Name: Dissolução dinâmico Nuclear Polarização Instrumentação para em tempo real enzimática Reaction Taxa de Medições por RMN (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Aprenda a monitorar reações enzimáticas em tempo real usando DNP e RMN de 500 MHz. Esta técnica aumenta a sensibilidade para quantificar substratos sem alterar as moléculas estudadas.

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Os autores agradecem o Dr. JJ van der Klink para a assistência na escolha e montagem dos equipamentos, bem como o Dr. F. Kateb e Dr. G. Bertho para discussões úteis. AC foi apoiado pela Swiss National Science Foundation (conceder PPOOP2_157547). Nós reconhecemos o financiamento de Paris Sorbonne Cité (RMN @ Com, DIM Analytics, Ville de Paris, a Fondation de la Recherche Médicale (FRM ING20130526708), eo Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK. Nossa equipe é parte de programas Equipex Paris-en-ressonância e CACSICE.

NOTA: Todas as análises dos dados foi realizada utilizando o software comercial. 1. Preparar a solução de polarização <ol><li> Preparar 2 ml de uma piruvato de sódio 1,12 M 13 marcado com C (Na + [CH3-CO- 13 COO] -, substrato) solução dopado com 33 mM de radical TEMPOL (4-hidroxi-2,2,6,6- tetrametilpiperidin-1-oxilo, agente de polarização) 4 em 2: 1 d 2 O / d 6 -etanol durante 13 observações C. CUIDADO: Tomando Precauções devem ser tomadas devido à natureza inflamável de d 6 -etanol. </li><li> Verifique se a concentração de radicais é o ideal em termos de polarização alcançado. <ol><li> Alterar ligeiramente a concentração de radicais de a solução no ponto 1.1 (por exemplo, para 30 mM ou 35 mM). </li><li> Determinar de forma iterativa o reforço de estado sólido (ver Passo 3) e encontrar a concentração radical que leva ao aperfeiçoamento máximo. </li></ol></li></ol> 2. Polarizatíon <ol><li> Abaixe a temperatura criostato DNP através do procedimento de cooldown. Clique no botão &quot;Recarga&quot; na interface do software criostato (Figura 2D). </li><li> Recolhe hélio líquido no criostato DNP através do procedimento de enchimento. Clique no botão &#39;enchimento&#39; na interface do software criostato (Figura 2D). </li><li> Colocar 300 ml da solução de polarização optimizado do Passo 1.1 no recipiente de amostra fornecido com o polarizador DNP. Congelar o recipiente da amostra com a amostra dentro imergindo-o suavemente em um banho de nitrogênio líquido. </li><li> Elimine o azoto líquido que possa estar presente no recipiente de amostra após o procedimento de congelação (Passo 2.3) por extracção do recipiente da amostra do banho de azoto líquido e rodando-a de cabeça para baixo. NOTA: Este passo é crucial para se obter uma dissolução completa da amostra (ver Passo 5). </li><li> Insira a amostra no criostato. NOTA: Este StEP, composto pelos seguintes sub-passo, deve ser realizada rapidamente (isto é, em menos de 10-20 segundos) para evitar que a amostra de fusão. <ol><li> Insira o recipiente da amostra no porta-amostras. Insira o suporte da amostra no principal inserção criostato. Insira o guia de ondas microondas no porta-amostras. </li></ol></li><li> Abaixe a temperatura criostato por iniciar o procedimento de 1 K de resfriamento. Clique no botão &#39;1K de resfriamento &quot;na interface do software criostato (Figura 2D). </li><li> Ligue a fonte de microondas em e irradiar a amostra. Clique no botão &#39;MW-ON &quot;na interface do software criostato (Figura 2D). </li></ol> 3. Medidas de RMN de estado sólido <ol><li> Desligue o cabo coaxial do canal de detecção de consola a partir da bobina de RMN espectrómetro pela rotação no sentido contrário ao conector de 90 ° e puxando-o. Ligue o cabo coaxial do canal de detecção para o conector coaxial da criostatoRMN bobina. Insira o conector macho do cabo de console NMR no conector fêmea da bobina criostato RMN, prestando