Br3 recentemente criada oferece um método melhorado para multicolor imagens de neurônios. Uma das principais características deste transcrito é que ele contém um novo conjunto de proteínas fluorescentes farnesilada fotoestável, que permitem uma coloração mesmo dos melhores neuronal processa 20. Mais importante, as versões de diferentes cassetes de Br podem conter o específico neuronal Thy1 PRomoter ou o ubiquamente expresso CAG (CMV). Finalmente, enquanto alguns dos ratinhos transgénicos Br pode conter um único transgene Br, outras podem consistir de várias cópias do transgene, permitindo assim a produção de um imenso número de possibilidades de combinações de cores a serem expressos em cada célula (por exemplo, ver 16). Em nosso estudo, utilizamos o mouse R26R-Confetti que contém a cassete Br 2.1 21. Br2.1 destina-se exclusivamente para permitir que as inversões de ADN mediada por Cre e não só porque as excisões da orientação recíproca dos locais loxP (Figura 1). Assim, esses eventos inversão / excisão que levam à mudança de cor pode continuar enquanto Cre está presente 16. Por essa razão, um sistema de expressão de Cre temporais indutível é essencial para o rastreamento de células fiável utilizando Br2.1. Tal como mostrado na Figura. 1, o Br2.1 contém um promotor ubíquo CAG seguido por flanqueado-loxP NeoR -cassette, que actua como uma barreira de transcrição, que é seguido por 4 fluorescentes genes repórter, que codifica para verde (GFP), amarelo (YFP), vermelha (RFP) e ciano (PCP) proteínas fluorescentes, posicionados em duas tandem. Nenhuma fluorescência é expressa antes da activação Cre. A indução da recombinase Cre faz com que a remoção da cassete neo-R permitindo a expressão aleatória de uma das proteínas fluorescentes em 4 de uma determinada célula. O primeiro segmento contém GFP flanqueado-loxP e um YFP invertida, enquanto que o segundo segmento contém RFP flanqueado-loxP e um PCP invertida. Estes segmentos de ADN podem ser continuamente invertido (usando loxP que está na orientação inversa), ou excisados, contanto que a recombinase Cre se encontra presente. Portanto, um transgene Cre transiente e controlada deve ser utilizada. A cassete Br2.1 fornece um excelente sistema para distinguir entre as emissões de sobreposição com a localização do sinal: a expressão de YFP e RFP é citoplasmática, a GFP é nuclear e PCP está ligada à membrana celular. GFPe emissões RFP são facilmente separados por microscopia de fluorescência convencional. A fim de separar as emissões YFP / GFP / CFP, é necessário um sistema de imagem confocal espectral. No total, a cassete Br2.1 permite a expressão específica aleatório, indutivel, e tecido de um de quatro genes fluorescentes distintas em cada uma das células alvo. De facto, quando é necessário um maior número de combinações de cores, pode-se gerar murganhos homozigóticos que contêm alelos de Br2.1 2, resultando assim na expressão de 2 etiquetas de cor para cada célula e no aumento do número de combinações possíveis de cores para 10 22. Algumas das estirpes de ratinho Br permitir a expressão de um muito maior número de possíveis combinações de cores desde que múltiplas cópias da cassete foram integradas no seu genoma 16. No entanto, na maioria dos casos, as quatro combinações de cor fornecidos por um único alelo Br2.1 são suficientes. Seguindo o protocolo proporcionado aqui, pode-se estabelecer esse método utilizando uma configuração relativamente simples de Spectrmicroscopia al com pouca ou nenhuma necessidade de calibração. Aqui nós fornecemos um protocolo adaptável para a utilização dos ratinhos R26R-confetes que contêm um único alelo Br2.1, para o rastreio de linhagem experiências do epitélio da córnea. Esta estirpe de ratinho transgénico tem sido utilizada para estudar a origem e o destino dos dois pontos 21,23 e células estaminais epiteliais da córnea 22,24, a presença de actividade de células estaminais no cancro intestinal 25, e para a caracterização de podócitos renais em glomerulosclerose focal e segmentar (FSGS) 17.

