Name: Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a usar deleções monoalélicas mediadas por CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias de camundongo para estudar a regulação transcricional de genes e a função de enhancers específicos.

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Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório Mitchell pelas discussões úteis. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, pela Fundação Canadense para Inovação e pelo Ministério de Pesquisa e Inovação de Ontário (subsídios operacionais e de infraestrutura mantidos pela JAM).

<ol><li>Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+a+long-range+cis-regulatory+module+causes+complete+loss+of+limb-specific+Shh+expression+and+truncation+of+the+mouse+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb.</a> Development. 132 (4), 797-803 (2005).</li>
<li>Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+gene+control+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-range gene control and genetic disease.</a> Adv Genet. 61, 339-388 (2008).</li>
<li>Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+views+of+distant-acting+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic views of distant-acting enhancers.</a> Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome.</a> Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+identification+in+mouse+embryonic+stem+cells+using+integrative+modeling+of+chromatin+and+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features.</a> BMC Genomics. 13 (1), 152(2012).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+large-scale+genome-modified+mice+using+gRNA+and+CAS9+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 41 (20), e187(2013).</li>
<li>Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+erythroid-specific%2C+developmental-stage-independent+enhancer+far+upstream+of+the+human+%27beta-like+globin%27+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).</li>
<li>Amano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+dynamics+at+the+Shh+locus%3A+limb+bud-specific+differential+regulation+of+competence+and+active+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription.</a> Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+reveals+a+distal+super-enhancer+required+for+Sox2+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 9 (12), e114485(2014).</li>
<li>Canver, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+genomic+deletion+efficiency+mediated+by+clustered+regularly+interspaced+palindromic+repeats+%28CRISPR%29%2FCas9+nuclease+system+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).</li>
<li>Mlynarczyk-Evans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosomes+alternate+between+two+states+prior+to+random+X-inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation.</a> PLoS Biol. 4 (6), e159(2006).</li>
<li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li>
<li>Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+base+mispairs+by+Taq+DNA+polymerase%3A+implications+for+single+nucleotide+discrimination+in+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR.</a> Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).</li>
<li>Keane, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genomic+variation+and+its+effect+on+phenotypes+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation.</a> Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).</li>
<li>Yalcin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-based+characterization+of+structural+variation+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome.</a> Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+real-time+quantitative+PCR+for+the+analysis+of+cytokine+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels.</a> Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+effects+of+position+and+type+of+single+mismatch+on+single+base+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension.</a> J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
</ol>

Os autores leram as políticas de Jove dos conflitos de interesses e não têm conflitos de divulgar.

CRISPR / Cas9 tecnologia de edição genoma mediada fornece um método simples, rápido e barato para a modificação do genoma. O método aqui descrito para gerar e analisar eliminação monoalélicos potenciador para potenciador caracterização funcional tira vantagem de SNPs em células de ratinho F1. As vantagens deste tipo de abordagem são os seguintes: 1) as supressões potenciadoras monoalélicos não produzem efeitos de confusão que ocorrem quando um intensificador crítica é suprimida de ambos os alelos, isto é, uma g...