atenção para o pino de orientação; empurre com firmeza e gire no sentido horário conector de 90 °. </li><li> Medir o sinal térmico NMR no estado sólido no local criostato usando uma seqüência de pulsos-acquire simples com pulsos flip-baixo ângulo calibrado-un repetidos com um intervalo de T = 5 min. Depois de configurar a medição, escreva na linha do software &#39;zg&#39; comando e pressione a tecla do teclado &#39;Enter&#39;. Consulte o manual de operação do espectrômetro de RMN para obter mais detalhes sobre a operação espectrômetro e configuração de medição. </li><li> Medir o sinal de NMR DNP-reforçada. Repetir as operações do passo 3.2 após o início do processo de DNP, conforme descrito na Seção 2. </li><li> Desligue o cabo de canal de detecção coaxial consola NMR da bobina RMN criostato girando o sentido anti-horário conector de 90 ° e puxando-o. Ligue o cabo coaxial da detecanaleta cção ao conector coaxial da bobina espectrómetro. Insira o conector macho do cabo de console NMR no conector fêmea da bobina de espectrómetro, prestando atenção para o pino de orientação; empurre com firmeza e gire no sentido horário conector de 90 °. </li></ol> 4. Otimize a homogeneidade do magneto principal Field ( &#39;calço&#39;) <ol><li> Colocar no espectrómetro de um tubo contendo 500 jil de mistura produzidos nas experiências anteriores (isto é, após o passo 6.2). </li><li> Execute RMN espectrômetro de calços pela variação da corrente nas bobinas de gradiente shimming procurando pelo máximo &#39;bloquear&#39; sinal de deutério. Selecione a bobina shimming relevante pressionando o botão correspondente na consola RMN. <ol><li> Gire o botão no console NMR para determinar o sentido de rotação que aumenta o sinal de bloqueio. Continue a girar até que o sinal atinge um máximo. Selecione outra bobina de calços e repita o un maximizaçãoaté um máximo local para todas as bobinas shimming é encontrado. Consulte o manual de operação do espectrômetro de RMN para mais detalhes. No final, remover a amostra utilizada para o bloqueio. </li></ol></li></ol> 5. Dissolução <ol><li> Inserir 5 mL de D 2 O na caldeira de dissolução da pastilha. Pressurizar e aquecer a D 2 O por meio do fio resistivo até t ≈ 180-200 ° C é atingida. Clique no botão &quot;Prepare Heater &#39;na interface do software criostato (Figura 2D). </li><li> Após conclusão do procedimento de polarização da amostra (por exemplo, depois de 3 T DNP), pressurizar o criostato ligeiramente acima da pressão ambiente. Clique no botão &#39;Operações SS &quot;na interface do software criostato (Figura 2D). Remover o guia de micro-ondas a partir da inserção de dissolução. </li><li> Deslize a inserção de dissolução (Figura 3B) para baixo no suporte de amostra (Figura 3A-C). A inserção de dissolução tem de atingir a parte inferior do suporte de amostra e deve ser empurrada firmemente para efectuar uma ligação estanque com o recipiente da amostra, a fim de evitar D 2 O vazamento no criostato. </li><li> Premir o gatilho de hardware (Figura 3C-H) para iniciar a sequência de dissolução, uma sequência cronometrada pré-determinado de operações de válvulas pneumáticas. </li></ol> 6. Injecção <ol><li> Antes de dissolução lugar um tubo de RMN de 5 mm, contendo 500 ul de amostra (por exemplo, D 2 O durante <img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> medição no Passo 7 ou LDH solução do passo 8 para as medições da actividade enzimática na etapa 9), no isocentro do t espectrómetro de RMN 11,74 (ver Passo 4). </li><li> Logo após a dissolução (Passo 5), misturar 500 ul de solução hiperpolarizado com a amostra colocado no espectrómetro de NMR no passo 6.1. <ol><li> Injeção Manual: recolher o hyperpolarizedsolução no final de um longo tubo de transferência de 2,5 M em um copo de vidro colocado na proximidade do íman espectrómetro de RMN. injectar manualmente 