Dissolução dinâmico Nuclear Polarização Instrumentação para em tempo real enzimática Reaction Taxa de Medições por RMN

O objetivo geral deste experimento é acompanhar processos enzimáticos em tempo real por meio da ressonância magnética nuclear potencializada pela polarização nuclear dinâmica. A ressonância magnética no estado líquido potencializada pela polarização nuclear dinâmica, DNP, pode ajudar a responder perguntas fundamentais: como determinar, por exemplo, as taxas de transformação enzimática de um par de moléculas em células ou in vivo, sem precisar alterar esse par de moléculas de maneira alguma. A instalação do nosso equipamento de DNP por dissolução em nosso laboratório e a chegada aqui do Dr. Riccardo Balzan, doutor no Laboratório de Arnaud Comment em Lausanne, representa um grande avanço para a nossa pesquisa.

O DNP aumenta significativamente a sensibilidade dos experimentos que podemos realizar em nossos espectrômetros de RMN de 500 megahertz. Este equipamento de DNP foi o primeiro a ser instalado na França e gostaria de mencionar que, para tornar este equipamento funcional, todos os membros da nossa equipe de RMN estiveram envolvidos, e gostaria de mencionar em particular Gildas Bertho, nosso engenheiro de pesquisa, e Fatiha Kateb, nossa maitre de conferences. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a quantificação direta e em tempo real do substrato e de seus derivados endógenos com uma resolução temporal de segundos.

Para a solução polarizante, prepare dois mililitros de uma solução de piruvato de sódio marcado com carbono 13, 1,12 molar, dopada com 33 milimolares do radical TEMPO, em uma proporção de dois para um de água deuteriorada para etanol deuteriorado, para observações de carbono 13. Reduza a temperatura do criostato de polarização nuclear dinâmica, ou DNP, mediante o procedimento de resfriamento, clicando no botão de resfriamento na interface de software do criostato. Colete hélio líquido no criostato DNP por meio do procedimento de enchimento.

Clique no botão de preenchimento na interface de software do criostato. Em seguida, coloque 300 microlitros da solução polarizante otimizada no recipiente de amostra fornecido com o polarizador DNP. Congele o recipiente de amostra com a amostra em seu interior imergindo-o suavemente em um banho de nitrogênio líquido.

Elimine o nitrogênio líquido que possa estar presente no recipiente da amostra após o procedimento de congelamento, removendo o recipiente da amostra do banho de nitrogênio líquido e girando-o de cabeça para baixo. Em seguida, insira a amostra no criostato inserindo primeiro o recipiente da amostra no suporte da amostra. Depois, coloque o suporte da amostra no encaixe principal do criostato antes de inserir a guia de onda do micro-ondas no suporte da amostra.

Reduza a temperatura do criostato iniciando o procedimento de resfriamento a um Kelvin. Clique no botão de resfriamento a um Kelvin na interface de software do criostato. Ligue a fonte de micro-ondas e irradie a amostra clicando no botão de micro-ondas ligadas na interface de software do criostato.

Desconecte o cabo coaxial do canal de detecção do console de RMN da bobina do espectrômetro girando o conector no sentido anti-horário em 90 graus e puxando-o. Conecte o cabo coaxial do canal de detecção ao conector coaxial da bobina de RMN do criostato. Em seguida, insira o conector macho do cabo do console de RMN no conector fêmea da bobina de RMN do criostato, prestando atenção ao pino de orientação.

Empurre firmemente e gire o conector no sentido horário em 90 graus. Meça o sinal térmico de RMN no estado sólido no local do criostato utilizando uma sequência simples de pulso-aquisição com pulsos de baixo ângulo de inclinação não calibrados, repetidos em intervalos de t igual a cinco minutos. Após configurar a medição, digite zg na linha de comando do software e pressione enter no teclado.

Após iniciar o procedimento de polarização, meça o sinal de RMN realçado por DNP no estado sólido utilizando o mesmo procedimento e condições empregados para a medição do sinal térmico. Desconecte o cabo coaxial do canal de detecção do console de RMN da bobina de RMN do criostato girando o conector no sentido anti-horário em 90 graus e puxando-o. Em seguida, conecte o cabo coaxial do canal de detecção ao conector coaxial da bobina do espectrômetro.

Insira o conector macho do cabo do console de RMN no conector fêmea da bobina do espectrômetro, prestando atenção ao pino de orientação. Empurre firmemente e gire o conector no sentido horário em 90 graus. Prepare recentemente uma solução de LDH de músculo de coelho a uma unidade por mililitro em tampão de reação com 20 microgramas por mililitro de albúmina sérica bovina.

