Name: Sistema induzível de raiz lateral em Arabidopsis e milho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a usar o Sistema Induzível de Raiz Lateral para estudar o desenvolvimento de raízes em Arabidopsis thaliana e milho. Este método inovador permite a indução síncrona de raízes laterais para análises citológicas e histológicas.

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Os autores agradecem a Davy Opdenacker pela assistência técnica e fotografia. Agradecemos imensamente à Dra. Annick Bleys pelas sugestões úteis para melhorar o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Programa Interuniversitário de Pólos de Atração IUAP P7/29 'MARS' do Gabinete Federal de Política Científica da Bélgica, pela G027313N de subvenções FWO e pela Agência para a Inovação pela Ciência e Tecnologia, IWT (IR).

1. Arabidopsis IRIs Protocol Nota: O texto refere-se a experiências &quot;pequenas&quot; ou &quot;grandes&quot; escala. Experimentos de pequena escala, como a análise de linha de marcação e coloração histológica 6, 14, exigem apenas algumas amostras. Experiências em larga escala, tais como em tempo real quantitativa qRT-PCR, as micro-matrizes de 9-11 ou de sequenciação de ARN, requerem uma maior quantidade de amostras. Como tal, uma quantidade de ~ 1000 mudas por amostra foi utilizada por Vanneste et al 11. Executar experiência microarray após dissecção segmento de raiz. DIA 1 <ol><li> A esterilização de sementes de Arabidopsis Nota: Selecione um dos seguintes procedimentos de esterilização de sementes. Qualquer um deles é adequado para as próximas etapas do protocolo. Esterilização de gás (1.1.2) apresenta duas principais vantagens sobre a esterilização líquida (1.1.1): leva menos tempo ao manusear uma grande entorpecidoer de sementes, uma vez que não tem de ocorrer pipetagem para as amostras individuais; e as sementes esterilizadas podem ser armazenados por um período mais longo. No entanto, isso exige um exsicador e tratamento cuidadoso. <ol><li> Esterilização líquido <ol><li> Despeje o número desejado de sementes em tubos de micro-centrífuga. Utilizar-se a 20 mg (~ 800 sementes) em um tubo de 1,5 ml ou de 40 mg (~ 1600 sementes) em tubos de 2 ml de micro-centrífuga. </li><li> Adicionar 1 ml de etanol a 70%. Inverter ou agitar suavemente por 2 min. </li><li> Substituir o etanol a 70% com 1 ml de solução de esterilização durante 15 min. (Preparar uma solução de solução de esterilização: 3,85 ml de hipoclorito de sódio (NaOCl) de ações (12%) (ATENÇÃO: Use exaustor), 5 ul Tween 20, até 10 ml com água Inverta os tubos várias vezes para se certificar de que todas as sementes vir. em contacto com a solução. </li><li> Em uma câmara de fluxo laminar de ar, substituir a solução de esterilização com 1 ml de água destilada estéril e lavar as sementes 5 vezes durante 5 min por repetidasly substituindo com 1 ml de água estéril destilada fresca. </li></ol></li><li> Esterilização por gás <ol><li> Verter o número desejado de sementes num tubo de micro-centrifugadora de 2 ml. Use tubos individuais quando se trabalha com várias linhas independentes, e organizá-los em uma caixa aberta tubos micro-centrífuga de plástico ou titular. Se o número de sementes em um tubo superior a 500 (12,5 mg), subdividir as sementes do número apropriado de tubos para assegurar a esterilização bem sucedida. Certifique-se as tampas de tubos vizinhos não cobrem uns aos outros. Encaixar a tampa da caixa na parte inferior, uma vez que necessita de estar no exsicador, bem como para esterilização. </li><li> Coloque a caixa na tigela de um secador, juntamente com um copo de vidro (ATENÇÃO: Use exaustor). </li><li> Encha o copo com 100 ml de 12% NaOCl (ATENÇÃO: Use extractor de fumo). Colocar a tampa no exsicador, mas deixar uma pequena abertura, onde o copo é colocado. </li><li> Adicionar 3 ml de ácido clorídrico a 37% (fumegante) (CAUÇÃO: Use exaustor) para o copo através da pequena abertura e rapidamente fechar o exsicador. A vontade bolha solução por algum tempo devido à formação Cl 2 -gas. Deixar o sistema fechado O / N (ou, pelo menos, 8 horas). </li><li> Remover a tampa do exsicador. Retire a caixa e cobri-lo com a tampa para evitar a contaminação durante o transporte. </li><li> Coloque a caixa em um armário de fluxo de ar laminar, retire a tampa e deixar as sementes para cerca de 1 hora à temperatura ambiente para permitir a libertação de gás. Nota: As sementes podem ser armazenadas com segurança a seco em tubos de micro-centrifugação de fechadas durante até 2 semanas a 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> A indução de raízes laterais em Arabidopsis <ol><li> Lateral Root Inibição (Tratamento NPA) <ol><li> Prepare meio de crescimento para o crescimento in vitro. O meio contém metade da força Murashige e Skoog mistura de sal de 15, 0,1 g / l de mio-inositol, 10 g / L de sacarose, e é tamponado com 0,5g / L de 2- (N-morfolino) etanossulfónico (MES). </li><li> Ajustar o pH para 5,7 com 1 M de KOH. Adiciona-se 8 g / L de agar de tecido da planta e do meio de autoclave durante 20 min a 121 ° C. </li><li> Prepare uma solução estoque 25 mM de NPA em dimetilsulfóxido (DMSO) (ATENÇÃO: Usar luvas). Em uma câmara de fluxo laminar de ar, arrefecer o meio autoclavado para baixo para cerca de 65 ° C (que é a temperatura à qual a garrafa pode ser realizada à mão), e adicionar solução de estoque 25 NPA mM para obter uma concentração final de 10 uM NPA. </li><li> Homogeneizar