500 ul de solução hiperpolarizado no tubo da amostra por meio de um sistema de RMN capilar feito à medida. </li><li> automático de injecção: antes do processo de dissolução, ligar o tubo de transferência a um dispositivo de injecção automático feito à medida que separa a solução hiperpolarizado do gás hélio usado para a transferência. O dispositivo proporciona automaticamente a 500 ul de solução hiperpolarizado para o tubo de amostra. </li></ol></li></ol> Medição RMN 7. Líquido-state <ol><li> Após a dissolução, medir o sinal hiperpolarizado NMR a partir da amostra no espectrómetro por uma série de 10 ângulo de sequências de pulso-acquire ° aleta espaçadas por 1,5 seg para seguir a progressão da magnetização do substrato (A) e o produto (B). Depois de configurar a medição, escreva na linha do software &#39;zg&#39; comando e pressione a &amp; #39; Enter &#39;tecla do teclado. Consulte o manual de operação do espectrômetro de RMN para obter mais detalhes sobre a operação espectrômetro e configuração de medição. </li><li> Uma vez que a magnetização está completamente relaxado (isto é, após t = 10 t 1), medir o sinal térmico de RMN de uma série de 90 ° ângulo da aleta de pulso-adquirir sequências espaçadas de t = 3 t 1 ≈ 3 min. Depois de configurar a medição, escreva na linha do software &#39;zg&#39; comando e pressione a tecla do teclado &#39;Enter&#39;. Consulte o manual de operação do espectrômetro de RMN para obter mais detalhes sobre a operação espectrômetro e configuração de medição. </li></ol> 8. Preparação de enzima contendo amostras (específico para a transformação de piruvato-a-lactato) <ol><li> Preparar o tampão de reacção com a seguinte receita: 50 mM de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NADH), ácido etileno-diamina-tetra-a 1 mM (EDTA), ditiotreitol 0,1 mM (DTT) em tampão fosfato 0,1 M, pH =7.0. </li><li> Prepara-se uma solução de LDH músculo de coelho a 1 U / ml preparada de fresco em tampão de reacção com 20 ug / ml de albumina de soro bovino, BSA. </li><li> Misturar 478 ul de tampão de reacção (Passo 8.1), 20 ul de D 2 O para permitir a estabilização do campo espectrómetro ( &quot;bloqueio&quot;) e solução de LDH 2 ul (Passo 7.2). </li><li> Colocar o volume de solução de 500 ul preparado no passo 8.3 para um tubo de RMN de 5 mm e posicionar o tubo para dentro do espectrómetro de RMN de 500 MHz. </li></ol> 9. completa enzimática Reaction Rate Procedimento de medição <ol><li> Preparar a amostra de polarização (Passo 1) e que polarizar (Passo 2). </li><li> Realizar calços no espectrómetro (Passo 4) e preparar a amostra enzimática (Passo 8). </li><li> Realizar a dissolução (Passo 5) e da injecção (Passo 6). </li><li> Medir uma série de sinais da amostra hiperpolarizado com 10 ° de ângulo de aleta pulsos aquisições espaçadas por 1,5 segundos (Passo 7). Este passo permite medir a hiperpolarizadodecaimento do sinal e o acúmulo de sinais de metabólitos. </li></ol> 10. Encaixe <ol><li> Para cada espectro adquirido na etapa 9.4, identificar os picos que correspondem aos substratos (A) e do produto (B), respectivamente, e integrá-los (determinação da área dos picos). Os picos integrais dar os sinais de evolução no tempo de magnetização (M (A, B) (t), ver equação 2). </li><li> Usando a solução da equação (2), determinar o valor de F = (A + R k ef ) A partir de um ajuste exponencial simples do sinal integrado substrato no passo 10.1. </li><li> Usando o valor F = (A + R k ef ) Determinado na etapa 10.2, determinar FEP K e R B a partir de um ajuste do sinal de produto H B (t) com a função obtida pela integração da equação (2). Consulte a seção de resultados Representante (Enzymatatividade ic e medições metabólicas) para obter detalhes sobre a correção de modelagem de reação, montagem e rf. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm concorrentes interesses financeiros