Elementos reguladores da transcrição são críticos para a sintonia fina espaço-temporais da expressão de genes durante o desenvolvimento e uma modificação destes elementos pode resultar em doença devido à expressão aberrante do gene 2. Muitas regiões associados à doença identificadas por estudos de associação de genoma de largura estão em regiões não codificantes e têm características de potenciadores da transcrição 3-4. Identificando potenciadores e combinando-os com os genes que regulam é complicado uma vez que são muitas vezes localizados vários quilobases de distância a partir dos genes que regulam e podem ser activados de um modo específico do tecido 5-6. Previsões Enhancer são comumente baseado em marcas de modificação das histonas, complexos mediador-cohesin e ligação de transcrição específicos do tipo de célula fatores 7-10. Validação dos intensificadores preditos é mais frequentemente feito por meio de um ensaio à base de vector em que o intensificador activa a expressão de um gene repórter 11-12. Estes dados fornecem vinformações aluable sobre o potencial de regulamentação de sequências potenciadoras putativos mas não revelam a sua função no seu contexto genómico endógeno ou identificar os genes que eles regulam. edição genoma serve como uma ferramenta poderosa para o estudo da função dos elementos reguladores da transcrição no seu contexto endógeno por análise por perda de função. Os avanços recentes na edição genoma, ou seja, a / Cas9 sistema de edição genoma CRISPR, facilitar a investigação da função genoma. O sistema / Cas9 CRISPR é fácil de usar e adaptável para muitos sistemas biológicos. A proteína Cas9 é direcionado para um site específico no genoma por um RNA guia (gRNA) 13. O complexo SpCas9 / gRNA digitaliza o genoma para a sua sequência genómica alvo que deve ser 5 &#39;para uma sequência adjacente protospacer motivo (PAM), NGG 14-15. o emparelhamento de bases do gRNA ao seu alvo, a 20 nucleótidos (nt) sequência complementar ao gRNA, activa a actividade de nuclease SpCas9 resultando numa DOUBLpausa e Strand (DSB) 3 pb a montante da sequência PAM. Especificidade é conseguido através de emparelhamento de base completa na região da semente do gRNA, a 6-12 nt ao lado do PAM; Por outro lado, não corresponde 5 &#39;da semente são geralmente tolerada 16-17. O DSB introduzido podem ser reparados tanto por a extremidade não-homóloga de união (NHEJ) a reparação do ADN ou homologia reparação dirigida (HDR) mechanisms.NHEJ reparação do ADN, muitas vezes cria inserção / deleção (indels) de alguns pb no local alvo que pode perturbar a grelha de leitura aberta (ORF) de um gene. Para gerar delecções maiores no genoma dois gRNAs, que flanqueiam a região de interesse, podem ser usados ​​18-19. Esta abordagem é particularmente útil para o estudo de potenciadores da transcrição aglomeradas em regiões de controlo local ou super-potenciadores, que são maiores do que melhoradores convencionais 9,18,20-22. Eliminações monoalélicos são um modelo valioso para estudar Regulamentação cis da transcrição. O chang observadoe no nível de transcrição após eliminação monoalélicos de um potenciador se correlaciona com o papel de que potenciador na regulação dos genes sem os efeitos de confusão que podem ocorrer quando a transcrição de ambos os alelos é afetado potencialmente influenciar a aptidão celular. Avaliando expressão reduzida é difícil no entanto, sem a capacidade de distinguir o excluído do alelo selvagem. Além disso, a genotipagem deleções em cada alelo sem a capacidade de distinguir os dois alelos é um desafio, em especial para grandes deleções de&gt; 10 kb até 1 Mb 23 em que é difícil para amplificar toda a região de tipo selvagem por PCR. A utilização de células ES F1 gerados pelo cruzamento de Mus musculus 129 com Mus castaneus permite que os dois alelos de ser diferenciadas por PCR 18,24 específico de alelo. O genoma híbrido nestas células facilita a eliminação específica alelo rastreio e análise de expressão. Em média, existe um SNP a cada 125 pb entre estes dois genomas, Proporcionando flexibilidade