Name: Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a investigar propriedades sinápticas de projeções neurais usando optogenética ex vivo com channelrhodopsin e gravações patch-clamp em fatias cerebrais. Este método avança o estudo de circuitos relacionados ao medo.

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Agradecemos a Cora Hübner e Andrea Gall pela ajuda na obtenção de alguns dos resultados representativos. Este trabalho foi apoiado pelo Centro Werner Reichardt de Neurociência Integrativa (CIN) da Universidade de Tuebingen, uma Iniciativa de Excelência financiada pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) no âmbito da Iniciativa de Excelência (EXC 307) e por fundos da Fundação Charitable Hertie.

declaração de ética: Todos os procedimentos experimentais foram de acordo com a directiva da UE sobre a utilização de animais em pesquisa e foram aprovados pelo Animal Care local e Comitê de Uso (Regierungspräsidium Tuebingen, estado de Baden-Württemberg, Alemanha), responsável pela Universidade de Tübingen. 1. Processo de injeção estereotáxica <ol><li> Preparar as ferramentas estéreis (tesouras, bisturis, pinças, perfuração, agulhas, material de sutura), utilizando um esterilizador. Providenciar ferramentas estéreis e soluções necessárias outras fontes e cirurgia, tais como permutas estéreis algodão, desinfectante, estéril tamponada de fosfato salino (PBS, pH 7,4) e H 2 O 2 em uma cobertura cirúrgica estéril. </li><li> Puxar as micropipetas de vidro para injectáveis ​​(Figura 1A, inserir) utilizando a 3 mm de largura de filamentos caixa em um microeléctrodo horizontal puxador de acordo com as instruções do fabricante. Nota: Para injecções profundas, a conicidade eléctrodo deve ser suficientementetempo para atingir as ventrais maioria das coordenadas (aproximadamente 5 mm;. para coordenadas, ver 1.10). </li><li> Pré-mistura 1 ml de solução de vírus e 0,2 ul de solução verde rápido 0,1% em PBS estéril (para melhor visibilidade da solução na pipeta de vidro). Preencha pipetas de vidro com uma mistura de solução de vírus e verde rápido usando uma pipeta de microlitro com uma ponta fina (Figura 1A, inserir). Nota: Trabalhar com adeno-associados vectores virais recombinantes (rAAV) é considerado um nível de segurança biológica (BSL 1) de trabalho e tem de ser realizado num laboratório BSL 1. rAAVs utilizados neste estudo (Figura 1C) foram: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (sorotipo 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-Cagh-ChR2 (H134R) -mCherry (sorotipo 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (serotipo 2/1) 23 </li><li> Anestesiar um rato usando um pequeno aparelho de anestesia de animais (isoflurano: 3% em oxigênio para a indução). Nota: Os ratos utilizados neste estudo foram 4 -7 semanas de idade e uma das seguintes estirpes e genótipos: C57BL6 / J tipo selvagem (experiência nas Figuras 2A e 3A-D); GAD67 GFP-24 (experiência nas Figuras 2B e 3E-H); TAC2-Cre 25 (experimento nas Figuras 2C e 3I-J). </li><li> Raspar a cabeça entre as orelhas e os olhos. Aplicar desinfectante (providone de iodo-base) para a cabeça raspada usando cotonetes. </li><li> Aplique uma pomada para evitar a secagem dos olhos durante a anestesia. Injectar subcutaneamente rato com analgésico (, 0,1 ml de 5 mg de solução de base de meloxicam / ml). </li><li> Coloque rato na moldura estereotáxica (Figura 1A) e manter a anestesia através de uma máscara de anestesia de gás (isoflurano: 2% em oxigénio para manutenção). Verifique a profundidade da anestesia usando reflexo de retirada do membro antes de continuar. Nota: Manter condições estéreis, bem como possível durante todo o procedimento cirúrgico; usar máscara descartável, go cirúrgicaWN e