Dissolução dinâmico Nuclear Polarização Instrumentação para em tempo real enzimática Reaction Taxa de Medições por RMN

O objetivo geral deste experimento é acompanhar os processos enzimáticos em tempo real por polarização nuclear dinâmica por ressonância magnética nuclear aprimorada. A ressonância magnética no estado líquido aprimorada pela polarização nuclear dinâmica, DNP, pode ajudar a responder a questões-chave: como determinar, por exemplo, as taxas de transformação enzimática de um par de moléculas na célula ou in vivo sem ter que alterar esse par de moléculas de forma alguma. A instalação de nosso equipamento DNP de dissolução em nosso laboratório e a chegada aqui do Dr. Riccardo Balzan, PhD no Arnaud Comment Laboratory em Lausanne, é um grande passo em frente para nossa pesquisa.

O DNP aumenta significativamente a sensibilidade dos experimentos que podemos realizar em nossos espectrômetros de RMN de 500 megahertz. Este equipamento DNP foi o primeiro a ser instalado em França e gostaria de referir que, para tornar este equipamento funcional, estiveram envolvidos todos os membros da nossa equipa de RMN e gostaria de mencionar em particular Gildas Bertho, o nosso engenheiro de investigação, e Fatiha Kateb, a nossa maître de conferências. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a quantificação direta e em tempo real do substrato e seus derivados endógenos com uma resolução de tempo de segundos.

Para a solução polarizadora, prepare dois mililitros de uma solução de piruvato de sódio marcada com carbono 13 de 1,12 molar dopada com 33 milimolares do radical TEMPO em um volume de dois para um de água deuterada em etanol deuterado para observações de carbono 13. Diminua a temperatura do criostato de polarização nuclear dinâmica, ou DNP, por meio do procedimento de resfriamento clicando no botão de resfriamento na interface do software do criostato. Colete hélio líquido no criostato DNP através do procedimento de enchimento.

Clique no botão de enchimento na interface do software do criostato. Em seguida, coloque 300 microlitros da solução polarizadora otimizada no recipiente de amostra fornecido com o polarizador DNP. Congele o recipiente de amostra com a amostra dentro, mergulhando-o suavemente em um banho de nitrogênio líquido.

Elimine o nitrogênio líquido que possa estar presente no recipiente de amostra após o procedimento de congelamento, extraindo o recipiente de amostra do banho de nitrogênio líquido e girando-o de cabeça para baixo. Em seguida, insira a amostra no criostato inserindo primeiro o recipiente de amostra no suporte de amostra. Em seguida, coloque o sample titular no criostato principal antes de inserir a guia de ondas do micro-ondas no sample suporte.

Abaixe a temperatura do criostato iniciando o procedimento de resfriamento de um Kelvin. Clique no botão de resfriamento Kelvin na interface do software do criostato. Ligue a fonte de micro-ondas e irradie a amostra clicando no botão de ativação de micro-ondas na interface do software do criostato.

Desconecte o cabo coaxial do canal de detecção do console NMR da bobina do espectrômetro girando o conector no sentido anti-horário em 90 graus e puxando-o. Conecte o cabo coaxial do canal de detecção ao conector coaxial da bobina de RMN do criostato. Em seguida, insira o conector macho do cabo do console de RMN no conector fêmea da bobina de RMN do criostato, prestando atenção ao pino de orientação.

Empurre com firmeza e gire o conector no sentido horário em 90 graus. Meça o sinal térmico de RMN no estado sólido no local do criostato usando uma sequência simples de aquisição de pulso com pulsos de baixo ângulo de inversão não calibrados repetidos em um intervalo de t igual a cinco minutos. Depois de configurar a medição, escreva zg na linha de comando do software e pressione enter no teclado.

Depois de iniciar o procedimento de polarização, meça o sinal de RMN aprimorado com DNP no estado sólido com o mesmo procedimento e condições usadas para a medição do sinal térmico. Desconecte o cabo coaxial do canal de detecção do console NMR da bobina NMR do criostato girando o conector no sentido anti-horário em 90 graus e puxando-o. Em seguida, conecte o cabo coaxial do canal de detecção ao conector coaxial da bobina do espectrômetro.

Insira o conector macho do cabo do console de RMN no conector fêmea da bobina do espectrômetro, prestando atenção no pino de orientação. Empurre com firmeza e gire o conector no sentido horário em 90 graus. Preparar recentemente uma solução de LDH de músculo de coelho a uma unidade por mililitro em tampão de reacção com 20 microgramas por mililitro de albumina de soro bovino.