no desenho de primers para a expressão e genotipagem analisa. A presença de um SNP pode influenciar a temperatura de fusão do iniciador (T m) e especificidade alvo em amplificação em tempo real quantitativa PCR (qPCR) permitindo a discriminação dos dois alelos 25. Além disso, um desfasamento dentro da extremidade 3 &#39;do iniciador influencia grandemente a capacidade de ADN-polimerase para estender a partir do iniciador de amplificação de prevenir o alvo alelo indesejada 26. Descrito no seguinte protocolo é a utilização de células ES F1 para o alelo específico deleções potenciadoras de maior do que 1 kb e análise subsequente expressão que utilizam o sistema CRISPR / Cas9 edição genoma (Figura 1). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53552/53552fig1.jpg" /> Figura 1. Enhancer eliminação utilizando CRISPR / Cas9 para estudar cis -reglação da expressão de genes (A) células F1 ES gerados por um cruzamento entre Mus musculus 129 e Mus castaneus. são usadas para permitir a eliminação específica dos alelos. (B) Dois RNAs de guia (gRNA) são utilizados para induzir um grande deleção Cas9 mediada da região do potenciador. (C) Os conjuntos de iniciadores são utilizados para identificar grande mono- e bi-supressões alélicas. Os iniciadores de laranja são os primers dentro, os primers roxo são os iniciadores externos e os primers verdes são os iniciadores flanqueando gRNA. (D) As mudanças na expressão genética são monitorados através de qPCR alelo-específico. RFU denota unidades de fluorescência relativas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53552/53552fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Polimerase de DNA de alta fidelidade de Phusion</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>DNA polimerase de alta fidelidade usada na montagem de gRNA</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td>Uma sequência alvo é clonada neste vetor para criar o plasmídeo de gRNA</td></tr><tr><td>pCas9_GFP</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td>SpCas9 e EGFP otimizados para códon plasmídeo de co-expressão</td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Transfecção de Néon 100 &micro; L Kit</td><td>Life Technologies</td><td>MPK10096</td><td>Tecnologia de transfecção de microporador</td></tr><tr><td>prepGEM</td><td>ZyGEM</td><td>PT10500</td><td>reagente de extração de DNA genômico</td></tr><tr><td>Nucleo Spin Gel & Limpeza PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Kit Mini de Plasmídeo de Alta Velocidade</td><td>Geneaid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>Maxi Kit de Plasmídeo Livre de Endotoxinas&nbsp;</td><td>Geneaid</td><td>PME25</td><td></td></tr><tr><td>SYBR select mix para CFX</td><td>Life Technologies</td><td>4472942</td><td>reagente qPCR</td></tr><tr><td>iScript kit de síntese de cDNA</td><td>Bio-rad</td><td>170-8891</td><td>Reagente de transcrição reversa</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina com EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>PBS sem Ca/Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>13630080</td><td></td></tr><tr><td>BSA fração V (7,5%)</td><td>Life Technologies</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Eficiência Máxima Células competentes DH5&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ES células qualificadas</td><td></td><td>O FBS é submetido a um teste prévio em células ES de camundongo para pluripotência</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Não essencial aminoácido</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>Fita de vedação</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td>recipiente de congelamento de células sem álcool</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Biovision</td><td>1748-5</td><td>Inibidor para cultura de células F1 ES</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Invivogen</td><td>inh-pd32</td><td>Inibidor para cultura de células F1 ES</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>Inibidor para cultura de células F1 ES</td></tr></tbody></table>