<table><tbody><tr><td>Camundongos transgênicos R26R-Confetti homozigotos para o Brainbow 2.1</td><td>Cepa Jackson</td><td># 013731</td><td></td></tr><tr><td>camundongos K14-CreERT</td><td>Cepa Jackson</td><td># 005107</td><td></td></tr><tr><td>tamoxifeno</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano USP Terrell</td><td>Piramal Critical Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprieve 30</td><td>b.wt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>usado na concentração de 4&#160; &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Immu Mount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 Sistema confocal de varredura a laser Meta conectado a um microscópio motorizado invertido (Axiovert 200M) equipado com um estágio motorizado</td><td>Zeiss</td><td></td><td>A sobreposição espectral entre GFP, YFP e CFG requer o uso de imagens espectrais que permitem a separação dos espectros de emissão das proteínas fluorescentes. Aqui usamos o microscópio confocal metaespectral Zeiss LSM 510. O detector Meta incluído neste sistema possui 32 elementos detectores, cada um coletando emissão de uma faixa de onda de 10 nanômetros. Essa técnica denominada "impressão digital espectral" permite que o usuário defina os limites mais adequados para a filtragem de banda de onda. Há uma variedade de sistemas confocais espectrais que podem ser usados, incluindo Leica SP5 (ref # 21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref # 22).</td></tr><tr><td>Zen 2009 Software de Imagem</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duratears-olho pomada</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um método para lineage tracing de células da córnea usando multi-cor repórter fluorescente mice

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Experimentos de rastreamento de linhagem definem a origem, o destino e o comportamento das células em um tecido ou organismo específico. Esta técnica tem sido aplicada com sucesso por muitas décadas, revelando descobertas seminais na biologia do desenvolvimento. Mais recentemente, foi adotado por biólogos de células-tronco para identificar e rastrear diferentes populações de células-tronco com intervenção experimental mínima. Os recentes desenvolvimentos na genética de camundongos, a disponibilidade de um grande número de cepas de camundongos e os avanços na microscopia fluorescente permitem o design direto de poderosos sistemas de rastreamento de linhagem para vários tecidos com conhecimentos básicos, usando ferramentas disponíveis comercialmente. Recentemente, aproveitamos essa poderosa metodologia para explorar a origem e o destino das células-tronco na superfície ocular usando o camundongo R26R-Confetti. Este modelo oferece um sistema genético multicolorido, para a expressão de 4 genes fluorescentes de forma aleatória. Aqui descrevemos os princípios desta metodologia e fornecemos um protocolo adaptável para projetar experimentos de rastreamento de linhagem; especificamente para o epitélio da córnea, bem como para outros tecidos.