em cima disso agitando a garrafa por 10 s. Pour 50 ml de meio por prato de petri quadrado (12 cm x 12 cm). Nota: Em caso de experimento em grande escala, aplique uma malha de nylon (20 mm) para garantir a fácil transferência. Prepara-se uma malha (9 cm x 9 cm) por tratamento em autoclave (Figura 1A). Quando autoclavado, aplicar a malha para o meio de crescimento estéril utilizando pinças (Figura 1B). Empurre a malha para o meio de crescimento usando um sterilized drigalsky para se certificar de que está em bom contato com o meio de crescimento (Figura 1B) (ATENÇÃO: O trabalho em condições estéreis). </li><li> Semear as sementes nos NPA-placas. Nota: No caso de um experimento em grande escala está prevista, semear 2 linhas densas e bem-alinhados de 50 sementes para facilitar a recolha de amostras (ver 1.2.2.3). <ol><li> Em caso de esterilização líquido, semear as sementes no NPA placas usando uma pipeta de 200 mL. Cortar 3 - 4 mm da extremidade das pontas conta-gotas em condições estéreis (ou antes da esterilização das pontas), a fim de ser capaz de pipetar com as sementes. Pipeta cima e para baixo algumas vezes para voltar a suspender as sementes, em seguida, pipete água cerca de 150 mL estéril com 10 - 20 sementes e esperar até que o sedimento sementes na parte inferior da ponta. (ATENÇÃO: O trabalho em condições estéreis) Nota: Quando tocar o agar ou a malha suavemente com a ponta, uma gota de água com uma semente vai ser libertado a partir dele (Figura 1C). </li> &lt;li&gt; Em caso de esterilização por gás, semear as sementes usando autoclavado toothpicks.Pinch o palito no agar antes de tomar as sementes para garantir uma superfície pegajosa. Escolher-se a sementes, um a um utilizando o palito e distribuir as sementes nas placas (Figura 1D). Como alternativa, adicione a água estéril para as sementes e semear como descrito em 1.2.1.5.1 (ATENÇÃO: O trabalho em condições estéreis). </li></ol></li><li> Selar as placas com fita adesiva respirável e armazená-los placas a 4 ° C no escuro durante pelo menos 2 dias e máximo de uma semana. Isso é necessário para estratificação e garante sincronizados e germinação mais eficiente. Nota: Como alternativa, as sementes podem ser estratificada antes da semeadura, imersa em água destilada em micro-centrífuga de tubos, o que requer menos espaço frigorífico. Neste caso, os tubos para armazenar pelo menos uma semana a 4 ° C, e mover as placas para a câmara de crescimento imediatamente após a sementeira (ver 1.2.1.7). DIA 3 </li&gt; <li> Mover as placas para a câmara de crescimento (luz contínua (110 μE m -2 s -1), 21 ° C) durante 5 dias (2 dias de germinação e 3 dias de crescimento) numa posição quase vertical (80 a 90 °) para assegurar o crescimento das raízes, e não na forma. DIA 8 </li></ol></li><li> Lateral Root indução (tratamento NAA) <ol><li> Prepara-se o mesmo meio de crescimento como descrito em 1.2.1.1 1.2.1.2 e. Prepare uma solução estoque de 50 mM NAA em DMSO (CUIDADO: Use luvas). Arrefece-se o meio autoclavado para baixo a 65 ° C e adicionar solução de NAA para a forma a obter uma concentração final de 10 uM de NAA (CUIDADO: O trabalho em condições estéreis). <ol><li> Homogeneizar em cima disso agitando a garrafa por 10 s. Pour 50 ml de meio por prato de petri quadrado (12 cm x 12 cm). </li></ol></li><li> Transferir as mudas das placas contendo o meio de crescimento suplementado com 10 ^ M para os ANP suptadas com 10 mM NAA. <ol><li> Gancho nos braços de uma pinça curvas sob os cotilédones de plântulas e gentilmente removê-lo da placa. Transferir apenas mudas de que as raízes têm crescido inteiramente em contacto com o meio de crescimento NPA-e, de preferência baixo. </li><li> Skim a raiz sobre a superfície do meio de crescimento contendo NAA sobre uma pequena distância. Certifique-se que as raízes das plantas estão em bom contato com o meio de crescimento. Se necessário, pressione a raiz suavemente para a superfície de meio de crescimento com a pinça. Nota: Em caso de uma experiência em larga escala, remover todas as plântulas que não estão em contacto com a malha e de transferência, levantando a malha nos dois cantos superiores com uma pinça. Certifique-se a malha está em bom contato com o meio contendo NAA por desnatação a malha sobre a superfície de ágar sobre uma pequena distância (Figura 1E). </li></ol></li><li> Selar as novas placas com fita respirável e colocá-los no armário de crescimento (conluz contínuo (110 μE m -2 s -1), 21 ° C) numa posição vertical durante o tempo desejado após a indução até à colheita. Nota: Em caso de uma experiência em larga escala, usa um bisturi para cortar os segmentos de raiz de uma só vez directamente sobre a malha e prove-las por raspagem suave da superfície da malha. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. IRIs Milho Protocol <ol><li> Estratificação de milho Grãos <ol><li> Incubar os grãos de milho a 4 ° C no escuro durante pelo menos 1 semana. Nota: Este protocolo foi desenvolvido usando as linhas puras de milho B73. </li></ol></li><li> Esterilização de milho Grãos DIA 1 Nota: Embora plântulas de milho não tem que ser cultivadas em condições estéreis, é recomendado para esterilizar os grãos de milho e trabalhar com material estéril para evitar o crescimento de fungos no rolo de papelsistema. <ol><li> Coloque o número necessário de grãos de milho em um copo de vidro esterilizado. </li><li> Adicione 100 ml de solução de esterilização (6% NaOCl em água) (ATENÇÃO: Use exaustor). </li><li> Adicionar uma barra de agitação magnética e colocar o copo num agitador magnético de agitação a baixa velocidade (aproximadamente 250 rpm) a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Lavar cinco vezes durante 5 min, substituindo a solução com 100 ml de água estéril fresco. </li></ol></li><li> Semeadura do milho Sementes <ol><li> Calçar luvas para reduzir o risco de contaminação e tomar um rolo de toalhas de papel. </li><li> Rasgue dois trechos de papel toalha de mão com um comprimento total de duas folhas (aproximadamente 92 centímetros x 24 cm) e coloque-os em cima uns dos outros em uma superfície limpa (Figura 2A). </li><li> Dobrar as folhas dobrar ao longo do comprimento (cerca de 92 cm x 12 cm) (Figura 2A). </li><li> Use uma pinça para distribuir 10 núcleos em aproximadamente 2 cm da parte superior sobre tele todo o comprimento do papel, enquanto mantendo um espaço intermédio de 8 cm entre cada núcleo e 8 cm livre em ambas as extremidades (Figura 2B). Certifique-se a radícula do kernel está voltada para baixo e para o papel (Figura 2B). </li><li> Rolo delicadamente o papel ao longo do comprimento, mantendo as sementes no lugar (Figura 2B). Para facilitar o rolamento, é opcional a primeira pulverizar o papel com água estéril. </li><li> Coloque os rolos de papel em tubos de vidro esterilizados de cerca de 6 cm de diâmetro e 14 cm de altura (por exemplo, 250 ml tubos de centrífuga) e colocá-los em um rack (Figura 2C). </li></ol></li><li> A indução de raízes laterais em Maize <ol><li> Prepare uma solução a 50 mM estoque NPA (dissolvido em DMSO) (ATENÇÃO: Usar luvas). </li><li> Para cada tubo, fazer uma solução 50 fiM NPA adicionando 125 ul da solução de estoque 50 mM de ANP a 125 ml de água estéril num recipiente de vidro esterilizado. </li><li> Misture bem eColoque 125 ml de uma solução a 50 uM ANP sobre o rolo de papel no tubo. O rolo de papel irá absorver a solução e tornar-se completamente encharcado. Nota: Ao usar rolos de papel e tubos com outras dimensões, ajustar o volume em conformidade. O líquido deve chegar na metade do tubo para garantir a absorção suficiente. </li><li> Coloque o sistema de rolo de papel em uma câmara de crescimento durante três dias (27 ° C, luz contínua, 70% de humidade relativa). Certifique-se de que os rolos de papel permanecer embebido através da adição de solução adicional NPA 50 uM, uma vez que a solução evapora-se ao longo do tempo (Figura 2D). DIA 4 </li><li> Prepare uma solução a 50 mM NAA estoque (dissolvido em DMSO) (ATENÇÃO: Usar luvas). </li><li> Para cada tubo, preparar uma solução de NAA 50 uM por adição de 125 ul de estoque a 50 mM a NAA 125 ml de água estéril num recipiente de vidro esterilizado. </li><li> Aperte delicadamente a maior parte do NPA solução remanescente dos rolos de papel e colocar om em água estéril durante 5 min para lavá-lo para fora (CUIDADO: Use luvas). Espremer suavemente a maior parte da água a partir dos rolos de papel. Repita este passo de lavagem três vezes. </li><li> Misture bem e despeje a solução NAA 50 mM ao longo dos rolos de papel nos tubos. Certifique-se de que eles estão completamente encharcado. </li><li> Colocar o sistema de rolo de papel na câmara de crescimento (27 ° C, a luz contínua, 70% de humidade relativa) durante a duração desejada após a indução. </li></ol></li><li> A indução de raízes laterais em raízes adventícias coroa de milho Nota: O IRIs como descrito acima induz raízes laterais na raiz principal. No entanto, em milho e outras monocotiledôneas, a raiz primária e as raízes seminais embrionárias, juntamente com as suas raízes laterais, são principalmente importante durante o desenvolvimento de mudas. Numa fase posterior no crescimento das plantas, as raízes adventícias pós-embrionárias surgir na haste e também desenvolver raízes laterais para formar um novo sistema radicular 16. O IRIs também pode ser usadod para induzir raízes laterais sobre essas raízes adventícias coroa pós-embrionárias, seguindo alguns pequenos ajustes para a IRIs na raiz primária embrionário. <ol><li> Para fazer com que os rolos de papel, criar um sanduíche de papéis com, respectivamente, duas camadas de papel toalha de mão sobre o lado exterior, e duas camadas de papel de germinação dentro. Coloque os grãos esterilizados (ver passos 2.1 e 2.2), entre as duas folhas de papel de germinação. Papel de germinação, em comparação com papel toalha de mão, será menos propenso a ser penetrado por pêlos radiculares e das raízes laterais, o que fará a abertura da rolos de papel mais fácil depois. Por outro lado, as duas camadas exteriores de papel toalha de mão irá facilitar a absorção do líquido. </li><li> Insira os rolos em 700 ml tubos de vidro e despeje água estéril sem NPA sobre eles. Certifique-se de que eles estão completamente encharcado. </li><li> Germinar as sementes esterilizadas no gabinete do crescimento (ver passo 2.4.9). </li><li> Crescer as mudas até as raízes adventícias coroacomeçam a surgir (6 dias para o B73). Certifique-se os rolos de papel são mantidos úmido em todos os momentos por adição de água estéril, quando necessário. </li><li> Transferir para uma solução a 25 uM NPA durante 4 dias (ver passos 2.4.1 a 2.4.4), seguido por uma indução semelhante de iniciação de raízes laterais, substituindo a solução com uma solução NPA NAA 50 uM após uma etapa de lavagem (ver passo 2.4 0,5 a 2.4.9). </li></ol></li></ol>

