Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos
2 de abril de 2016
A validação experimental da atividade do intensificador é melhor abordada pela análise de perda de função. Apresentado aqui é um protocolo eficiente que usa deleção mediada por CRISPR / Cas9 para estudar a regulação específica do alelo da transcrição gênica em células F1 ES que contêm um genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).
O objetivo geral deste procedimento é utilizar deleção mediada por CRISPR/Cas9 específica para alelos para estudar a regulação da transcrição gênica em células-tronco embrionárias de camundongo. A principal vantagem desta técnica, que utiliza um genoma híbrido para gerar e analisar deleções monoalélicas, é eliminar a necessidade de analisar deleções aprimoradas monoalélicas que podem não ser viáveis.
Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da genômica funcional. Por exemplo, qual gene é regulado por um enhancer específico e quão dependente esse gene é de um determinado enhancer para sua atividade. Embora este método possa fornecer informações sobre a pluripotência de células-tronco, ele também pode ser aplicado a outros sistemas.
Por exemplo, pode ajudar-nos a compreender como as células-tronco alteram seu destino para se tornarem neurônios, células sanguíneas ou musculares. Após projetar, construir e confirmar a sequência do RNA guia, ou gRNA, a ser utilizado, prepare-se para transfectar os plasmídeos livres de endotoxinas em células ES. Usando uma centrífuga, faça um pellet com um vezes dez elevado à sexta potência de células-tronco embrionárias F1 geradas pelo cruzamento de Mus musculus 129 com Mus castaneus em um tubo de 1,5 mililitro a 300 vezes g por cinco minutos.
Após a centrifugação, despreze o sobrenatante e adicione 100 microlitros do tampão de ressuspensão fornecido pelo fabricante do kit. Para a deleção da região de DNA alvo, adicione cinco microgramas de cada um dos plasmídeos P Cas9 GFP 5-primo e 3-primo gRNA. Usando uma pipeta, misture suavemente.
Evite introduzir bolhas. Em seguida, use a ponteira eletrônica do microporador para aspirar 100 microlitros da mistura de eletroporação, tomando cuidado para não introduzir ar na ponteira. Depois, conecte a pipeta ao dispositivo de transfeção.
Selecione o protocolo apropriado e pressione iniciar. Enquanto a eletroporação estiver em andamento, observe a ponta. Com a configuração correta, bolhas pequenas devem emergir do eletrodo do tubo.
Uma faísca indica a presença de uma bolha de ar e irá interferir na transfeção. Se isso ocorrer, a eletroporação deve ser repetida com um novo lote de células. Após a eletroporação, ejetar as células transfectadas em uma placa de dez centímetros revestida com gelatina contendo dez mililitros de meio para células ES.
Incube as células transfectadas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Após 48 horas, utilize um citômetro de fluxo para separar e isolar as células ES positivas para cast nove GFP. Em seguida, semeie de 1 a 1,5 vezes 10 à quarta potência de células positivas para GFP em uma placa de 10 centímetros, revestida com gelatina e contendo 10 mililitros de meio para células ES.
O plaqueamento nessa baixa densidade facilitará a coleta de colônias individuais de células ES. Quatro a cinco dias depois, utilize um microscópio para identificar colônias individuais de células ES com formato esférico. Usando uma pipeta, transfira cada colônia para um poço de uma placa de 96 poços previamente tratada com gelatina e contendo 30 microlitros de tripsom.
Após todas as colônias terem sido coletadas e dissociadas no meio, cultive as células a 37 graus Celsius no incubador de dióxido de carbono até que a maioria dos poços esteja com mais de 70% de confluência. Isso geralmente leva cerca de dois dias. Quando as células estiverem prontas para serem repassadas, remova o meio e adicione 30 microlitros de tripsina.
Incube as células por cinco minutos. Em seguida, adicione 180 microlitros de meio para células ES a cada poço para neutralizar a tripsina. Pipete para cima e para baixo para obter uma suspensão de células simples.
De cada poço, transfira 70 microlitros para cada um dos três microplacas de 96 poços revestidos com gelatina contendo 130 microlitros de meio para células ES em cada poço. Incube a 37 graus Celsius. Quando as placas atingirem de 70 a 85% de confluência, utilize-as para realizar a genotipagem e a análise de expressão de cada clone, conforme descrito nas seções a seguir.