Recentemente, teve como objetivo identificar a origem, sobrevivência e migração das células-tronco e células progenitoras do epitélio corneano 24. O acúmulo de evidências suporta o dogma de que o epitélio corneano é regenerado por células-tronco localizadas exclusivamente no nicho de limbo, uma zona em forma de anel na periferia da córnea. Esta teoria é apoiada por in vitro e in vivo de dados, e por evidência clínica de que forneceu a base para o sucesso da terapia pioneira tronco do limbo celular 27-29. No entanto, este tema permaneceu muito debatido nos últimos anos, devido a um estudo com base em experiências do limbo de enxertia que sugeriam que o limbo do mouse não participa na renovação da córnea 30. Para testar esta hipótese interessante, rastreamento de linhagem experimentos usando camundongos R26R-Confetes foram realizados, para seguir o destino das células-tronco epiteliais / progenitoras do limbo e córnea sob condições de estado estacionário para até 120 dias 24.Os olhos foram enucleados e-montagem planas córneas foram analisadas por microscopia de fluorescência confocal de varrimento laser espectral 10 e 120 dias após a injecção de Tamoxifen. Como esperado, pequenos grupos de células fluorescentes esporádicos foram observados ao longo da superfície ocular de 10 dias após a injecção, enquanto 1-4 meses mais tarde (Figura 2B e 24), estrias alongadas que se estendem a partir do limbo em direcção ao centro da córnea desenvolvido lentamente. Este resultado sugere que a córnea é regenerado por células que migram a partir do limbo em direcção ao centro da córnea. Em seguida, a regeneração da córnea sob condições ferindo foi examinada. A fim de testar o destino das células corneais limbares / K14-positivos sob condições ferindo enquanto induz rastreamento célula eficiente, dissolveu-se o tamoxifeno em dimetil sulfóxido (DMSO), o que provoca lesão da córnea após a aplicação tópica. Desta forma, conseguimos induzir ferimento leve se uma única aplicação tópica foi aplicado (Figura 2C), mo<html> derate ferindo se sozinho tratamento adicional DMSO foi aplicado no dia antes da indução da ferida grave ou tamoxifeno quando DMSO sozinho foi aplicada topicamente em 2 dias antes da indução sequencial de Tamoxifen. Em contraste com as listras do limbo finas que lentamente desenvolvidos e atingiu o centro da córnea no prazo de 4 meses sob condições de estado estacionário, a migração celular após lesão foi rápida. Notavelmente, listras limbo longos e grossos já foram desenvolvidos sob estas condições dentro de 7 dias. Curiosamente, a diversidade de cores, por vezes, foi mínima (Figura 2D). Nas nossas mãos, ocasionalmente, principalmente as células vermelhas foram identificados em toda a córnea, o que indica que a cor diversidade pode ser inclinado para fluoróforos específicos. Este desvio indesejado pode ser calibrado por meio de testes de resposta à dose como relatado anteriormente em Br1.0L 31 e 21 em Br2.1. les / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Representação esquemática da construção R26R-confetes. (A) A construção R26R-confetes contém um promotor de CAG para elevados níveis de expressão, um loxP (triângulo preto) -flanked NeoR -roadblock e a cassete no locus Brainbow2.1 Rosa26 16,21. A cassete Brainbow2.1 inclui dois head-to-tail dímeros ladeado-loxP. Um dímero é composto de proteína nuclear localizada verde fluorescente (GFP) e uma proteína fluorescente amarela citoplasmática orientada a inversa (YFP, a orientação inversa é designado - PFY). A segunda dímero contém RFP citoplasmática e uma membrana-tethered proteína fluorescente ciano-oriented reversa (PCP, a orientação inversa é designado - PFC) 16. (B - E) Após a ativação Cre-recombinase, diferentes eventos de excisão e de inversão pode ocorrer; resultados possíveis são exemplified em B - E. A atividade Cre induz rearranjo estocástica da cassete levando a mudanças genéticas e / ou inversões e, portanto, resulta na expressão aleatória de um dos quatro proteínas fluorescentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53370/53370fig2.jpg" /> Figura 2. Corneal linhagem rastreamento sob a homeostase e do prejuízo. R26R-confetti / murganhos K14-Cre foram injetados com 4 mg Tamoxifeno como detalhado no protocolo. Na hora indicada pontos após a indução achatada córneas foram fotografadas (A - B). Ferimento da córnea associada com a indução de Cre foi conseguida através da aplicação tópica de Tamoxifen dissolvido em DMSO (C - D). Imagens de mosaico obtidopor multicanal telha microscopia confocal espectral são mostradas (A - D). Na homeostase, listras limbo radiais de células que migram lento estendido entre o limbo e do centro da córnea. Essas faixas desenvolveu-se lentamente, atingindo o centro da córnea dentro de 4-5 meses (B). Aglomerados de células da córnea foram bem evidentes (setas brancas, B). Em contraste, grandes estrias limbo apareceu dentro de uma única semana sob condições ferindo (C). Um exemplo para a polarização da diversidade de cor para as células vermelhas (D). A fronteira de limbo-corneano é anotada por uma linha tracejada. Barra de escala é de 500 mm. Abreviaturas: PCP, proteína fluorescente ciano; GFP, proteína fluorescente verde; RFP, proteína fluorescente vermelha; YFP, proteína fluorescente amarela. Esta figura foi modificada a partir de 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior</a>esta figura.