Os pontos críticos da dissolução experimento DNP RMN são: (i) o nível de polarização atingida para o substrato, o qual determina a concentração mais baixa do produto necessário para experiências, bem como o número de aquisições de sinal que podem ser realizadas e (ii) os tempos de vida de magnetização, em comparação com a duração da transferência entre a polarização e os locais de detecção e para a taxa de transformação do substrato. O sistema de injecção da configuração DNP dissolução aqui descrito permite a transferên...

<table><tbody><tr><td>Polarizador DNP</td><td>Vanderklink s.a.r.l (Suíça)</td><td></td><td>Criostato e equipamento eletrônico para polarização de amostras</td></tr><tr><td>Componentes do sistema de vácuo Vácuo</td><td>Edwards vacuum (França)</td><td>Vários</td><td> - configuração de bombeamento turbomolecular - configuração de bombeamento de membrana - sistema de bombeamento de raízes de alta capacidade - conexões e componentes de vácuo </td></tr><tr><td>DNP 3.35T Magnet</td><td>Bruker (França)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de RMN de 500 MHz</td><td>Bruker (França)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origem 8.0</td><td>OriginLab (EUA)</td><td></td><td>Software de análise de dados</td></tr><tr><td><forte>Produtos químicos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIRUVATO DE SÓDIO-1-13C, 99 ÁTOMOS % 13C</td><td>Sigma Aldrich (França)</td><td>490709</td><td></td></tr><tr><td>ETANOL-D6, ANIDRO, 99,5 ÁTOMOS % D</td><td>Sigma Aldrich (França)</td><td>186414</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 4-Hidroxi-TEMPO 97%</td><td>Sigma Aldrich (França)</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deutério</td><td>Sigma Aldrich (França)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>dinucleotídeo reduzido de nicotinamida adenina (NADH)</td><td>Sigma Aldrich (França)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido etileno-diaminaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich (França)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich (França)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tampão fosfato, pH&nbsp;=&nbsp; 7.0</td><td>Sigma Aldrich (França)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Enzima LDH em&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich (França)</td><td>L-2500</td><td></td></tr><tr><td>albumina de soro bovino, BSA</td><td>Sigma Aldrich (França)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

A principal limitação de investigações baseados-RMN é baixa sensibilidade. Isso leva para tempos de aquisição longos, evitando assim que as medições de RMN em tempo real de transformações metabólicas. Hiperpolarização através de dissolução DNP contorna parte da sensibilidade emite graças ao grande magnetização nuclear fora de equilíbrio decorrente da transferência de spin polarização de elétrons-to-núcleo. O sinal de RMN de alta obtido pode ser utilizado para monitorizar as reacções químicas em tempo real. A desvantagem de RMN hiperpolarizado reside na janela de tempo limitado disponível para a aquisição de sinal, o qual é geralmente da ordem de spin nuclear longitudinal constante tempo de relaxamento, T1, ou, em casos favoráveis, a fim de a constante de tempo de relaxação associada com a camisola de estado de núcleos acoplados, T LLS. captação celular de moléculas endógenas e taxas metabólicas podem fornecer informações essenciais sobre o desenvolvimento do tumor e resposta à droga. Nuestudos de RMN hiperpolarizados anteriores merosas demonstraram a relevância do piruvato como substrato metabólico para monitorar a atividade enzimática in vivo. Este trabalho apresenta uma descrição detalhada da instalação experimental e métodos necessários para o estudo de reacções enzimáticas, em particular a taxa de piruvato-a-lactato de conversão na presença de lactato desidrogenase (LDH), por RMN hiperpolarizado.

ganhos de sinal de NMR usando dissolução DNP O efeito DNP consiste na transferência da alta polarização de rotações de electrões desemparelhados, tipicamente a partir de moléculas de radicais estáveis, para núcleos RMN-activas, sob irradiao com microondas da amostra. Os radicais livres mais usados ​​são TAM (OXO63) e TEMPOL. 4 procedimentos de polarização usando TEMPOL pode ser otimizado pelo &#39;polarização cruzada&#39;. 25 <p class="jove_content" fo:ke...

O aumento da sensibilidade proporcionado pela polarização nuclear dinâmica de dissolução (DNP) permite acompanhar os processos metabólicos em tempo real por RMN e RM. As características e desempenhos de uma configuração DNP de dissolução dedicada projetada para estudar reações enzimáticas são discutidas.

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The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

O objetivo geral deste experimento é acompanhar processos enzimáticos em tempo real por meio da ressonância magnética nuclear potencializada pela polarização nuclear dinâmica. A ressonância magnética no estado líquido potencializada pela polarização nuclear dinâmica, DNP, pode ajudar a responder perguntas fundamentais: como determinar, por exemplo, as taxas de transformação enzimática de um par de moléculas em células ou in vivo, sem precisar alterar esse par de moléculas de maneira alguma. A instalação do nosso equipamento de DNP por dissolução em nosso laboratório e a chegada aqui do Dr. Riccardo Balzan, doutor no Laboratório de Arnaud Comment em Lausanne, representa um grande avanço para a nossa pesquisa.O DNP aumenta significativamente a sensibilidade dos experimentos que podemos realizar em nossos espectrômetros de RMN de 500 megahertz. Este equipamento de DNP foi o primeiro a ser instalado na França e gostaria de mencionar que, para tornar este equipamento funcional, todos os membros da nossa equipe de RMN estiveram envolvidos, e gostaria de mencionar em particular Gildas Bertho, nosso engenheiro de pesquisa, e Fatiha Kateb, nossa maitre de conferences. A principal vantagem d