Congele os estoques celulares conforme descrito no documento anexo. Aqui, quatro conjuntos de iniciadores serão projetados para triar as clonos quanto à deleção desejada. Estes incluem: iniciadores internos, iniciadores externos e iniciadores flanqueadores de gRNA para ambos os sítios-alvo de gRNA nas extremidades 5' e 3'.
Inicie visitando o site mostrado aqui para obter a trilha de polimorfismo de nucleotídeo único ou snip correspondente aos genótipos 129 e Cas. Isso direciona para a página da web CRISPR do Laboratório Mitchell. Lá, clique no link fornecido.
O site será redirecionado para o navegador do genoma UCSC contendo a faixa que exibe as variações entre os genomas 129 e Cas no conjunto de genoma de camundongo MM-9. Em seguida, insira as coordenadas da região a ser excluída e clique em "ir". Amplie uma região de cerca de 500 pares de bases no meio da deleção desejada, contendo mais de três variações.
O design de primers específicos para alelos pode ser complicado se as SNPs forem escassas. Se não for possível projetar primers absolutamente específicos para alelos, podem-se usar primers moderadamente específicos. Basta lembrar de comparar os valores de CT entre os clones deletados e não deletados durante a análise dos resultados de qPCR.
Agora, clique em Visualizar no painel superior. No menu suspenso, selecione DNA. A página Obter DNA na Janela será exibida.
Nas opções de formatação da sequência, escolha todas as letras maiúsculas, depois clique em Obter DNA para exibir a sequência-alvo no formato de letras maiúsculas. Copie esta sequência e cole-a em um arquivo de documento do Word. Em seguida, compare a sequência com a faixa de snip 129 cast e destaque as posições dos snips, marcando os snips 129 com letras minúsculas.
Quando terminar com a sequência 129, copie-a para criar duas sequências formatadas para fast day. Uma para 129 e outra para Cas. Na sequência cast, substitua a base correta em cada posição de corte, marcando o corte com uma letra minúscula.
Em seguida, identifique a sequência com seu genoma correspondente, 129 ou Cas. Depois, no navegador, digite o endereço do Primer3Plus. Na área apropriada, cole a sequência 129 com a substituição inserida.
Utilize as configurações padrão para projetar os iniciadores. Para projetar os iniciadores específicos do alelo interno, clique no menu suspenso à direita de "Task" e selecione "Primer List", em seguida, clique em "Pick Primers". Uma nova página será aberta exibindo uma lista de iniciadores diretos e reversos.
Marque a caixa de seleção para escolher um iniciador direto ou reverso que tenha uma mutação identificada por uma letra minúscula na extremidade 3' ou dentro de quatro bases da extremidade 3'. Observe que os iniciadores com uma mutação na extremidade 3' exibem especificidade alélica aumentada durante a qPCR. Clique em Enviar para o Gerenciador Primer3 na parte inferior da tela.
Uma nova página será aberta exibindo o primer selecionado. Para selecionar o segundo primer, retorne à página da lista de primers e clique no botão de voltar para retornar à página principal. No menu suspenso de tarefas, selecione Detecção.
A página principal será atualizada e uma caixa para as sequências do primer esquerdo e direito aparecerá na parte inferior. Cole a sequência do primeiro primer na caixa apropriada. Em seguida, acesse a guia Configurações Gerais localizada ao lado da guia Principal e altere a configuração do intervalo de tamanho do produto para 80 a 200 pares de bases.
Clique em "Escolher iniciadores". Uma página será aberta exibindo cinco pares possíveis de iniciadores para a primeira sequência de iniciador. Escolha um conjunto de iniciadores na lista de pares de iniciadores marcando as caixas à esquerda dos iniciadores e clique em "Enviar para o Gerenciador de Primer3" na parte inferior da tela. Esses serão os iniciadores específicos do alelo 129 internos.
Repita essas etapas para projetar primers para o alelo cast. Em seguida, aplique esta técnica ao desenvolvimento de primers externos específicos para alelos e primers não específicos para alelos. Por fim, teste os primers quanto à especificidade de alelo utilizando qPCR conforme descrito no documento complementar.