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<li>Wang, S., Taketa, S., Ichii, M., Xu, L., Xia, K., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+root+formation+in+rice+%28Oryza+Sativa.+L.%29%3A+differential+effects+of+indole-3-acetic+acid+and+indole-3-butyric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Growth+Regul%22%5BJournal%5D)">Lateral root formation in rice (Oryza Sativa. L.): differential effects of indole-3-acetic acid and indole-3-butyric acid.</a> Plant Growth Regul. 41, 41-47 (2003).</li>
<li>Martinez-de la Cruz, E., Garcia-Ramirez, E., Vazquez-Ramos, J. M., Reyes de la Cruz, H., Lopez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxins+differentially+regulate+root+system+architecture+and+cell+cycle+protein+levels+in+maize+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings.</a> J Plant Physiol. 176, 147-156 (2015).</li>
<li>Beyer, E. M., Morgan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ethylene+on+uptake%2C+distribution%2C+and+metabolism+of+indoleacetic+acid-1-14C+and+-2-14C+and+naphthaleneacetic+acid-1-14C%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of ethylene on uptake, distribution, and metabolism of indoleacetic acid-1-14C and -2-14C and naphthaleneacetic acid-1-14C.</a> Plant Physiol. 46, 157-162 (1970).</li>
<li>Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mechanisms+controlling+uptake+and+accumulation+of+2%2C4-dichlorophenoxy+acetic+acid%2C+naphthalene-1-acetic+acid%2C+and+indole-3-acetic+acid+in+suspension-cultured+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells.</a> Planta. 198, 532-541 (1996).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