Neste artigo, descrevemos os princípios para projetar e realizar um experimento de rastreamento de linhagem multicolorido usando camundongos R26R-Confetti. Fornecemos um protocolo específico para rastreamento de células epiteliais da córnea que podem ser modificadas para outros tecidos de interesse.

Um método para Lineage Tracing de células da córnea Usando Multi-cor repórter fluorescente Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

O objetivo geral deste método é localizar e acompanhar a migração, expansão e sobrevivência de células-tronco e células progenitoras no epitélio corneano. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia celular do epitélio corneano relativas à homeostase, reparo tecidual, envelhecimento e patologia. A principal vantagem desta técnica é que ela é fácil de estabelecer e permite o rastreamento não invasivo de linhagens celulares de forma clonal.Para começar, selecione primeiro uma linhagem de camundongo transgênico Cree com um promotor específico de tecido indutível para marcar as células progenitoras e as células-tronco do epitélio limbar e corneano. Utiliza-se a linhagem K14 Cree ERT indutível por tamoxifeno. Em seguida, escolha o cassete brainbow apropriado conforme a questão de pesquisa e a linhagem Cree disponível.Neste caso, utiliza-se a linhagem Brainbow 2.1. Cruze a linhagem R 26 R confetti homozigótica com a linhagem K 14 Cree ERT homozigótica para gerar camundongos com quatro cores em células positivas para K 14. Para induzir a recombinação nos camundongos transgênicos, primeiro pese 80 miligramas de tamoxifeno e dissolva em um mililitro de óleo de milho por meio de vortex.Coloque a solução em um banho-maria agitado, mantido a 65 graus Celsius até que se dissolva completamente, e deixe-a no banho até o próximo uso para anestesiar. Utilize um camundongo heterozigoto Brainbow 2.1 Cree ERT com oito semanas de idade e verifique cuidadosamente a profundidade da anestesia com o teste de pressão no dedo do pé. Aplique cuidadosamente 100 microlitros da solução de Tamoxifeno em cada superfície ocular do camundongo. A aplicação direta de Tamoxifeno proporciona alta eficiência na indução de Cree. Armazene qualquer solução residual de Tamoxifeno protegida da luz a quatro graus Celsius por até uma semana.Aqueça a solução antes da aplicação, que é repetida por três dias consecutivos para cada camundongo. Primeiro, dissolva um grama de pó de tamoxifeno em cinco mililitros de dimetilsulfóxido estéril. Para produzir uma solução de 200 miligramas por mililitro, coloque a solução em um banho-maria com agitação, mantido a 65 graus Celsius até ficar límpida, e deixe-a no banho até o uso.Em seguida, anestesie o camundongo e verifique a profundidade da anestesia utilizando um aperto no dedo da pata, aplique pomada oftálmica no olho não tratado do camundongo para protegê-lo da desidratação durante o procedimento e administre analgésicos adequados. A seguir, aspire 200 microlitros da solução de Tamoxifeno em uma seringa sem agulha acoplada e aplique-a topicamente sobre toda a córnea do olho. O líquido solidifica-se no tecido à temperatura ambiente.Observe o camundongo até que ele mantenha a posição esternal recumbente e devolva-o à companhia dos demais somente quando estiver plenamente consciente. Após sacrificar os camundongos nos pontos temporais apropriados pós-indução, realize uma lesão ocular conforme descrito no protocolo do texto. Enucleie o olho pressionando primeiro a pálpebra para fazer o globo ocular sair da órbita.Deslize a pin&ccedil;a curva por tr&aacute;s do globo ocular para segurar