Sistema induzível de raiz lateral em Arabidopsis e milho

O objetivo geral do sistema induzível de raiz lateral é induzir de forma síncrona o início de raízes laterais em plantas usando tratamentos hormonais. As raízes das plantas estão escondidas e são conhecidas por serem extremamente difíceis de estudar. Desenvolvemos um sistema in vitro que permite estudar o processo de iniciação da raiz lateral em nível citológico, histológico e molecular.

Geralmente, os cientistas novos neste método podem ter dificuldades porque as plantas não cresceram em contato adequado com o meio, impedindo uma indução homogênea das raízes laterais. A demonstração visual deste método ajuda a mostrar as etapas críticas que devem ser levadas em consideração para garantir uma indução homogênea. Embora este sistema tenha sido originalmente desenvolvido em uma pequena planta Arabidopsis, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como milho, arroz ou cevada.

Para começar, aplique uma malha de náilon de 20 mícrons ao meio de crescimento suplementado com NPA usando uma pinça estéril. Empurre suavemente a malha no meio de crescimento usando um drigalski para garantir que esteja em bom contato com o meio. Em seguida, aperte um palito estéril no ágar para criar uma superfície pegajosa no palito.

Use o palito para distribuir uniformemente um lote de sementes esterilizadas a gás nas placas preparadas. Sele as placas com fita adesiva respirável e guarde-as a quatro graus Celsius no escuro por pelo menos dois dias e no máximo uma semana. Isso é necessário para a estratificação e garante uma germinação sincronizada e eficiente.

No terceiro dia, mova as placas para a sala de crescimento por dois dias de germinação, seguidos por três dias de crescimento em um ângulo de 80 a 90 graus. No oitavo dia, identifique as raízes que cresceram inteiramente em contato com a malha e, ao contrário, as raízes que não estão em contato com a malha. Remova todas as mudas cujas raízes não estão em contato com a malha.

Transfira as malhas contendo mudas para placas suplementadas com 10 ANA micromolares. Uma vez na placa, deslize a malha sobre a superfície do meio, se necessário, para garantir que ela esteja em bom contato com o meio de crescimento. Para garantir uma indução homogênea em todas as mudas, é importante descartar as mudas que não cresceram em contato com a tela em meio suplementado com NPA e desnatar adequadamente a tela, se necessário, em meio suplementado com NAA.

Sele as novas placas com fita respirável e coloque-as na sala de crescimento na posição vertical pelo tempo desejado após a indução. Quando estiver pronto para coletar as amostras, use um bisturi para cortar os segmentos de raiz de uma só vez diretamente na malha e aproveite-os raspando suavemente a superfície da malha. Mostraremos agora algumas etapas do sistema induzível da raiz lateral no milho.

Comece esterilizando os grãos de milho, colocando primeiro o número necessário de grãos em um copo de vidro estéril. Em seguida, adicione 100 mililitros de hipoclorito de sódio a 6% em água ao copo e adicione uma barra de agitação magnética. Coloque o copo sobre um agitador magnético e agite em velocidade baixa por cinco minutos à temperatura ambiente.

Remova suavemente a solução de alvejante. Substitua-o por 100 mililitros de água fresca estéril e enxágue os grãos por cinco minutos. Repita esta etapa cinco vezes.

Coloque um par de luvas e rasgue dois trechos de toalhas de papel de mão, colocando-os um em cima do outro em uma superfície limpa. Em seguida, dobre as folhas ao dobro do comprimento. Use uma pinça para distribuir 10 grãos a aproximadamente dois centímetros do topo, por todo o comprimento do papel, mantendo uma distância entre os espaços de oito centímetros entre cada grão e oito centímetros livres em ambas as extremidades.

Certifique-se de que o radical do kernel esteja voltado para baixo e em direção ao papel. Enrole suavemente o papel ao longo do comprimento, mantendo as sementes no lugar. Pulverizar o papel com água estéril pode facilitar essa etapa, se necessário.

Coloque os rolos em tubos de vidro esterilizados e combine tubos adicionais no rack. Despeje 125 mililitros de uma solução de NPA 50 micromolar sobre o rolo de papel no tubo. O rolo de papel absorverá a solução e ficará completamente encharcado.

Coloque o sistema de rolo de papel em um armário de crescimento por três dias. Certifique-se de que os rolos de papel permaneçam embebidos durante a incubação, adicionando solução NPA extra, conforme necessário. Para garantir a indução homogênea da iniciação lateral da raiz, é importante verificar se os rolos de papel permanecem hidratados em solução de NPA, mas se as raízes não estão submersas no próprio líquido.

Após três dias em NPA, a muda de milho tem um pequeno broto e uma raiz de aproximadamente dois a três centímetros. No quarto dia, esprema suavemente a maior parte da solução de NPA restante dos rolos de papel e coloque os rolos em água estéril até que fiquem saturados. Após cerca de cinco minutos, esprema suavemente a maior parte da água dos rolos de papel.

Repita a etapa de lavagem três vezes. Após o enxágue final, esprema a maior parte da água e coloque-a de volta no tubo. Despeje uma solução micromolar de 50 AN sobre os rolos de papel nos tubos até que fiquem completamente encharcados.

Em seguida, coloque o sistema de rolo de papel no gabinete de crescimento pela duração desejada após a indução. Em comparação com as mudas de linha de marcadores de resposta de bois pDR5-GUS que não cresceram em NAA ou cresceram por uma hora em NAA, as mudas cultivadas por duas horas em NAA mostram uma resposta de bois que é um dos primeiros eventos que desencadeiam a iniciação lateral da raiz. Essas divisões começam a subir a partir da ponta a partir de cerca de duas horas e aumentam com a exposição prolongada ao ANA.

Usando a linha de marcação do ciclo celular pCYCB1; 1-Gus, as primeiras divisões celulares que levam à formação de raízes laterais podem ser vistas a partir de cerca de seis horas após o início do tratamento com ANA. Microarrays e rt-PCR quantitativos podem ser usados para avaliar a expressão de vários genes nas diferentes regiões das raízes de Arabidopsis e milho durante a indução da raiz lateral. Tanto em Arabidposis quanto no milho, quando as plantas crescem por mais tempo, as divisões induzidas darão origem ao desenvolvimento e crescimento das raízes laterais.

Como prova de conceito para o sistema de milho, aqui estão as mudas cultivadas em diferentes condições para comparação. As mudas cultivadas por 10 dias na água têm raízes laterais que não iniciaram de forma síncrona e são amplamente espaçadas ao longo do eixo. As mudas cultivadas por 10 dias em NPA não contêm raízes laterais.

Mudas cultivadas por três dias em NPA, seguidas de um tratamento com ANA, apresentam uma indução maciça e sincronizada de raízes laterais. Neste vídeo, mostramos como configurar um sistema induzível de raiz lateral que se mostrou muito essencial na descoberta de novos insights fundamentais sobre o processo de ramificação radicular. Mostramos como funciona para Arabidopsis e milho, mas pode ser facilmente adaptado a outras espécies de plantas de sua escolha.

Boa sorte.