No protocolo de Arabidopsis IRIs, é importante apenas para transferir as plântulas que cresceram inteiramente em contacto com o meio de crescimento contendo NPA. Isto assegura que a iniciação de raízes laterais é bloqueado ao longo de todo o comprimento da raiz. A fim de evitar ferir as plântulas durante a transferência, os braços das pinças curvas pode ser ligado sob os cotilédones de plântulas a. Após a transferência, certifique-se de que as raízes de mudas estão em contacto suficiente com o meio agar contend...

O sistema radicular é crucial para o crescimento da planta, uma vez que garante ancoragem e absorção de água e nutrientes do solo. Uma vez que a expansão de um sistema radicular baseia-se principalmente na produção de raízes laterais, a iniciação e formação têm sido amplamente estudados. Raízes laterais são iniciados em um subconjunto específico de células periciclo, chamados de células fundadoras 1. Na maior parte das dicotiledóneas, tais como Arabidopsis thaliana, estas células estão localizados nos pólos protoxilema 2, ao passo que em monocotiledóneas, como o milho, que são encontrados nos pólos 3 do floema. Fundador células são marcadas por um aumento da resposta auxina 4, seguido pela expressão de genes do ciclo celular específicas (por exemplo, a ciclina B1; 1 / CYCB1; 1), após o que eles passam por uma primeira rodada de divisões anticlinais assimétricas 5. Após uma série de divisões e anticlinal periclinal coordenados, um primórdio raiz lateral é formado, que finalmente irá emergir como um umraízes laterais utonomous. O local e hora do início de raízes laterais não são, porém previsível, uma vez que estes eventos não são nem abundante nem sincronizados. Esta situação impede o uso de abordagens moleculares, como transcriptomics para estudar este processo. Para combater isso, um lateral Sistema Inducible Root (IRIs) foi desenvolvido 6, 7. Neste sistema, as mudas são tratados primeiro com N -1-naphthylphthalamic (NPA), que inibe o transporte de auxina e acumulação, consequentemente bloqueando iniciação de raízes laterais 8. Por posteriormente a repicagem em meio contendo auxina sintética ácido acético 1-naftaleno (NAA), toda a camada periciclo responde aos níveis elevados de auxina assim maciçamente raiz iniciar divisões celulares laterais indutores 6. Como tal, este sistema leva a rápidas, síncronas e extensas iniciações raízes laterais, permitindo fácil recolha de amostras de raízes enriquecido para um determinado estádio da tardedesenvolvimento radicular ral. Posteriormente, estas amostras podem ser utilizadas para determinar os perfis de expressão de todo o genoma durante a formação de raízes laterais. O IRIs rendeu conhecimento já significativo sobre a iniciação de lateral de raiz em Arabidopsis e milho 13/09, mas a necessidade de aplicar este sistema para outras espécies de plantas torna-se mais evidente à medida que mais genomas são sequenciados e há um crescente interesse de transferir conhecimento para importante econômica espécies. Aqui, os protocolos detalhados de Arabidopsis e de milho são dadas LRISs. Em seguida, um exemplo do uso do sistema é fornecida, pelo que ilustra como os dados obtidos com o transcriptômica IRIs milho pode ser utilizado para identificar homólogos funcionais que têm uma função conservada durante a iniciação de raízes laterais em diferentes espécies de plantas. Finalmente, as orientações para optimizar a IRIs são propostos para outras espécies de plantas.