Extraia o DNA genômico da placa de 96 poços preparada anteriormente. Centrifugue brevemente a placa para fazer com que qualquer condensação desça para o fundo do poço. Esse DNA servirá como molde para a triagem de deleções.
Em seguida, em uma placa de 384 poços, realize qPCR em duplicata para cada clone. Utilize uma PCR de dois passos seguida de análise de curva de dissociação com detecção. Após a execução, verifique primeiro cada alelo quanto à amplificação com os primers específicos do alelo interno.
A ausência de amplificação de um alelo ou diferenças nos valores de CT superiores a cinco ciclos entre alelos sugere que esses clones possuem uma deleção heterozigótica. A ausência de amplificação de ambos os alelos sugere que eles possuem uma deleção homozigótica. Em seguida, verifique a amplificação de cada alelo utilizando os primers específicos para os alelos externos.
Se a deleção alvo for maior que um KB, a amplificação com primers externos ocorrerá apenas se uma deleção estiver presente. Um valor de CT entre 22 e 28 confirma a deleção. Para deleções alvo menores que um KB, confirme o tamanho do amplicon por eletroforese.
Uma placa de 96 poços com clones de deleção foi analisada por qPCR utilizando primers internos específicos para alelos. As barras cinzas representam a amplificação com primers específicos para Cas e as barras pretas representam a amplificação com primers específicos para 129. Um valor baixo de CT ou ausência de amplificação com os primers internos indica deleção do alvo.
Os clones com deleção em um ou em ambos os alelos são então analisados com os primers externos. Com os primers externos, a amplificação confirma a deleção. Os clones com deleção monoalélica são analisados usando primers que flanqueiam as regiões-alvo do gRNA para confirmar a ausência de inserções ou deleções, denominadas indels, no alelo não deletado.
Somente clones monoalélicos sem inserções ou deleções grandes nos sítios-alvo no alelo não deletado são utilizados na análise subsequente de expressão. São mostrados aqui resultados representativos de clones deletados de 129 ou SCR Cas. O SCR é um enhancer específico de Sox2 recentemente descrito em células-tronco embrionárias.
As barras vermelhas representam a expressão do alelo Sox2 Cas, e as barras azuis representam a amplificação do alelo Sox2 129. Como pode ser observado nesta figura, a deleção do SCR no alelo 129 ou Cas reduziu a expressão de Sox2 no CIS. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar uma deleção grande utilizando a tecnologia CRISPR e usar primers específicos para alelos para genotipar seus clones deletados.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para utilizar deleções mediadas por CRISPR/Cas9 no estudo da regulação alélica específica da transcrição gênica em células-tronco embrionárias de camundongo. A técnica aproveita um genoma híbrido para facilitar a análise de deleções monoalélicas, fornecendo insights sobre a regulação gênica.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Genômica funcional
- Regulação da transcrição gênica
- Tecnologia CRISPR/Cas9
Contexto
- Compreender a atividade do enhancer é fundamental para a regulação gênica.
- A análise de perda de função é uma abordagem essencial nesse campo.
- Células-tronco embrionárias de camundongo fornecem um modelo para estudar a regulação gênica.
- Genomas híbridos podem auxiliar na análise de interações gênicas específicas.
Objetivo do Estudo
- Investigar o papel de potenciadores específicos na regulação gênica.
- Determinar a dependência de genes em relação a potenciadores particulares.
- Aprimorar o entendimento da pluripotência de células-tronco e suas aplicações.
Métodos Utilizados
- Técnica de deleção mediada por CRISPR/Cas9.
- Uso de células-tronco F1 com um genoma híbrido (Mus musculus 129 x Mus castaneus).
- Análise de deleções monoalélicas para estudar a transcrição gênica.
- Validação experimental da atividade de enhancer por meio de análise de perda de função.
Resultados Principais
- Implementação bem-sucedida de deleções alélicas específicas em células-tronco.
- Compreensão da regulação da transcrição gênica por enhancers específicos.
- Demonstração da aplicabilidade do método a diversos sistemas biológicos.
- Contribuição para a compreensão da genômica funcional.
Conclusões
- O método CRISPR/Cas9 é eficaz para estudar a atividade de enhancers.