luvas. </li><li> Faça incisão na pele em cima da cabeça com uma tesoura. Com cuidado, puxe a pele para o lado usando uma pinça sem corte, fixe com grampos para expor a superfície do crânio, e crânio limpo com H 2 O 2. </li><li> Locais de injecção marca no crânio usando uma multa buracos ponta do marcador e perfuração permanentes para ambos os hemisférios (Figura 1B). Coordenadas para injeções neste estudo são (da bregma (mm)): mPFC: anterior 1.9, lateral ± 0,3, ventral 2.1; MGM / PIN: posterior 3.0, lateral ± 1,8, ventral 3,8; mpITC / BLA: 1,45 posterior, lateral ± 3,35, 4,75 e ventral. </li><li> Montar pipeta de vidro cheio sobre a armação estereotáxica ligado a um dispositivo de injecção e a pressão para trazer a posição da pipeta bregma. </li><li> Quebre a ponta da pipeta de vidro usando pinça fina reta de ponta. Faça isso com cuidado para evitar a geração de aerossol de solução de vírus. Certifique-se a ponta da pipeta é aberta através da aplicação de alguns pulsos de pressão e observando extrusão de gotas de virusolução s. </li><li> Ir para as coordenadas de injeção desejados e injetar metade do conteúdo da pipeta (~ 0,5 mL) utilizando as seguintes definições no dispositivo de injeção de pressão: Pressão: 20 psi, duração média de pulso: 30 ms, o número médio de pulsos: 50. </li><li> Deixar no lugar pipeta para ~ 1 min antes de se lentamente (1 mm / min) retirá-los. Nota: Certifique-se de pipeta não está bloqueada antes de repetir o procedimento com o mesmo pipeta sobre outro hemisfério. Em caso de ponta bloqueado, limpa ou quebrar ponta ea posição da pipeta zero no bregma novamente. </li><li> crânio limpo com PBS (pH 7,4), remova grampos, puxe a pele juntos, e suturar a incisão com sutura botão individual (3 - 4 nós). Aplicar desinfectante (providona-iodo com base) em torno da ferida. </li><li> Pare a anestesia e não deixar o mouse sem vigilância até que esteja totalmente acordado. Mantenha única alojados ou retornar à companhia de outros animais apenas quando estiver totalmente recuperado. No pós-operatório, continuar a monitorizar o estado de saúde, e adminisTer analgésico, se necessário. Siga os procedimentos de acordo com as regras apresentadas pelo Comitê Animal Care e Use o local. </li></ol> 2. Preparação de fatias aguda <ol><li> Prepare ACSF, solução de corte, ferramentas (tesouras, bisturi, pinças, espátula, Pasteur pipeta) e blocos de agar. Nota: 1 L de fluido cérebro-espinal artificial (ACSF) é necessária por experiência, e é preparado por dissolução de produtos químicos em bidestilada H2O como publicado anteriormente 16,23. Solução de corte é preparado suplementando 200 ml de ACSF com 0,87 ml de uma solução M de estoque 2 MgSO4. </li><li> ACSF oxigenado e solução de corte ao longo da experiência, com 95% de O2 e 5% de CO 2. </li><li> Profundamente anestesiar rato usando um pequeno aparelho de anestesia animal utilizando isoflurano (3% em oxigênio). Verifique a profundidade da anestesia usando reflexo de retirada do membro antes de continuar. </li><li> Decapitar rato usando tesouras grandes e chill imediatamentecabeça na solução de corte gelada. </li><li> Abrir crânio por uma única incisão na linha média do caudal a rostral e empurre pedaços de crânio para os lados usando uma pinça. Rapidamente remover cérebro, levantando-o suavemente para fora do crânio usando uma pequena espátula arredondado. Cortar cerebelo com bisturi. Coloque cerebral em solução de corte gelada. </li><li> Para locais de injecção mPFC: cortar parte anterior do cérebro (contendo mPFC) utilizando um bisturi e colocados em solução de corte gelada até cortar. </li><li> Remover solução de corte o excesso com um papel de filtro e cola na parte posterior do cérebro para o palco vibratome. </li><li> Para