Uma nova estratégia combinando Array-CGH, todo-exome sequenciamento e eletroporação no Utero em roedores para identificar Genes causadores de malformações do cérebro

O objetivo geral deste procedimento é identificar novos genes candidatos para distúrbios de malformação cerebral e confirmar diretamente seu papel causador in vivo. Essa estratégia pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia, descobrindo vias moleculares associadas ao desenvolvimento do cérebro e patologias correlatas. A principal vantagem dessa estratégia é que ela ajudará a descobrir novos genes associados a distúrbios cerebrais e a desenvolver novas ferramentas de diagnóstico.

Usando essa abordagem, pudemos revelar a contribuição crucial do gene C6orf70 na patogênese da heterotopia nodular periventricular, uma malformação cerebral causada por migração neuronal anormal. Demonstrando o procedimento estará Fabienne Schaller, engenheira do nosso laboratório. Prepare uma rata grávida E15 para o procedimento conforme descrito no protocolo escrito e de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais.

Certifique-se de que o animal esteja devidamente anestesiado, que a pomada oftálmica seja aplicada nos olhos e que o abdômen esteja devidamente barbeado e desinfetado. Depois de usar uma tesoura afiada para fazer uma incisão vertical de dois centímetros na pele e no músculo da linha média do abdômen caudal, exponha cuidadosamente um corno uterino da cavidade abdominal. Aplique solução salina normal pré-aquecida a 37 graus Celsius gota a gota para hidratar os embriões.

Mantenha o útero úmido durante todo o procedimento. Para injetar DNA, segure suavemente um embrião em uma mão com a cabeça facilmente acessível. Em seguida, usando a outra mão, insira cuidadosamente um capilar de vidro conectado a um microinjetor no ventrículo lateral esquerdo, localizado a um milímetro da linha média e a uma profundidade de dois a três milímetros.

Use o microinjetor para injetar aproximadamente um microlitro de DNA com verde rápido para permitir o monitoramento visual da injeção. Para eletroporar o DNA nas células, primeiro coloque solução salina normal na superfície do eletrodo de três por sete milímetros. Em seguida, coloque o eletrodo positivo no lado injetado e o eletrodo negativo no ventrículo direito não injetado.

Use o pedal controlado pelo pedal para fornecer cinco pulsos elétricos em intervalos de 950 milissegundos. Após a eletroporação, retorne o corno uterino à cavidade abdominal e adicione solução salina estéril para permitir que os embriões se posicionem mais naturalmente e para compensar a perda de fluido intraoperatório. Feche a parede muscular com suturas cirúrgicas absorvíveis e, em seguida, a pele usando um ponto simples interrompido.

Forneça analgesia pós-operatória por até 48 horas ou conforme indicado pelas diretrizes institucionais. Retorne o rato à sua gaiola doméstica limpa e monitore-o até que ele saia da anestesia. Depois de fixar os cérebros em paraformaldeído a 4%, conforme descrito na parte escrita do protocolo, lave em PBS por 10 minutos.

Durante a lavagem, prepare 50 mililitros de ágar 4% em PBS, garantindo que a temperatura da agarose dissolvida não exceda 50 graus Celsius. Despeje a agarose em moldes de plástico e coloque os miolos na agarose. Coloque os cérebros embutidos a quatro graus Celsius e deixe a agarose polimerizar por pelo menos uma hora.

Depois que a agarose polimerizar, apare o excesso de agarose ao redor do cérebro e, em seguida, cole o cérebro na placa de base do vibratomo com o acesso anterior posterior do cérebro perpendicular à lâmina. Depois de esperar alguns minutos para que a cola seque, coloque a placa com o cérebro colado na câmara do vibrato. Encha o vibratomo com PBS e comece a cortar seções de 100 mícrons de espessura.

Após o seccionamento, transfira as seções para lâminas de microscópio e remova o excesso de líquido. Em seguida, adicione algumas gotas de meio de montagem e coloque uma lamínula no topo das seções. Deixe secar durante a noite.

Visualize as seções usando ampliação de 10x em um microscópio confocal de varredura a laser. Para analisar as imagens, primeiro converta a imagem em 8 bits usando o software apropriado para análise quantitativa de imagens. Em seguida, selecione uma célula fluorescente positiva GFP representativa e defina manualmente sua forma clicando em estimar e usando a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar a borda da célula.

O software retém automaticamente o diâmetro e o limite de intensidade da célula. Clique em localizar células para permitir que o software localize células transfectadas em todo o córtex. Em seguida, se necessário, remova manualmente os falsos positivos.

Divida toda a espessura do córtex em oito áreas de interesse, normalizadas em seções individuais, clicando na ferramenta região, selecionando oito listras de região, onde as listras um e oito correspondem à zona ventricular e ao topo da placa cortical, respectivamente. Em seguida, clique em aplicar para permitir que o software conte a posição relativa das células transfectadas GFP em todo o córtex. Por fim, clique em salvar quantificação para exportar os dados em um arquivo Excel para análise.

O sequenciamento de array CGH e exoma completo identificou C6orf70 como um gene candidato para anormalidades genéticas de desenvolvimento. A PCR quantitativa determinou que este gene, juntamente com PHF10 e DLL1, são expressos no córtex cerebral de ratos. As imagens a seguir mostram seções coronais neocorticais representativas de cérebros de ratos E20 5 dias após a eletroporação com a construção da proteína fluorescente verde sozinha ou combinada com shRNA visando a sequência de codificação C6orf70 ou com a construção de incompatibilidade relativamente ineficaz.

O filamento A knock down foi usado como controle da migração neuronal prejudicada. A eletroporação intra-utero com shRNA visando o C6orf70 ou o filamento A induziu a parada de células positivas para GFP dentro da zona ventricular, conforme indicado pelas setas brancas, enquanto as células que expressam GFP sozinhas ou em combinação com a construção de incompatibilidade não alteraram a migração neuronal. Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente qual estado de gênese cortical você deseja analisar, seja proliferação neuronal, migração ou maturação.

Não se esqueça de que aprender a realizar eletroporação no útero no cérebro embrionário de roedores requer um longo período de treinamento, habilidades e prática regular.