Em seguida, misture 478 microlitros de tampão de reação, 2 microlitros da solução de LDH e 20 microlitros de água deuteriorada para permitir a estabilização do campo do espectrômetro, ou travamento. Em seguida, coloque o volume da solução de 500 microlitros em um tubo de RMN de 5 milímetros. Conecte o tubo de transferência a um dispositivo de injeção automatizado, feito sob encomenda, que separa a solução hiperpolarizada do gás hélio utilizado na transferência.

O dispositivo entrega automaticamente 500 microlitros de solução hiperpolarizada no tubo de amostra. Antes da dissolução, coloque o tubo de RMN de cinco milímetros contendo 500 microlitros de amostra no isocentro do espectrômetro de RMN de 11,74 tesla. Insira 5 mililitros de água deuteriorada no recipiente de dissolução.

Presurize e aqueça a água deuteriorada por meio do fio resistivo até que uma temperatura de aproximadamente 180 a 200 graus Celsius seja atingida, clicando no botão preparar aquecedor na interface de software do criostato. Clique no botão Operações SS na interface de software do criostato. Em seguida, remova o guia de micro-ondas do inserto de dissolução.

Deslize o inserto de dissolução para dentro do porta-amostras. O inserto de dissolução deve atingir o fundo do porta-amostras e precisa ser empurrado firmemente para estabelecer uma conexão hermética com o recipiente de amostra, evitando vazamento de água deuteriorada para o criostato. Pressione o gatilho de hardware para iniciar a sequência de dissolução, uma sequência cronometrada predeterminada de operações das válvulas pneumáticas.

Imediatamente após a dissolução, o dispositivo de injeção mistura 500 microlitros da solução hiperpolarizada com a amostra colocada no espectrômetro de RMN. Após a dissolução, meça o sinal hiperpolarizado de RMN da amostra no espectrômetro por meio de uma série de sequências de pulso-aquisição com ângulo de giro de 10 graus, espaçadas por 1,5 segundo, para acompanhar a evolução da magnetização do substrato e do produto. Após configurar a medição, digite zg na linha de comando do software e pressione enter.

Uma vez que a magnetização esteja completamente relaxada, meça o sinal térmico de RMN por meio de uma série de sequências de pulso-aquisição com ângulo de giro de 90 graus espaçadas por cerca de três minutos, correspondendo a aproximadamente 3T1. Após configurar a medição, digite zg na linha de comando do software e pressione a tecla enter. Aqui, a evolução temporal dos espectros obtidos a partir de pulsos repetidos com ângulo de giro de 10 graus mostra a sensibilidade e a resolução temporal da técnica.

Após a identificação do pico do substrato piruvato e do produto lactato, a quantificação é realizada por meio da integração dos sinais dos metabólitos. A atividade enzimática é determinada a partir da curva temporal do sinal do produto, ajustando-a com um modelo linear. Para validar a medição, a mesma quantidade é avaliada pela taxa inicial da reação, a partir da razão entre os sinais do produto e do substrato.

Uma vez dominado, um completo ensaio de atividade enzimática pode ser realizado em cerca de duas horas, se for executado corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender como produzir um substrato altamente polarizado para RMN, injetá-lo em uma solução contendo uma enzima e acompanhar a atividade enzimática utilizando RMN com DNP potencializada. Ao tentar este procedimento, é importante preparar cuidadosamente a solução enzimática com enzima fresca e cossubstratos, além de evitar qualquer bolha de ar no tubo da amostra.

Com o desenvolvimento da ressonância magnética realçada por DNP no estado líquido, os pesquisadores agora podem investigar a captação de substratos e sua transformação enzimática dentro de vários tipos de células, medindo a taxa de formação de produtos. Não se esqueça de que o trabalho com equipamentos criogênicos e campos magnéticos elevados pode ser extremamente perigoso. Precauções, como o uso de proteções pessoais contra criogênicos e a verificação da ausência de objetos magnéticos, devem sempre ser tomadas durante a realização dessas medições.

Diferentemente da RMN clássica, a RMN baseada em DNP por dissolução é limitada a uma janela temporal experimental de poucos minutos no máximo, dependendo do substrato e do estado fisiológico atual do organismo. Isso impede a realização de espectroscopias além da espectroscopia em uma dimensão. A RMN por DNP com dissolução necessita de desenvolvimento para alcançar o nível de versatilidade da RMN multidimensional clássica.