fatias amígdala inclinadas, cole o cérebro em um corte do bloco de ágar (4%) em um ângulo de 35 ° (Figura 1D, no meio). Para fatias amígdala coronais, locais de injecção MGM / PIN e locais de injecção mPFC, cole o cérebro diretamente no palco (Figura 1D, esquerda e direita). Coloque um bloco de agar adicional por trás do cérebro para a estabilidade, enquanto cortando. </li><li> Placfase E em corte da câmara de corte com uma solução oxigenado gelado que é mantida a 4 ° C utilizando uma unidade de arrefecimento. Prepare fatias agudas da amígdala (320 microns) usando uma lâmina de safira. Coloque fatias numa câmara de interface fornecido com ACSF oxigenado à TA. </li><li> Após a preparação de fatias agudas amígdala, colocar a câmara de interface num banho de água a 36 ° C para recuperar fatias por 35 - 45 min. Subsequentemente, voltar a câmara de interface para a TA. Para gravar a partir dessas fatias, prossiga com o passo 3.2. </li><li> Durante o início da etapa 2.10, cortar fatias dos locais de injecção como descrito antes para fatias amígdala agudas (passos 2,8-2,9). Recuperação de fatias no banho de água não é necessária aqui. Opcional: Para estimar rapidamente local no local da injecção, observe fatias em um estereoscópio equipado com uma lâmpada fluorescente e filtros adequados. </li><li> Fix fatias contendo locais de injecção para análise post-hoc por intercalando-os entre dois papéis de filtro e submerging-los em 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS solução O / N. Para a análise de locais de injecção continue com o passo 4.1. </li></ol> 3. Visualização e estimulação de fibras pré-sinápticos <ol><li> Prepare microscópio patch para activação optogenetic de fibras e células: <ol><li> Centralize o diodo emissor de montada (LED) para a via de entrega de luz. </li><li> Medir a intensidade da luz de LED no plano focal posterior e na saída de cada objectivo com um medidor de potência escolher o comprimento de onda de 470 nm adequado. </li><li> Calcule a intensidade da luz em mW / mm 2 e criar uma curva de calibração (intensidade LED (%) versus saída de luz (mW / mm 2)) para cada objetivo para valores medidos para 470 nm de comprimento. </li></ol></li><li> Recuperar uma fatia amígdala aguda a partir da câmara de interface e o local na câmara de fatia montado no microscópio vertical equipado com uma lâmpada fluorescente. Tome cuidado para posicionar a fatia de modo que a slice a superfície voltada para cima na câmara de interface também é voltada para cima na câmara de gravação. Perfundir fatia com ASCF fresco, oxigenado a uma taxa de 1-2 ml / min a uma temperatura de ~ 31 ° C. </li><li> Observe fibras pré-sinápticos na fatia usando a lâmpada fluorescente em combinação com filtros adequados para a proteína fluorescente específico expresso. Use objectivo 5x obter uma visão geral (Figura 1E), e 60x objectivo para a avaliação de densidade de fibras dentro da área alvo. Nota: Para GFP e YFP, o uso de filtro definir &quot;verde&quot; (Excitação 472/20, Refletor 495, Emissão 490 LP) para mCherry usar filtro definido &quot;vermelho&quot; (Excitação 560/40, Refletor 585, Emissão 630/70), conforme especificado na tabela de materiais / equipamentos. </li><li> Abrir ou restringir a abertura no percurso de luz do microscópio como desejado para a experiência (Figura 2D). </li><li> Para obter uma gravação de remendo, preencher uma pipeta de patch com uma solução interna e montar isuporte do eletrodo n. Aplique uma pressão positiva para a pipeta patch e abaixe lentamente pela primeira vez na solução do banho e depois sob controle visual na fatia usando o micromanipulador. <ol><li> Aproxime-se do neurônio de interesse com a pipeta patch a partir do lado e superior. Libertar a pressão