- Essa abordagem pode esclarecer a relação entre enhancers e expressão gênica.
- Os achados podem ter implicações mais amplas para a pesquisa com células-tronco e genômica funcional.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a investigação precisa da função de enhancers por meio da deleção alélica específica com CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias de camundongos híbridos, abordando um desafio fundamental na validação de alvos: vincular elementos reguladores distais à expressão gênica. Ao explorar as SNPs naturais entre os alelos de Mus musculus 129 e Mus castaneus, a abordagem possibilita a desmistificação mecanicista de reguladores transcricionais sem os efeitos confundidores da letalidade homozigótica, proporcionando confiança preditiva nas relações entre enhancers e genes já nos estágios iniciais da descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao testar a necessidade do enhancer para a expressão gênica em um modelo de célula-tronco fisiologicamente relevante.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica por meio de análise de perda de função monoalélica que evita confusões fenotípicas decorrentes da deleção completa de elementos reguladores.
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao fornecer evidência direta de regulação cis por meio de triagem por deleção alélica específica utilizando primers discriminadores de SNP.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Operacional: Facilita a padronização de ensaios por meio de genotipagem baseada em qPCR com primers específicos para alelos internos e externos, permitindo distinguir clones heterozigotos, homozigotos e selvagens.
- Valor Operacional: Permite um fluxo de trabalho escalável de triagem utilizando a coleta de colônias em placas de 96 poços e qPCR em placas de 384 poços para validação de deleções em alto rendimento.
- Valor Operacional: Apoia a reprodutibilidade do ensaio exigindo a confirmação da ausência de inserções ou deleções (indels) no alelo não deletado por meio de primers adjacentes ao gRNA antes da análise de expressão.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Fornece insights relevantes sobre sistemas de doenças ao estudar a regulação mediada por enhancers de fatores de pluripotência como Sox2 em células-tronco embrionárias de camundongo.
- Valor Translacional: Apoia a confiança preditiva em decisões de destino celular ao associar a deleção de enhancers a alterações na expressão gênica relevantes para vias de diferenciação.
- Valor Translacional: Permite a redução mecanicista de riscos em alvos de enhancers por meio de análise quantitativa de expressão (qPCR) que mostra redução alélica específica na transcrição do gene alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade da biologia de descoberta até a identificação de alvos, fornecendo a validação funcional de elementos reguladores não codificantes antes do direcionamento terapêutico, com resultados que informam diretamente as decisões de priorização de alvos e redução de riscos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre relações entre enhancers e genes por meio de deleção alélica específica e análise de expressão em um modelo geneticamente manipulável.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de um fluxo de trabalho padronizado de qPCR utilizando primers específicos para alelos, quantificando eficiência e especificidade da deleção em diferentes clones.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes (valores de CT, curvas de dissociação) que permitem comparar expressão alélica e zigosidade da deleção.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao estudar a função de enhancers em um modelo de células-tronco relevante para diferenciação e modelagem de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para validação de enhancers em diferentes regiões genômicas, utilizando o mesmo desenho de primers baseado em SNPs e fluxo de trabalho CRISPR.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na função de enhancer por meio de evidência direta de perda de função, sem mecanismos compensatórios decorrentes de deleção homozigótica.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio do design de primers alélo-específicos orientado por SNP e protocolos de triagem por qPCR.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais assertivas ao esclarecer a dependência do enhancer e reduzir a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de alvos transcricionais com base em relações validadas entre enhancer e gene em um contexto celular relevante para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em projeto de CRISPR/Cas9, engenharia de primers alélicos específicos e análise de qPCR para discriminação alélica.
- Depende do acesso a células-tronco embrionárias híbridas F1 com densidade suficiente de SNPs (a cada ~125 pb) para direcionamento alélico específico confiável.
- Necessita padronização entre equipes nos fluxos de trabalho de projeto de primers utilizando o navegador genômico UCSC e o Primer3Plus para garantir especificidade alélica.
- Envolve considerações de adaptação para modelos não híbridos, nos quais a densidade de SNPs pode ser insuficiente para resolução alélica específica.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de confirmar a ausência de indels no alelo não deletado antes de atribuir alterações na expressão à perda do enhancer.