o nervo &oacute;ptico e puxe o globo ocular para cima a fim de destac&aacute;-lo. Coloque cada globo ocular em uma placa de 60 mil&iacute;metros contendo PBS. Posicione a placa com o olho sob um microsc&oacute;pio est&eacute;reo cir&uacute;rgico.Certifique-se de reconhecer a estrutura básica do olho, a córnea, o limbo e o nervo óptico. Remova o nervo óptico, os músculos e o tecido conjuntivo ao redor do olho. Segure o olho na parte posterior com a córnea voltada para baixo e faça uma incisão na esclera na parte traseira do globo ocular usando uma tesoura de mola.Aumente o corte para permitir que a lente saia e remova a íris com pin&ccedil;as. Em seguida, fa&ccedil;a quatro a cinco incis&otilde;es radiais cortando do centro em dire&ccedil;&atilde;o &agrave; periferia para achatamento da c&oacute;rnea e, ent&atilde;o, remova quaisquer partes remanescentes da &iacute;ris com uma esp&aacute;tula fina e plana. Por fim, corte o tecido perif&eacute;rico excedente ao redor do limbo para fixar a c&oacute;rnea.Transfira o tecido dissecado para uma placa de 12 poços e incube em paraformaldeído a 4% por 10 minutos. Em seguida, lave brevemente o tecido em PBS para coloração dos núcleos celulares. Incube a córnea em solução de DPI a dois microgramas por mililitro por 10 minutos, seguido por uma breve lavagem em PBS.Em seguida, coloque a córnea sobre uma lâmina de vidro com o lado epitelial voltado para cima. Depois, coloque uma gota de meio de montagem sobre a córnea e cubra com uma lamínula. Deixe as lâminas secarem durante a noite à temperatura ambiente e armazene-as a quatro graus Celsius.Para a imagem da córnea, utilize um sistema confocal espectral que permita a separação das emissões de R-F-P-Y-F-P-G-F-P e CFP. Primeiro, ajuste os comprimentos de onda de fluorescência, excitação e emissão de acordo com as proteínas fluorescentes do cérebro. Cassete Bo, tomando cuidado para evitar a excitação cruzada ou a sobreposição dos sinais de emissão.Em seguida, adquira imagens em mosaico para visualizar toda a córnea em alta resolução. Aqui, obtenha uma matriz de 12 por 12 imagens em todos os quatro canais fluorescentes. Por fim, una as imagens para criar uma linhagem composta.Experimentos de rastreamento utilizando camundongos R 26 R confetti foram realizados para acompanhar o destino das células progenitoras epiteliais da córnea e do limbo. Em condições de estado estável, pequenos grupos de células fluorescentes foram observados 10 dias após a indução, conforme esperado. Após quatro meses, surgiram estrias do limbo até o centro da córnea, sugerindo que as células migram do limbo para regenerar a córnea após lesão corneana.A migração a partir do limbo ocorreu rapidamente, com o desenvolvimento de faixas limbares longas e espessas em sete dias. Este modelo é valioso para o rastreamento e estudo de células-tronco e progenitoras corneanas em diferentes condições. Ele permitirá a investigação da expansão clonal de células, sobrevivência e migração em estado estável e em condições de estresse, como lesão, queimadura química, mutação e outras no futuro.Este modelo também pode ser utilizado para analisar os mecanismos moleculares subjacentes à regeneração corneana normal e patológica. Esta técnica pode contribuir para a nossa compreensão de diferentes condições patológicas, como distrofias corneanas, queimaduras e trauma corneano, além da avaliação do impacto de diferentes tratamentos sobre a regeneração corneana, expansão celular e migração.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Aqui vamos desenvolver as ferramentas necessárias...