positiva quando a pipeta está na superfície da célula (covinha visível na superfície da célula) e obter um &quot;gigaseal&quot; por aplicação de pressão negativa. </li><li> Aplicar mais sucção à ruptura do remendo de membrana para se obter a gravação de célula inteira. Posteriormente, estimular fibras marcadas com o LED ligado usando o comprimento de onda apropriado para ativar Chr (470 nm) durante a gravação de respostas elétricas da célula. </li><li> Para a estimulação sináptica começar com uma intensidade do LED de baixo e aumentar até a amplitude da corrente sináptica desejada seja atingida. Acionar o LED, configurando saídas digitais no software de aquisição de dados para controlar o comprimento de tempo e pulso (exemplos na Figura3). Nota: Outras software e / ou TTL de geração de dispositivos podem ser usados ​​para acionar LED. </li></ol></li><li> Repita estimulação com abertura aberta ou restrita (passo 3.4) na via de luz do microscópio como desejado para a célula seguinte gravada e / ou na presença de fármacos específicos. </li><li> Após a gravação, corrigir fatias para análise post-hoc por intercalando-os entre dois papéis de filtro e submergindo-os em 4% PFA O / N. </li><li> Analisar dados eletrofisiológicos. Nota: Use o software adequado para visualizar os dados de varredura registrados para cada estímulo indivíduo offline. Quando a análise dos efeitos de drogas, utilizar rotinas de detecção de pico para obter a evolução no tempo do efeito do fármaco em amplitudes de corrente sinápticas para todos os varrimentos individuais. Determinar quando o efeito da droga atinge o estado estacionário. Para preparar respostas médios representativos de figuras, usar o software para médias ≥10 varreduras individuais por condição experimental (cf Figura 3B-D, FH, J painel da direita). Nota: várias alternativas pacotes de software pode ser utilizado para a análise de dados. </li></ol> 4. análise post-hoc de locais de injecção <ol><li> Lavar as fatias de locais de injecção (do passo 2.12) e registo dos sítios (se re-imagem é desejada, a partir do passo 3,7) três vezes em PBS. Isto é feito através da substituição de uma solução várias vezes com PBS fresco num agitador rotativo três vezes durante 10 min. </li><li> Preparar a solução de agar-agar a 2% em PBS, e deixe esfriar para ~ 65 ° C. Coloque as fatias planas na parte inferior de um pequeno prato de 30 milímetros de diâmetro petri, incorporar fatias em ágar-ágar e deixe esfriar até sólido. </li><li> Cole um bloco de agar com uma fatia ou fatias incorporado ao palco de um vibratome e coloque estágio no corte de câmara com PBS. </li><li> Ressecção fatias a 70 mm de espessura incorporado. Opcional: Após a ressecção, fatias podem ser coradas, ou seja, com Neurotrace para revelar citoarquitetura (Figura 3A, C), e / ou bimunofluorescência y para YFP ou mCherry para aumentar o sinal da proteína de fusão Chr. </li><li> fatias de montagem em lâminas e lamela com meios de montagem. Locais de injecção imagem e, se desejado, também as fatias de imagem contendo fibras nas áreas de projecção utilizando um microscópio de fluorescência ou um microscópio confocal de laser de varrimento (Figura 2A-C). </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo descreve um método para ex vivo investigação optogenetic dos circuitos neurais e conectividade local que pode ser facilmente implementados na maioria, se não todos, verticais fatia de gravação de patch-clamp setups, equipando-os com um ~ 470 LED no porto luz epifluorescência nm. Uma grande vantagem da estimulação optogenetic de projecções axonais em fatias é que ele permite a activação e a investigação das propriedades de ligações que não eram acessíveis com estimulação eléctrica convencional esp...

