Um método para Lineage Tracing de células da córnea Usando Multi-cor repórter fluorescente Mice

O objetivo geral deste método é localizar e rastrear a migração, expansão e sobrevivência de células-tronco e células progenitoras no epitélio da córnea. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular epitelial da córnea sobre homeostase, reparo de tecidos, envelhecimento e patologia. A principal vantagem dessa técnica é que ela é fácil de estabelecer e permite o rastreamento não invasivo da linhagem das células de maneira clonal.

Para começar, primeiro selecione uma cepa de camundongo transgênico Cree com um promotor específico de tecido induzível para rotular as células progenitoras epiteliais límbicas e da córnea e as células-tronco. Utiliza-se a linha Tamoxifen Inducible K 14 Cree ERT. Em seguida, escolha o brainbow apropriado, dependendo da questão de pesquisa e da linha Cree disponível.

Neste caso, a linha Brainbow 2.1 é usada. Cruze a cepa homozigótica de confete R 26 R com a cepa homozigótica K 14 Cree ERT para gerar camundongos com quatro células K 14 positivas de cor Para induzir a recombinação nos camundongos transgênicos. Primeiro pesar 80 miligramas de Tamoxifeno e dissolva-o em um mililitro de óleo de milho por Vortexing.

Coloque a solução em banho-maria agitado, mantida a 65 graus Celsius até que se dissolva completamente, e deixe-a no banho até a próxima anestesia. Um camundongo heterozigoto Brainbow 2.1 Cree ERT de oito semanas de idade e verifique a profundidade da anestesia com a pinça do dedo do pé aplique cuidadosamente 100 microlitros da solução de tamoxifeno em cada superfície ocular do camundongo. A aplicação direta de tamoxifeno produz uma alta eficiência de indução Cree Armazene qualquer solução residual de tamoxifeno protegida da luz a quatro graus Celsius por até uma semana.

Aqueça a solução antes da aplicação, que é repetida em três dias consecutivos para cada camundongo. Primeiro dissolva um grama de pó de tamoxifeno em cinco mililitros de dimetilsulfóxido estéril. Para produzir uma solução de 200 miligramas por mililitro, coloque a solução em banho-maria agitado, mantenha seus 65 graus Celsius até que fique clara e deixe-a no banho até o uso.

Em seguida, anestesiar o camundongo e verificar a profundidade da anestesia usando uma pitada no dedo do pé, aplicar pomada ocular no olho não tratado do camundongo para protegê-lo da desidratação durante o procedimento e administrar analgésicos adequados. Em seguida, retire 200 microlitros da solução de tamoxifeno em uma seringa sem agulha acoplada e aplique-a topicamente em toda a córnea do olho. O líquido solidifica no tecido à temperatura ambiente.

Preste atenção ao camundongo até que ele mantenha o esterno reclinado e devolva-o à companhia de outras pessoas somente quando estiver totalmente consciente. Depois de sacrificar os ratos em pontos de tempo apropriados após a indução, um ferimento no olho, conforme descrito no protocolo de texto. Nuclee o olho pressionando primeiro a pálpebra para tirar o globo ocular da órbita.

Deslize uma pinça curva atrás do globo ocular para segurar o nervo óptico e puxe o globo ocular para cima para soltá-lo. Coloque cada globo ocular em um prato de 60 milímetros contendo PBS. Coloque a placa de contenção do olho sob um microscópio estereoscópico cirúrgico.

Certifique-se de reconhecer a estrutura básica do olho, da córnea, do limbo e do nervo óptico. Remova o nervo óptico, o músculo e o tecido conjuntivo ao redor do olho. Segure o olho na parte posterior com a córnea voltada para baixo e faça uma incisão na esclera na parte de trás do globo ocular usando uma tesoura de mola.

Aumente o corte para permitir que a lente saia e remova a íris com uma pinça. Em seguida, faça quatro a cinco incisões radiais cortando do centro em direção à periferia para achatar a córnea e, em seguida, remova todas as partes restantes da íris com uma espátula fina e plana. Finalmente, corte o excesso de tecido periférico ao redor do limbo para fixar a córnea.

Transfira o tecido dissecado para um prato de 12 poços e incube-o em 4% de formaldeído por 10 minutos. Em seguida, lave brevemente o tecido em PBS para corar os núcleos das células. Incubar a córnea em dois microgramas por mililitro de solução de DPI por 10 minutos, seguido de uma breve lavagem em PBS.

Em seguida, coloque a córnea em uma lâmina de vidro com o lado epitelial voltado para cima. Em seguida, coloque uma gota de mídia de montagem em cima da córnea e cubra-a com uma lamínula. Deixe as lâminas secarem durante a noite em temperatura ambiente e guarde-as a quatro graus Celsius.

Para imagens da córnea, use um sistema confocal espectral que permita a separação das emissões de R-F-P-Y-F-P-G-F-P e CFP. Primeiro defina os comprimentos de onda de fluorescência, excitação e emissão dependendo das proteínas fluorescentes do cérebro. Bo, tendo o cuidado de evitar a excitação cruzada ou sobreposição de sinais de emissão.

Em seguida, adquira imagens lado a lado para visualizar toda a córnea em alta resolução. Aqui, obtenha uma matriz de imagens de 12 por 12 em todos os quatro canais fluorescentes. Por fim, mescle as imagens para criar uma linhagem composta.

Experimentos de rastreamento usando camundongos confete R 26 R foram realizados para acompanhar o destino das células progenitoras epiteliais límbicas e corneanas. Em condições de estado estacionário, pequenos aglomerados de células fluorescentes foram observados 10 dias após a indução, conforme esperado. Após quatro meses, surgiram estrias do limbo para o centro da córnea, sugerindo que as células migram do limbo para regenerar a córnea após a lesão da córnea.

A migração do limbo ocorreu rapidamente, com listras límbicas longas e grossas se desenvolvendo em sete dias. Este modelo é valioso para rastrear e estudar células-tronco e progenitoras da córnea em diferentes circunstâncias. Isso permitirá a investigação da expansão, sobrevivência e migração de células clonais em estado estacionário e sob condições de estresse, como ferimentos, mutação de queimadura química e muito mais no futuro.

Este modelo também pode ser usado para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes à regeneração normal e patológica da córnea. Essa técnica pode contribuir para a compreensão de diferentes condições patológicas, como distrofias da córnea, queimaduras e traumas da córnea, além da avaliação do impacto de diferentes tratamentos na regeneração, expansão celular e migração da córnea.