gerando crispr / cas9 mediated monoalélicos eliminações para estudar a função enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Os intensificadores controlam a identidade celular regulando a expressão gênica específica do tecido de maneira independente de posição e orientação. Esses intensificadores geralmente estão localizados distalmente do gene regulado em regiões intergênicas ou mesmo dentro do corpo de outro gene. A natureza independente da posição da atividade do intensificador torna difícil combinar os intensificadores com os genes que eles regulam. A deleção de uma região intensificadora fornece evidências diretas da atividade do intensificador e é o padrão-ouro para revelar o papel de um intensificador na transcrição gênica endógena. Os métodos convencionais de deleção baseados em recombinação homóloga foram superados por avanços recentes na tecnologia de edição de genoma, que permitem mudanças rápidas e precisamente localizadas nos genomas de vários organismos modelo. A edição do genoma mediada por CRISPR/Cas9 pode ser usada para manipular o genoma em muitos tipos de células e organismos de forma rápida e econômica, devido à facilidade com que o Cas9 pode ser direcionado ao genoma por um RNA guia de um plasmídeo de expressão sob medida. A deleção homozigótica de elementos reguladores de genes essenciais pode levar à letalidade ou alterar o fenótipo celular, enquanto a deleção monoalélica de intensificadores transcricionais permite o estudo da cis-regulação da expressão gênica sem esse problema de confusão. Apresentado aqui é um protocolo para deleção mediada por CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias (ES) de camundongos F1 (Mus musculus129 x Mus castaneus). A deleção, triagem e análise de expressão monoalélica é facilitada por polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) entre os dois alelos que ocorrem em média a cada 125 pb nessas células.