ferramentas precisas para visualização e ativação simultânea de conexões específicas entre áreas do cérebro e tipos específicos de neurônios estão se tornando mais importante para entender as conectividade funcional subjacentes função cerebral e doença estados saudáveis. Idealmente, isso implica investigação fisiológica das propriedades sinápticos precisos com que identificaram os neurônios se comunicam. Isto é particularmente verdadeiro para as ligações entre as áreas do cérebro que não podem ser conservados em uma única fatia cerebral aguda. No passado, isto foi largamente conseguido em experiências separadas. Por um lado, marcadores neurais injectados in vivo, foram empregues combinada com luz ou subsequente análise microscópica de electrões de parceiros de pré- e pós-sinápticos. Por outro lado, quando a partir de feixes de fibras da região de origem são preservados e acessíveis na preparação fatia, estimulação eléctrica tem sido utilizada para avaliar os mecanismos de comunicação com células sinápticas na região alvo. Com o advento de Optogenetics, a expressão específica de canais de catiões de luz fechado, tais como Channelrhodopsins (CHRS) fundida com proteínas fluorescentes, permite agora que a activação de neurónios e as suas trajectórias de axonais embora permitindo a sua visualização e post-hoc de análise anatómica 1- 4. Porque axônios ChR expressam pode ser estimulada mesmo quando separado do somata pai 5, é possível, em fatias de cérebro para: 1) avaliar entradas de regiões do cérebro que não eram acessíveis com estimulação elétrica convencional, porque tratos de fibras não são separáveis ​​ou a trajetória específica não é conhecida; 2) inequivocamente identificar a região de origem para entradas específicas que foram postuladas, mas incompletamente compreendida; e 3) investigar a conectividade funcional entre tipos celulares definidos, tanto a nível local e nas projeções de longo alcance. Devido a um certo número de vantagens, este mapeamento optogenetic de circuitos em fatias de cérebro tornou-se largamenteLY utilizado nos últimos anos e uma variedade de vectores virais para expressão de chrs marcadas com fluorescência estão prontamente disponíveis a partir de fornecedores comerciais. Algumas das principais vantagens da ativação optogenetic sobre estimulação elétrica convencional não são danos ao tecido devido à colocação de eletrodos de estimulação, a especificidade da estimulação da fibra, porque a estimulação elétrica pode também recrutar fibras de passagem ou outras células vizinhas, e um estímulo igualmente rápida e temporalmente preciso. Além disso, a injecção estereotáxica de vectores virais pode ser facilmente orientada para áreas específicas do cérebro 6 e expressão específica condicional ou tipo de célula pode ser conseguido usando expressão de Cre-dependente e / ou promotores específicos 7. Aqui, esta técnica é aplicada para o mapeamento de longo alcance e circuitos locais no sistema de medo. A amígdala é uma região-chave para a aquisição e expressão do medo, e armazenamento de medo e memórias emocionais 8,9. Além froestou a amígdala, o córtex pré-frontal medial (mPFC) e hipocampo (HC), estruturas que são mutuamente ligadas à amígdala, estão implicadas nos aspectos de aquisição, consolidação e recuperação de medo e extinção memórias 10,11. Actividade em subdivisões do mPFC parece desempenhar um papel duplo no controle de alta e baixa medo afirma 12,13. Isso pode em parte ser mediada por conexões diretas de mPFC para a amígdala que controlaria atividade da amígdala e saída. Por isso, nos últimos anos, vários estudos começaram em ex vivo experimentos fatia para investigar as interações sinápticas entre aferentes mPFC e células-alvo específicos na amígdala 14-17. Durante a aprendizagem medo, a informação sensorial sobre os estímulos condicionado e incondicionado atinge a amígdala através de projeções de regiões do tálamo e córtex específicos. Plasticidade destes insumos aos neurônios na parte lateral (LA) da basolamígdala ateral (BLA) é um importante mecanismo subjacente medo condicionado 9,18. Evidências crescentes sugerem que os processos de plástico paralelas na amígdala envolvem elementos inibitórios para controlar memória do medo 19. Um grupo de neurônios inibitórios em cluster são os GABAérgicos paracapsular intercalados células mediais (mpITCs), mas a sua conectividade e função precisa não é completamente compreendida 20-22. Aqui, o mapeamento do circuito optogenética é utilizado para avaliar aferentes e eferentes conectividade dessas células e seu impacto sobre os neurônios-alvo na amígdala, demonstrando que mpITCs recebe entrada sensorial direta de estações retransmissoras talâmicos e corticais 23. expressão específica do ChR em mpITCs ou neurônios BLA permite o mapeamento das interações locais, revelando que mpITCs inibir, mas também são mutuamente ativado por, BLA principais neurônios, colocando-os em circuitos inibitórios feed-forward e feedback novos que controlam eficazmente a atividade BLA23.