<table><tbody><tr><td><forte>ARABIDOPSIS LRIS</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Sementes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sementes</td><td></td><td></td> de Arabidopsis <td>Col-0 ecótipo</td></tr><tr><td><forte>Esterilização a gás de sementes</tubos de</td> microcentrífuga forte><td></td><td></td><td></td></tr>forte <tr><td>1,5 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 125.215</td><td>Eppendorf microtubos 3810X,</td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga PCR clean 2 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 120.094</td><td>Eppendorf Safe-Lock tubos de microcentrífuga</td></tr><tr><td>ácido clorídrico</td><td>Merck KGaA</td><td>1.003.171.000</td><td>37% (fumegante) para análise EMSURE ACS,ISO,Reag. </td></tr><tr><td>Dessecador de vidro</td> Ph Eu <td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Pyrex</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>copo de vidro</td></tr> caixa <tr><td>de tubos de microcentrífuga de plástico ou suporte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Esterilização de sementes com alvejante</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Chem-Lab nv</td><td>CL00.0505.1000</td><td>Etanol, abs. 100% p.a. diluir a 70%</td></tr><tr><td>hipoclorito de sódio (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>água</td><td></td><td></td><td></td> estéril</tr><tr><td><forte>Meio de crescimento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige e mistura de sal Skoog</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M0221-0050</td><td></td></tr><tr><td>mio-inositol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>ácido 2- (N-morfolino) etanossulfônico (MES)</td> <td>DUCHEFA Biochemie BV</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>sacarose</td><td>VWR, Internation LLC</td><td>27483.294</td><td>D(+)-sacarose Ph. Eur.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>1050211000</td><td>pellets para análise (máx. 0,002% Na) EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Plant Tissue Culture Agar</td><td>LabM Limited</td><td>MC029</td><td></td></tr><tr><td>Produtos químicos de indução de raiz lateral</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-ácido naftilftalâmico (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>Nº N0926.0250</td><td>10 &micro; M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>1-naftaleno ácido acético (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>Nº N0903.0050</td><td>10 &micro; M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>Fazendo uma malha para transferência</forte></td>malha de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nylon</td><td>Prosep byba</td><td></td><td>Malha de nylon sintético 20 &micro; m</td></tr><tr><td>Manuseio de semeadura e mudas</placas de placa de Petri quadradas></td><td></td><td></td><td></td>fortes</tr> <tr><td></td><td>GOSSELIN</td><td>BP124-05</td><td>12 x 12 cm</td></tr><tr><td>50 ml tubos DURAN</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>CLS430304</td><td>Corning&nbsp; Tubos de centrífuga de 50 ml</td></tr><tr><td>drigalski</td><td>Carl Roth</td><td>K732.1</td><td></td></tr><tr><td>pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cortada pontas de pipeta</td><td>Daslab</td><td>162001X</td><td>Universal 200, corte 5 mm da ponta antes de autoclavar</td></tr><tr><td>fita respirável&nbsp;</td><td>3M Deutschland GmbH</td><td>cat. n.º 1530-1</td><td></td></tr><tr><td>pinças</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Pinças Dumont tipo a nº 5; Pinças Dumont tipo e nº 7</td></tr><tr><td><forte>Condições de crescimento</forte>sala de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>crescimento</td><td></td><td></td><td>21 &deg; C, contínuo leve</td></tr><tr><td><forte>Materiais</forte></td><td><forte>Empresa</forte></td><td><forte>Catálogo</forte></td><td><forte>Comentários</forte></td></tr><tr><td><forte>MILHO LRIS</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Sementes</forte></td>Grãos <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> de milho <td>B-73</td></tr><tr><td><forte>Esterilização de grãos com alvejante</</td>copo <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> > vidro forte<tr><td>&nbsp;</td><td>Fiers nv/sa</td><td>C267.1</td><td></td></tr><tr><td>hipoclorito de sódio (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>água</td><td></td><td></td><td></td> estéril</tr><tr><td><forte>Produtos químicos de indução da raiz lateral</ácido</td> N-1-naftilftalâmico (><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>Nº N0926.0250</td><td>50 &micro; M (raiz primária do milho), 25 &micro; M (raiz adventícia do milho)</td></tr><tr><td>1-naftalenoacético</td><td></td><td>Nº N0903.0050</td><td>50 &micro; M (milho)</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>Manuseio de semeadura e mudas</td>paper toalhas de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mão</td><td>Kimberly-Clark Professional*</td><td>6681</td><td>SCOTT Toalhas de Mão - Rolo / Branco; tamanho da folha (24 x 46 cm)</td></tr><tr><td>papel de germinação de sementes</td><td>Anchor Paper Company</td><td></td><td>10 X 15 38# papel de germinação de sementes</td></tr><tr><td>pinças</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Pinças Dumont tipo a nº 5; Pinças Dumont tipo e nº 7</td></tr><tr><td>tubos (centrífuga)</td><td>SCHOTT DURAN</td><td>2160136</td><td>aprox. 5,6 cm de diâmetro e 14,7 cm de altura&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de 700 ml</td><td>DURAN GROUP</td><td>213994609</td><td>cilindros, tubo de pé redondo, D 60&nbsp; x 250</td></tr><tr><td>rack</td><td></td><td></td><td>para tubos de milho,</td></tr><tr><td>água</td><td></td><td></td><td></td> estéril</tr> caseira<tr><td><forte>Condições de crescimento</forte></td>armário <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> de crescimento <td>27 & graus; C, luz contínua, 70% de umidade relativa</td></tr></tbody></table>