O protocolo aqui descrito utiliza células F1 ES para estudar -regulação cis da expressão do gene em células estimuladoras suprimido monoalélicos gerados usando CRISPR / edição Cas9 genoma (Figura 1). O gRNA e desenho de primers específicos de alelo para genotipagem e expressão do gene são os fatores-chave para esta abordagem. Cada conjunto de primers específicos de alelo devem ser validados por qPCR para confirmar a especificidade alelo. Iniciadores específicos ...

A validação experimental da atividade do intensificador é melhor abordada pela análise de perda de função. Apresentado aqui é um protocolo eficiente que usa deleção mediada por CRISPR / Cas9 para estudar a regulação específica do alelo da transcrição gênica em células F1 ES que contêm um genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar deleção mediada por CRISPR/Cas9 específica para alelos para estudar a regulação da transcrição gênica em células-tronco embrionárias de camundongo. A principal vantagem desta técnica, que utiliza um genoma híbrido para gerar e analisar deleções monoalélicas, é eliminar a necessidade de analisar deleções aprimoradas monoalélicas que podem não ser viáveis.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da genômica funcional. Por exemplo, qual gene é regulado por um enhancer específico e quão dependente esse gene é de um determinado enhancer para sua atividade. Embora este método possa fornecer informações sobre a pluripotência de células-tronco, ele também pode ser aplicado a outros sistemas.Por exemplo, pode ajudar-nos a compreender como as células-tronco alteram seu destino para se tornarem neurônios, células sanguíneas ou musculares. Após projetar, construir e confirmar a sequência do RNA guia, ou gRNA, a ser utilizado, prepare-se para transfectar os plasmídeos livres de endotoxinas em células ES. Usando uma centrífuga, faça um pellet com um vezes dez elevado à sexta potência de células-tronco embrionárias F1 geradas pelo cruzamento de Mus musculus 129 com Mus castaneus em um tubo de 1,5 mililitro a 300 vezes g por cinco minutos.Após a centrifugação, despreze o sobrenatante e adicione 100 microlitros do tampão de ressuspensão fornecido pelo fabricante do kit. Para a deleção da região de DNA alvo, adicione cinco microgramas de cada um dos plasmídeos P Cas9 GFP 5-primo e 3-primo gRNA. Usando uma pipeta, misture suavemente.Evite introduzir bolhas. Em seguida, use a ponteira eletrônica do microporador para aspirar 100 microlitros da mistura de eletroporação, tomando cuidado para não introduzir ar na ponteira. Depois, conecte a pipeta ao dispositivo de transfeção.Selecione o protocolo apropriado e pressione iniciar. Enquanto a eletroporação estiver em andamento, observe a ponta. Com a configuração correta, bolhas pequenas devem emergir do eletrodo do tubo.Uma faísca indica a presença de uma bolha de ar e irá interferir na transfeção. Se isso ocorrer, a eletroporação deve ser repetida com um novo lote de células. Após a eletroporação, ejetar as células transfectadas em uma placa de dez centímetros revestida com gelatina contendo dez mililitros de meio para células ES.Incube as células transfectadas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Após 48 horas, utilize um citômetro de fluxo para separar e isolar as células ES positivas para cast nove GFP. Em seguida, semeie de 1 a 1,5 vezes 10 à quarta potência de células positivas para GFP em uma placa de 10 centímetros, revestida com gelatina e contendo 10 mililitros de meio para células ES.O plaqueamento nessa baixa densidade facilitará a coleta de colônias individuais de células ES. Quatro a cinco dias depois, utilize um microscópio para identificar colônias individuais de células ES com formato esférico. Usando uma pipeta, transfira cada colônia para um poço de uma placa de 96 poços previamente tratada com gelatina e contendo 30 microlitros de tripsom.Após todas as colônias terem sido coletadas e dissociadas no meio, cultive as células a 37 graus Celsius no incubador de dióxido de carbono até que a maioria dos poços esteja com mais de 70% de confluência. Isso geralmente leva cerca de dois dias. Quando as células estiverem prontas para serem repassadas, remova o meio e adicione 30 microlitros de tripsina.Incube as células por cinco minutos. Em seguida, adicione 180 microlitros de meio para células ES a cada poço para neutralizar a tripsina. Pipete para cima e para baixo para obter uma suspensão de células simples.De cada poço, transfira 70 microlitros para cada um dos três microplacas de 96 poços revestidos com gelatina contendo 130 microlitros de meio para células ES em cada poço. Incube a 37 graus Celsius. Quando as placas atingirem de 70 a 85% de confluência, utilize-as para realizar a genotipagem e a análise de expressão de cada clone, conforme descrito nas seções a seguir.Congele os estoques celulares conforme descrito no documento anexo. Aqui, quatro conjuntos de iniciadores serão projetados para triar as clonos quanto à deleção desejada. Estes incluem: iniciadores internos, iniciadores externos e iniciadores flanqueadores de gRNA para ambos os sítios-alvo de gRNA nas extremidades 5' e 3'.Inicie visitando o site mostrado aqui para obter a trilha de polimorfismo de nucleotídeo único ou snip correspondente aos genótipos 129 e Cas. Isso direciona para a página da web CRISPR do Laboratório Mitchell. Lá, clique no link fornecido.O site será redirecionado para o navegador do genoma UCSC contendo a faixa que exibe as variações entre os genomas 129 e Cas no conjunto de genoma de camundongo MM-9. Em seguida, insira as coordenadas da região a ser excluída e clique em "ir". Amplie uma região de cerca de 500 pares de bases no meio da deleção desejada, contendo mais de três variações.O design de primers específicos para alelos pode ser complicado se as SNPs forem escassas. Se não