Uma nova estratégia combinando Array-CGH, todo-exome sequenciamento e eletroporação no Utero em roedores para identificar Genes causadores de malformações do cérebro

O objetivo geral deste procedimento é identificar novos genes candidatos para distúrbios de malformação cerebral e confirmar diretamente seu papel causal in-vivo. Essa estratégia pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurobiologia ao descobrir vias moleculares associadas ao desenvolvimento cerebral e às patologias correlatas. A principal vantagem dessa estratégia é que ela auxiliará na descoberta de novos genes associados a distúrbios cerebrais e no desenvolvimento de novas ferramentas diagnósticas.

Utilizando esta abordagem, poderíamos revelar a contribuição crucial do gene C6orf70 na patogênese da heterotopia nodular periventricular, uma malformação cerebral causada pela migração neuronal anormal. Demonstrará o procedimento Fabienne Schaller, engenheira do nosso laboratório. Prepare uma rata prenhe E15 para o procedimento conforme descrito no protocolo escrito e de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais.

Certifique-se de que o animal está adequadamente anestesiado, que pomada oftálmica foi aplicada nos olhos e que o abdômen foi corretamente depilado e desinfetado. Após usar tesoura afiada para fazer uma incisão vertical de dois centímetros na pele e no músculo da linha média do abdômen caudal, exponha cuidadosamente um dos cornos uterinos da cavidade abdominal. Aplique gota a gota solução salina normal pré-aquecida a 37 graus Celsius para umedecer os embriões.

Mantenha o útero úmido durante todo o procedimento. Para injetar o DNA, segure suavemente um embrião com uma das mãos, deixando a cabeça facilmente acessível. Em seguida, usando a outra mão, insira cuidadosamente uma micropipeta de vidro conectada a um microinjetor no ventrículo lateral esquerdo, localizado a um milímetro da linha média e a uma profundidade de dois a três milímetros.

Use o microinjetor para injetar aproximadamente um microlitro de DNA com verde rápido, permitindo o monitoramento visual da injeção. Para eletroporar o DNA nas células, primeiro coloque solução salina normal sobre a superfície do eletrodo de três por sete milímetros. Em seguida, posicione o eletrodo positivo no lado injetado e o eletrodo negativo no ventrículo direito não injetado.

Use o pedal controlado pelo pé para aplicar cinco pulsos elétricos em intervalos de 950 milissegundos. Após a eletroporação, retorne o corno uterino à cavidade abdominal e adicione solução salina estéril para permitir que os embriões se posicionem de maneira mais natural e para compensar a perda de fluido durante a cirurgia. Feche a parede muscular com suturas cirúrgicas absorvíveis e, em seguida, a pele usando um ponto simples interrompido.

Forneça analgesia pós-operatória por até 48 horas ou conforme indicado pelas diretrizes institucionais. Devolva a rata à sua gaiola limpa e monitore-a até que saia da anestesia. Após fixar os cérebros em paraformaldeído 4%, conforme descrito na parte escrita do protocolo, lave em PBS por 10 minutos.

Durante a lavagem, prepare 50 mililitros de ágar a 4% em PBS, garantindo que a temperatura do ágarose dissolvido não ultrapasse 50 graus Celsius. Despeje o ágarose em moldes plásticos para inclusão e, em seguida, coloque os cérebros no ágarose. Coloque os cérebros incluídos a quatro graus Celsius e deixe o ágarose polimerizar por pelo menos uma hora.

Após a polimerização do agarose, retire o excesso de agarose ao redor do cérebro e, em seguida, cole o cérebro à placa base do vibrátomo com o eixo anterior-posterior do cérebro perpendicular à lâmina. Após aguardar alguns minutos para a cola secar, coloque a placa com o cérebro colado na câmara do vibrátomo. Encha o vibrátomo com PBS e comece a cortar seções de 100 mícrons de espessura.

Após o corte, transfira as seções para lâminas de microscópio e remova o líquido em excesso. Em seguida, adicione algumas gotas de meio de montagem e coloque uma lamínula sobre as seções. Deixe secar durante a noite.

Imageie as seções utilizando aumento de 10x em um microscópio confocal de varredura a laser. Para analisar as imagens, primeiro converta a imagem em 8 bits usando um software apropriado para análise quantitativa de imagens. Em seguida, selecione uma célula fluorescente representativa positiva para GFP e defina manualmente sua forma clicando em estimar e utilizando a ferramenta de seleção livre para desenhar a borda da célula.

O software retém automaticamente o diâmetro e o limiar de intensidade da célula. Clique em encontrar células para permitir que o software localize as células transfectadas em toda a extensão do córtex. Em seguida, se necessário, remova manualmente os falsos positivos.

Divida toda a espessura do córtex em oito áreas de interesse, normalizadas em seções individuais, clicando na ferramenta de região, selecionando oito faixas regionais, onde as faixas um e oito correspondem à zona ventricular e ao topo da placa cortical, respectivamente. Em seguida, clique em aplicar para permitir que o software conte a posição relativa das células transfectadas com GFP em todo o córtex. Por fim, clique em salvar quantificação para exportar os dados para um arquivo Excel para análise.

A CGH em array e o sequenciamento de todo o exoma identificaram o C6orf70 como um gene candidato para anormalidades em genes do desenvolvimento. A PCR quantitativa determinou que este gene, juntamente com PHF10 e DLL1, é expresso no córtex cerebral de ratos. As imagens a seguir mostram seções coronais representativas do neocórtex de cérebros de ratos E20 cinco dias após eletroporação com um construto de proteína verde fluorescente isoladamente ou combinado com shRNA direcionado à sequência codificadora do C6orf70 ou com o construto de mismatch relativamente ineficaz.

O silenciamento do Filamento A foi utilizado como controle de migração neuronal prejudicada. A eletroporação intra-útero com shRNA direcionado ao C6orf70 ou ao Filamento A induziu a parada de células positivas para GFP na zona ventricular, conforme indicado pelas setas brancas, enquanto as células que expressavam GFP sozinho, ou em combinação com a construção de sequência incompatível, não alteraram a migração neuronal. Ao realizar este procedimento, é importante ter em mente qual estágio da gênese cortical deseja-se analisar, seja a proliferação neuronal, a migração ou a maturação.

Não se esqueça de que aprender a realizar eletroporação intra-útero no cérebro embrionário de roedores exige um longo período de treinamento, habilidades e prática regular.