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/ single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere, et. al. RNA-seq de célula única de subconjuntos definidos de células ganglionares da retina. J. Vis. exp. (2017). Este vídeo demonstra uma técnica de rastreamento fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares da retina (RGC) em uma retina de camundongo transgênico. O processo envolve proteger a retina isolada em uma...

Identificação de subtipos de células ganglionares da retina de camundongos por meio de rastreamento fluorescente

Organização celular dos ossos craniofaciais tem sido a hipótese, mas nunca diretamente visualizado. Rotulagem célula multi-espectral e in vivo ao vivo   imaging permite a visualização do comportamento das células dinâmica no peixe-zebra maxilar inferior. Aqui, nós detalhe o protocolo para manipular Zebrabow peixes transgénicos e observar diretamente intercalação celular e alterações morfológicas de condrócitos na cartilagem de Meckel.

Visualização de condrócitos Intercalation e Direcional Proliferação via Zebrabow Análise celular clonal na cartilagem de Meckel o Embryonic

Descrevemos aqui um modelo de camundongo repórter transgênico para visualizar as células produtoras de IL-22 dentro de diferentes tecidos de camundongos. Este método pode ser usado para rastrear a localização de outras citocinas ou proteínas secretas no camundongo.

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica de marcação de mosaico que permite a visualização dos neurónios derivados de uma célula progenitora comum em duas cores distintas. Isso facilita a análise de linhagem neural com a capacidade de neurônios individuais-datando de nascimento e função do gene estudar nos mesmos neurônios de diferentes indivíduos.

Análises celular linhagem e estudos da função de genes utilizando marcm Twin-ponto

Este método descreve o uso do modelo do rato do R26-confetti (confetti) para estudar tecidos mineralizado, cobrindo todas as etapas da estratégia de melhoramento à aquisição da imagem. Incluído é um protocolo geral que pode ser aplicado a todos os tecidos moles e um protocolo modificado que pode ser aplicado a tecidos mineralizados.

Rastreamento genético clonal usando o mouse confetti para estudar tecidos mineralizados

Apresentada aqui é uma plataforma microscópica multifotípica para imagens de superfície ocular de rato vivo. O camundongo transgênico fluorescente permite a visualização de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nervosas e capilares dentro da superfície ocular. Sinais de segunda geração harmônica não lineares derivados de estruturas colágenas fornecem imagens sem rótulos para arquiteturas estromais.

Uma plataforma personalizada de microscopia multifotn para imagens ao vivo de córnea de rato e conjuntiva

Um protocolo para realizar o rastreamento de linhagem e a análise genética funcional dos genes candidatos em um único nível celular usando a análise de mosaico com marcadores duplos (MADM). A análise clonal madm fornece uma estrutura quantitativa para medir o comportamento proliferativo, a saída celular e a relação de linhagem de progenitores individuais e suas células filhas.

Rastreamento de linhagem e análise clonal no desenvolvimento de córtex cerebral usando análise de mosaico com marcadores duplos (MADM)

A capacidade de marcar permanentemente células-tronco e sua prole com um fluoróforo usando uma linhagem transgênica indutível que traça a linhagem do mouse permite a análise espacial e temporal de ativação, proliferação, migração e/ou diferenciação in vivo. O rastreamento de linhagem pode revelar novas informações sobre o comprometimento da linhagem, a resposta à intervenção e a multipotência.

Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

Aqui, propomos três métodos diferentes de danificar as fibras sensoriais que inervam a córnea. Estes métodos facilitam o estudo da regeneração axonal em camundongos. Estes três métodos, adaptáveis a outros modelos animais, são ideais para o estudo da fisiologia e regeneração da inervação corneana.

Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

Aprenda o método de rastreamento de linhagem celular na córnea usando camundongos R26R-Confetti fluorescentes multicoloridos. Esta técnica permite estudar dinâmicas de células-tronco epiteliais em regeneração tecidual.

Um método para Lineage Tracing de células da córnea Usando Multi-cor repórter fluorescente Mice

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