for possível projetar primers absolutamente específicos para alelos, podem-se usar primers moderadamente específicos. Basta lembrar de comparar os valores de CT entre os clones deletados e não deletados durante a análise dos resultados de qPCR.Agora, clique em Visualizar no painel superior. No menu suspenso, selecione DNA. A página Obter DNA na Janela será exibida.Nas opções de formatação da sequência, escolha todas as letras maiúsculas, depois clique em Obter DNA para exibir a sequência-alvo no formato de letras maiúsculas. Copie esta sequência e cole-a em um arquivo de documento do Word. Em seguida, compare a sequência com a faixa de snip 129 cast e destaque as posições dos snips, marcando os snips 129 com letras minúsculas.Quando terminar com a sequência 129, copie-a para criar duas sequências formatadas para fast day. Uma para 129 e outra para Cas. Na sequência cast, substitua a base correta em cada posição de corte, marcando o corte com uma letra minúscula.Em seguida, identifique a sequência com seu genoma correspondente, 129 ou Cas. Depois, no navegador, digite o endereço do Primer3Plus. Na área apropriada, cole a sequência 129 com a substituição inserida.Utilize as configurações padrão para projetar os iniciadores. Para projetar os iniciadores específicos do alelo interno, clique no menu suspenso à direita de "Task" e selecione "Primer List", em seguida, clique em "Pick Primers". Uma nova página será aberta exibindo uma lista de iniciadores diretos e reversos.Marque a caixa de seleção para escolher um iniciador direto ou reverso que tenha uma mutação identificada por uma letra minúscula na extremidade 3' ou dentro de quatro bases da extremidade 3'. Observe que os iniciadores com uma mutação na extremidade 3' exibem especificidade alélica aumentada durante a qPCR. Clique em Enviar para o Gerenciador Primer3 na parte inferior da tela.Uma nova página será aberta exibindo o primer selecionado. Para selecionar o segundo primer, retorne à página da lista de primers e clique no botão de voltar para retornar à página principal. No menu suspenso de tarefas, selecione Detecção.A página principal será atualizada e uma caixa para as sequências do primer esquerdo e direito aparecerá na parte inferior. Cole a sequência do primeiro primer na caixa apropriada. Em seguida, acesse a guia Configurações Gerais localizada ao lado da guia Principal e altere a configuração do intervalo de tamanho do produto para 80 a 200 pares de bases.Clique em "Escolher iniciadores". Uma página será aberta exibindo cinco pares possíveis de iniciadores para a primeira sequência de iniciador. Escolha um conjunto de iniciadores na lista de pares de iniciadores marcando as caixas à esquerda dos iniciadores e clique em "Enviar para o Gerenciador de Primer3" na parte inferior da tela. Esses serão os iniciadores específicos do alelo 129 internos.Repita essas etapas para projetar primers para o alelo cast. Em seguida, aplique esta técnica ao desenvolvimento de primers externos específicos para alelos e primers não específicos para alelos. Por fim, teste os primers quanto à especificidade de alelo utilizando qPCR conforme descrito no documento complementar.Extraia o DNA genômico da placa de 96 poços preparada anteriormente. Centrifugue brevemente a placa para fazer com que qualquer condensação desça para o fundo do poço. Esse DNA servirá como molde para a triagem de deleções.Em seguida, em uma placa de 384 poços, realize qPCR em duplicata para cada clone. Utilize uma PCR de dois passos seguida de análise de curva de dissociação com detecção. Após a execução, verifique primeiro cada alelo quanto à amplificação com os primers específicos do alelo interno.A ausência de amplificação de um alelo ou diferenças nos valores de CT superiores a cinco ciclos entre alelos sugere que esses clones possuem uma deleção heterozigótica. A ausência de amplificação de ambos os alelos sugere que eles possuem uma deleção homozigótica. Em seguida, verifique a amplificação de cada alelo utilizando os primers específicos para os alelos externos.Se a deleção alvo for maior que um KB, a amplificação com primers externos ocorrerá apenas se uma deleção estiver presente. Um valor de CT entre 22 e 28 confirma a deleção. Para deleções alvo menores que um KB, confirme o tamanho do amplicon por eletroforese.Uma placa de 96 poços com clones de deleção foi analisada por qPCR utilizando primers internos específicos para alelos. As barras cinzas representam a amplificação com primers específicos para Cas e as barras pretas representam a amplificação com primers específicos para 129. Um valor baixo de CT ou ausência de amplificação com os primers internos indica deleção do alvo.Os clones com deleção em um ou em ambos os alelos são então analisados com os primers externos. Com os primers externos, a amplificação confirma a deleção. Os clones com deleção monoalélica são analisados usando primers que flanqueiam as regiões-alvo do gRNA para confirmar a ausência de inserções ou deleções, denominadas indels, no alelo não deletado.Somente clones monoalélicos sem inserções ou deleções grandes nos sítios-alvo no alelo não deletado são utilizados na análise subsequente de expressão. São mostrados aqui resultados representativos de clones deletados de 129 ou SCR Cas. O SCR é um enhancer específico de Sox2 recentemente descrito em células-tronco embrionárias.As barras vermelhas representam a expressão do alelo Sox2 Cas, e as barras azuis representam a amplificação do alelo Sox2 129. Como pode ser observado nesta figura, a deleção do SCR no alelo 129 ou Cas reduziu a expressão de Sox2 no CIS. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar uma deleção grande utilizando a tecnologia CRISPR e usar primers específicos para alelos para genotipar seus clones deletados.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