dissolution-dynamic-nuclear-polarization-instrumentation-for-real

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Este vídeo descreve a técnica de espectroscopia de ressonância magnética nuclear para estudar as interações proteína-proteína entre 15proteínas envoplakin mutantes e do tipo selvagem marcadas com N e a proteína vimentina não marcada. A interação bem-sucedida entre a envoplaquina do tipo selvagem e a vimentina leva a um extenso alargamento da linha e ao desaparecimento do pico nos espectros de RMN, enquanto a ausência de uma interação entre a envoplaquina mutada e a vimentina resulta em picos...

Ressonância Magnética Nuclear para Estudo de Interações Proteína-Proteína em Nível Atômico

Um simulador dinâmico multicompartimental é usado para simular alguma biologia de interesse para estudos metabólicos usando agentes de ressonância magnética hiperpolarizada.

O uso de um compartimento Multi-dinâmica única enzima Fantasma de Estudos de hyperpolarized agentes Ressonância Magnética

Um novo método de ressonância paramagnética eletrônica (EPR), rápidas digitalização EPR (RS-EPR), é demonstrado para 2D imagens espaciais espectral, que é superior à técnica tradicional de onda contínua (CW) e abre novos espaços para imagiologia in vivo. Os resultados são demonstrados a 250 MHz, mas a técnica é aplicável em qualquer frequência.

Rápida digitalização ressonância paramagnética eletrônica abre novos caminhos para criação de imagens fisiologicamente parâmetros importantes<em&gt; In Vivo</em

A polarização nuclear dinâmica com subsequente dissolução da amostra permitiu estudos em tempo real do metabolismo em sistemas biológicos. O piruvato de [1-13C]hiperpolarizado foi usado para estudar a atividade da lactato desidrogenase em uma linhagem celular de carcinoma de próstata in vitro.

hiperpolarizado 13 C Metabolic Espectroscopia de Ressonância Magnética e imagem

Descrevemos aqui um método para identificar fosforilações múltiplas de uma proteína intrinsecamente desordenada por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), usando a proteína Tau como estudo de caso. A Tau recombinante é isotopicamente enriquecida e modificada in vitro por uma quinase antes da aquisição e análise dos dados.

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas

Um protocolo para a preparação de 13C,15amostras de fungos e plantas N-etiquetados para investigações de polarização nuclear dinâmica (DNP) e espectroscopia NMR Solid-State multidimensional é apresentado.

Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State

Nós apresentamos um protocolo para medir a dependência do campo magnético do tempo do abrandamento da girar-estrutura de 13C-compostos enriquecidos, hyperpolarizado por meio da polarização nuclear dinâmica, usando o relaxometry Field-Cycled rápido. Especificamente, temos demonstrado isso com [1-13C] piruvato, mas o protocolo pode ser estendido para outros substratos hiperpolarizados.

Medindo a dependência do campo magnético do abrandamento da girar-estrutura de Hyperpolarizado [1-13C] piruvato

Aqui, é fornecida uma descrição detalhada do protocolo implementado no laboratório para aquisição e análise de perfis de dispersão de relaxamento de 15N por espectroscopia de solução NMR.

15 N CPMG Relaxation Dispersão para a Investigação da Dinâmica Conformacional de Proteínas na escala de tempo μs-ms

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) pode caracterizar a dinâmica estrutural da proteína de maneira específica do resíduo. Fornecemos um protocolo prático para registrar experimentos de relaxamento de RMN 15N R1 e R2 e {1H}-15N heteronuclear Overhauser effect (hetNOE), sensíveis à escala de tempo de picossegundos a nanossegundos.

Experimentos de relaxamento de RMN 15N para a investigação da dinâmica estrutural de proteínas de picossegundos a nanossegundos

Este protocolo integra um sistema de biorreator personalizado com espectroscopia de RMN ¹³C hiperpolarizada para medir o metabolismo do piruvato em tempo real em células vivas, melhorando a reprodutibilidade e a precisão cinética para estudos metabólicos e aplicações de triagem de medicamentos.

Detecção metabólica em tempo real em células vivas usando RMN hiperpolarizada de 13C

Aprenda a monitorar reações enzimáticas em tempo real usando DNP e RMN de 500 MHz. Esta técnica aumenta a sensibilidade para quantificar substratos sem alterar as moléculas estudadas.

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