lateral root inducible sistema no<em&gt; arabidopsis</em&gt; e milho

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

O desenvolvimento da raiz lateral contribui significativamente para o sistema radicular e, portanto, é crucial para o crescimento das plantas. O estudo da iniciação da raiz lateral é, no entanto, tedioso, porque ocorre apenas em algumas células dentro da raiz e de maneira imprevisível. Para contornar esse problema, um Sistema Induzível de Raiz Lateral (LRIS) foi desenvolvido. Ao tratar as plântulas consecutivamente com um inibidor de transporte de auxina e uma auxina sintética, a iniciação radicular lateral altamente controlada ocorre de forma síncrona na raiz primária, permitindo uma amostragem abundante de um estágio de desenvolvimento desejado. O LRIS foi desenvolvido pela primeira vez para Arabidopsis thaliana, mas também pode ser aplicado a outras plantas. Assim, foi adaptado para uso em milho (Zea mays). Uma visão geral detalhada das diferentes etapas do LRIS em ambas as plantas é fornecida. A combinação deste sistema com transcriptômica comparativa tornou possível identificar homólogos funcionais de genes de iniciação radicular lateral de Arabidopsis em outras espécies, conforme ilustrado aqui para a CICLINA B1; 1 (CYCB1; 1) gene do ciclo celular no milho. Finalmente, são discutidos os princípios que precisam ser levados em consideração quando um LRIS é desenvolvido para outras espécies de plantas.

Aplicação do IRIs executar comparativos transcriptómica do lateral Processo Root Iniciação Uma aplicação da IRIs é a comparação e a correlação dos perfis de expressão de genes durante a formação de raízes laterais em espécies diferentes. Transcriptomics Comparativos aproxima criar a possibilidade de identificar genes ortólogos envolvidas no processo de desenvolvimento de raízes laterais em espécies diferentes....

O Sistema Induzível de Raiz Lateral (LRIS) permite a indução síncrona de raízes laterais e é apresentado para Arabidopsis thaliana e milho.