CRISPR/Cas9 é um sistema robusto para produzir ruptura de genes e elementos genéticos. Aqui descrevemos um protocolo para a criação eficiente de deleções genômicas em linhagens celulares de mamíferos usando CRISPR/Cas9.

Geração de Genomic Eliminações em linhas celulares de mamíferos através CRISPR / Cas9

Proteínas, muitas vezes contêm vários domínios que podem exercer diferentes funções celulares. Gene knock-out (KO) não consideram essa diversidade funcional. Aqui, relatamos uma abordagem de estrutura-função com base na troca de cassete mediada por recombinação (RMCE) em KO células estaminais embrionárias que permite a dissecação molecular de vários domínios funcionais ou variantes de uma proteína.

Estudos de estrutura-função em células estaminais embrionárias Rato Usando recombinase mediada por troca cassete

Este protocolo descreve as etapas necessárias para projetar e executar a segmentação multiplexada de realçadores com a proteína de fusão desativação CASCUDO-SID4X-dCas9, também conhecido como interferência de realçador (Enhancer-i). Este protocolo permite a identificação de potenciadores que regulam a expressão gênica e facilita a dissecação das relações entre potenciadores de regulação de um gene alvo comum.

Dissecação do Enhancer função usando interferência Multiplex Enhancer CRISPR-baseado em linhas de células

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

Este método é projetado para seguir a formação de domínios de cromatina mediada por PRC2 em linhas celulares, e o método pode ser adaptado para muitos outros sistemas.

Um método para estudar a formação de novo dos domínios da cromatina

Este protocolo fornece um método para facilitar a geração de mudanças heterozygous ou homozygous definidas do nucleotide usando CRISPR-CAS9 em pilhas de haste pluripotentes humanas.

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Aqui, apresentamos um método modificado para criopreservação de embriões unicelulares, bem como um protocolo que acoplar o uso de embriões congelados e eletroporação para a geração eficiente de camundongos geneticamente modificados.

Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados

Aqui, descrevemos uma técnica simples destinada à geração eficiente de camundongos geneticamente modificados chamada CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Este método fornece reagentes de edição por eletroporação em embriões a uma eficiência próxima de 100%. Este protocolo é eficaz para mutações pontuais, pequenas inserções genômicas e deleções em embriões de mamíferos.

Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

Aqui apresentamos um protocolo para o desenvolvimento de modelos de camundongos geneticamente modificados usando células-tronco embrionárias, especialmente para grandes knock-in de DNA (KI). Este protocolo é ajustado usando a edição do genoma CRISPR / Cas9, resultando em eficiência de KI significativamente melhorada em comparação com o método convencional de direcionamento de DNA linearizado mediado por recombinação homóloga.

Direcionamento de genes altamente eficientes mediados por CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias para o desenvolvimento de modelos de camundongos manipulados por genes

Este artigo relata a construção de células knockout da proteína E associada a centrômeros (CENP-E) usando o sistema CRISPR/Cas9 e três estratégias de triagem baseadas em fenótipos. Utilizamos a linhagem celular knockout do CENP-E para estabelecer uma nova abordagem para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E, o que é útil para o desenvolvimento de fármacos e pesquisa biológica.

Geração de Linhagens Celulares Knockout da Proteína Associada ao Centrômero-E CENP-E-/- utilizando o Sistema CRISPR/Cas9

O método apresentado descreve a geração de um nocaute gênico mediado por CRISPR na linhagem H9 de células-tronco embrionárias humanas (hESC), que expressa de forma estável sgRNAs direcionados ao gene L2HGDH usando um sistema de entrega de genes mediado por lentivírus altamente eficiente.

Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

Aprenda a usar deleções monoalélicas mediadas por CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias de camundongo para estudar a regulação transcricional de genes e a função de enhancers específicos.

Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal

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