Em seguida, misture 478 microlitros de tampão de reação, 2 microlitros de solução de LDH e 20 microlitros de água deuterada para permitir a estabilização do campo do espectrômetro ou travamento. Em seguida, coloque o volume da solução de 500 microlitros em um tubo de RMN de 5 milímetros. Conecte o tubo de transferência a um dispositivo de injeção automatizado e personalizado que separa a solução hiperpolarizada do gás hélio usado para transferência.

O dispositivo fornece automaticamente 500 microlitros de solução hiperpolarizada no tubo de amostra. Antes da dissolução, coloque o tubo de RMN de cinco milímetros contendo 500 microlitros de amostra no isocentro do espectrômetro de RMN de 11,74 tesla. Insira 5 mililitros de água deuterada na caldeira de dissolução.

Pressurize e aqueça a água deuterada por meio do fio resistivo até atingir uma temperatura de aproximadamente 180 a 200 graus Celsius clicando no botão preparar aquecedor na interface do software do criostato. Clique no botão SS Operations na interface do software do criostato. Em seguida, remova a guia de micro-ondas do inserto de dissolução.

Deslize o inserto de dissolução para baixo no porta-amostras. O inserto de dissolução deve atingir a parte inferior do porta-amostras e deve ser empurrado com firmeza para fazer uma conexão estanque com o recipiente de amostra para evitar vazamento de água deuterada no criostato. Pressione o gatilho de hardware para iniciar a sequência de dissolução, uma sequência cronometrada predeterminada de operações de válvulas pneumáticas.

Logo após a dissolução, o dispositivo de injeção mistura 500 microlitros de solução hiperpolarizada com a amostra colocada no espectrômetro de RMN. Após a dissolução, meça o sinal hiperpolarizado de RMN da amostra no espectrômetro por uma série de sequências de aquisição de pulso de ângulo de inversão de 10 graus espaçadas por 1,5 segundos para acompanhar a progressão da magnetização do substrato e do produto. Depois de configurar a medição, escreva zg na linha de comando do software e pressione enter.

Uma vez que a magnetização esteja totalmente relaxada, meça o sinal térmico de RMN por uma série de sequências de aquisição de pulso de ângulo de inversão de 90 graus espaçadas por cerca de três minutos, correspondendo a cerca de 3T1. Depois de configurar a medição, escreva zg na linha de comando do software e pressione a tecla Enter. Aqui, o curso de tempo dos espectros obtidos a partir de pulsos repetidos de ângulo de inversão de 10 graus mostra a sensibilidade e a resolução de tempo da técnica.

Após a identificação do pico do substrato do piruvato e do produto de lactato, a quantificação é realizada por meio da integração de sinal dos metabólitos. A atividade enzimática é determinada a partir do curso do tempo do sinal do produto, ajustando-se a um modelo linear. Para validar a medição, a mesma quantidade é avaliada pela taxa de reação inicial, a partir da razão de sinais de produto e substrato.

Uma vez dominada, uma medição completa da atividade enzimática pode ser realizada em cerca de duas horas se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão de como produzir um substrato altamente polarizado para RMN, injetá-lo em uma solução contendo uma enzima e acompanhar a atividade enzimática usando RMN aprimorada por DNP. Ao tentar este procedimento, é importante preparar cuidadosamente a solução enzimática com enzima fresca e co-substratos e evitar qualquer bolha de ar no tubo de amostra.

Com o desenvolvimento da ressonância magnética aprimorada por DNP no estado líquido, os pesquisadores agora podem explorar a absorção do substrato e sua transformação enzimática dentro de vários tipos de células, medindo a taxa de formação do produto. Não se esqueça de que trabalhar com equipamentos criogênicos e campos magnéticos altos pode ser extremamente perigoso. Precauções, como usar proteções pessoais contra criogênios e verificar a ausência de objetos magnéticos, devem sempre ser tomadas ao realizar essas medições.

Ao contrário da RMN clássica, a RMN baseada em DNP de dissolução é limitada a uma janela de tempo experimental de no máximo minutos, dependendo do substrato e do estado de vida atual. Isso impede que se vá além de uma espectroscopia D. A RMN DNP de dissolução precisa de desenvolvimento para trazê-la ao nível de versatilidade da RMN multidimensional clássica.