Lateral Root Inducible sistema no<em&gt; Arabidopsis</em&gt; E Milho

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

O objetivo geral do sistema induzível de raízes laterais é induzir sincronicamente o início de raízes laterais em plantas por meio de tratamentos hormonais. As raízes das plantas são estruturas ocultas e sabidamente extremamente difíceis de estudar. Desenvolvemos um sistema in vitro que permite estudar o processo de iniciação de raízes laterais em nível citológico, histológico e molecular.De modo geral, cientistas que são novos neste método podem ter dificuldades porque as plantas não cresceram adequadamente em contato com o meio, o que impede uma indução homogênea das raízes laterais. A demonstração visual deste método auxilia em mostrar as etapas críticas que devem ser consideradas para garantir uma indução homogênea. Embora este sistema tenha sido originalmente desenvolvido em uma pequena planta, Arabidopsis, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como milho, arroz ou cevada.Para começar, aplique uma malha de náilon de 20 micrômetros ao meio de crescimento suplementado com NPA usando um par de pinças estéreis. Empurre suavemente a malha sobre o meio de crescimento usando um drigalski para garantir que ela esteja em bom contato com o meio. Em seguida, pressione levemente um palito estéril contra o ágar para criar uma superfície adesiva no palito.Use o palito para distribuir uniformemente um lote de sementes esterilizadas com gás nas placas preparadas. Sobre as placas com fita adesiva permeável e armazene-as a quatro graus Celsius, no escuro, por pelo menos dois dias e no máximo uma semana. Isso é necessário para a estratificação e garante a germinação sincronizada e eficiente.No terceiro dia, transfira as placas para a câmara de crescimento para dois dias de germinação, seguidos por três dias de crescimento em um ângulo de 80 a 90 graus. No oitavo dia, identifique as raízes que cresceram totalmente em contato com a malha e, ao contrário, as raízes que não estão em contato com a malha. Remova todas as plântulas cujas raízes não estão em contato com a malha.Transfira as malhas contendo as plântulas para placas suplementadas com 10 micromolar de NAA. Uma vez na placa, passe suavemente a malha sobre a superfície do meio, se necessário, para garantir que ela esteja em bom contato com o meio de crescimento. Para assegurar uma indução homogênea em todas as plântulas, é importante descartar as plântulas que não cresceram em contato com a malha em meio suplementado com NPA e passar suavemente a malha, se necessário, em meio suplementado com NAA.Selar as novas placas com fita respirável e colocá-las na câmara de crescimento em posição vertical pelo tempo desejado após a indução. Quando estiver pronto para coletar as amostras, use um bisturi para cortar os segmentos radiculares de uma só vez diretamente na malha e colete-os raspando suavemente a superfície da malha. Agora mostraremos alguns passos do sistema indutível de raízes laterais em milho.Inicie a esterilização dos grãos de milho colocando primeiro o número necessário de grãos em um béquer de vidro estéril. Em seguida, adicione 100 mililitros de hipoclorito de sódio a 6% em água ao béquer e coloque uma barra de agitação magnética. Posicione o béquer em um agitador magnético e agite em velocidade baixa por cinco minutos à temperatura ambiente.Remova cuidadosamente a solução de água sanitária. Substitua-a por 100 mililitros de água estéril fresca e enxágue os grãos durante cinco minutos. Repita este passo cinco vezes.Coloque um par de luvas e rasgue dois pedaços de papel toalha, colocando-os um sobre o outro em uma superfície limpa. Em seguida, dobre as folhas ao meio ao longo do comprimento. Utilize pinças para distribuir 10 grãos aproximadamente a dois centímetros do topo, ao longo de todo o comprimento do papel, mantendo uma distância de oito centímetros entre cada grão e deixando oito centímetros livres em ambas as extremidades.Certifique-se de que o radical do embrião esteja voltado para baixo e em direção ao papel. Enrole suavemente o papel ao longo do comprimento, mantendo as sementes no lugar. Pulverizar o papel com água estéril pode facilitar esta etapa, se necessário.Coloque os rolos em tubos de vidro esterilizados e reúna tubos adicionais no suporte. Despeje 125 mililitros de uma solução de NPA 50 micromolar sobre o rolo de papel no tubo. O rolo de papel absorverá a solução e ficará completamente encharcado.Coloque o sistema de rolo de papel em uma câmara de crescimento por três dias. Certifique-se de que os rolos de papel permaneçam embebidos durante a incubação, adicionando solução de NPA adicional conforme necessário. Para garantir uma indução homogênea do início da raiz lateral, é importante verificar se os rolos de papel permanecem umedecidos na solução de NPA, mas que as raízes não fiquem submersas no próprio líquido.Após três dias em NPA, a muda de milho apresenta um pequeno broto e uma raiz com aproximadamente dois a três centímetros. No quarto dia, esprema cuidadosamente a maior parte da solução restante de NPA dos rolos de papel e coloque os rolos em água estéril até que fiquem saturados. Após cerca de cinco minutos, esprema cuidadosamente a maior parte da água dos rolos de papel.Repita a etapa de lavagem três vezes. Após a lavagem final, remova a maior parte da água e coloque o papel novamente no tubo. Despeje uma solução de 50 micromolar de AIA sobre os rolos de papel nos tubos até que fiquem completamente encharcados.Em seguida, coloque o sistema de rolo de papel na câmara de crescimento pela duração desejada após a indução. Em comparação com plântulas da linhagem marcadora de resposta ao oxen pDR5-GUS que não foram cultivadas com NAA ou que foram cultivadas por uma hora com NAA, as plântulas cultivadas por duas horas com NAA exibem uma resposta ao oxen, que é um dos primeiros eventos que desencadeiam a iniciação de raízes laterais. Essas divisões começam a migrar para cima a partir da ponta, iniciando-se por volta de duas horas, e aumentam com a exposição prolongada ao NAA.Utilizando a linhagem marcadora do ciclo celular pCYCB1;1-Gus, as primeiras divisões celulares que levam à formação de raízes laterais podem ser observadas a partir de aproximadamente seis horas após o início do tratamento com NAA. Microarranjos e rt-PCR quantitativo podem ser utilizados para avaliar a expressão de diversos genes em diferentes regiões das raízes de Arabidopsis e milho durante a indução de raízes laterais. Tanto em Arabidopsis quanto em milho, quando as plantas crescem por um período mais longo, as divisões induzidas darão origem ao desenvolvimento e crescimento de raízes laterais.Como prova de conceito para o sistema em milho, aqui estão plântulas cultivadas sob diferentes condições para comparação. Plântulas cultivadas por 10 dias em água apresentam raízes laterais que não iniciaram de forma sincrônica e estão amplamente espaçadas ao longo do eixo. Plântulas cultivadas por 10 dias em NPA não contêm raízes laterais em absoluto.Plântulas cultivadas por três dias em NPA, seguidas por um tratamento com NAA, apresentam uma indução maciça e sincronizada de raízes laterais. Neste vídeo, mostramos como montar um sistema indutível de raízes laterais que se mostrou essencial na descoberta de novos conhecimentos fundamentais sobre o processo de ramificação radicular. Mostramos como isso funciona para Arabidopsis e milho, mas o método pode ser facilmente adaptado a outras espécies vegetais de escolha.Boa sorte.

lateral-root-inducible-system-in-arabidopsis-and-maize

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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