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Surgery</td></tr><tr><td>Stereotaxi frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>pode ser substituído por outro quadro estereotáxico para camundongos</td></tr><tr><td>Steretoxic frame mouse adaptor</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td>pode ser substituído por outro quadro estereotáxico para camundongos</td></tr><tr><td>Máscara de anestesia a gás para camundongos</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>não está mais disponível, substituído pelo item nº. 51609M</td></tr><tr><td>Dispositivo de injeção de pressão, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, EUA</td><td>T25-2-900</td><td>outros dispositivos de injeção de pressão (por exemplo, Picospritzer) podem ser usados</td></tr><tr><td>Kwik Fill capilares de vidro</td><td>World Precision Instruments, Alemanha</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Alemanha</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura DC e almofada de aquecimento</td><td>FHC, EUA</td>Extrator de Micropipetas Horizontal <td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Modelo P-1000</td><td>Sutter Instruments, EUA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de ferramentas cirúrgicas, Esterilizador 75</td><td>Melag, Alemanha</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (sorotipo 2/9)</td><td>Penn Vector Core, EUA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (sorotipo 2/9)&nbsp;</td><td>Penn Vector Core, EUA</td><td>AV-9-20938M</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (sorotipo 2/1)&nbsp;</td><td>Penn Vector Core, EUA</td><td>AV-1-20298P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Alemanha</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Anestésico Isoflurano, Isofuran CP (1ml/ml)</td><td>CP Pharma, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-séptico, Betadine (iodo-providona)</td><td>Produtos Purdure, EUA</td><td>BSOL32</td><td>pode ser substituído por outro desinfetante</td></tr><tr><td>Analgésico, Solução Metacam (5mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Alemanha</td><td></td><td>pode ser substituída por outros analgésicos</td></tr><tr><td>Pomada para os olhos Bepanthen</td><td>Bayer, Alemanha</td><td>0191</td><td>pode ser substituída por outra pomada para os olhos</td></tr><tr><td>Broca NM3000 (SNKG1341 e SNIH1681)</td> <td>Nouvag, Suíça</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Suture Needle</td><td>Fine Science Tools, Alemanha</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de seda trançada</td><td>Fine Science Tools, Alemanha</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Gravações, estimulação de luz e análise</td></tr><tr><td>líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF)</td><td>para composição, consulte as referências #16 e #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>soluções de remendo interno</td><td>para composição, consulte as referências #16 e #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Roth, Alemanha</td><td>P027.1</td><td>prepare solução estoque 2M em purificado Fatiador de água</td></tr><tr><td>, Microm HM650V</td><td>Fisher Scientific, Alemanha</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de resfriamento para cortador de tecido, CU65</td><td>Fisher Scientific, Alemanha</td><td>770180</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de safira</td><td>Delaware Diamond Knives</td><td></td><td>pedido personalizado, consulte a empresa</td></tr><tr><td>Estereoscópio, SZX2-RFA16</td><td>Olympus, Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada fluorescente Xcite (XI120Q-1492)</td><td>Lumen Dynamics Group, Canadá</td><td>2012-12699</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de patch, BX51WI</td><td>Olympus, Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de patch Multiclamp 700B&nbsp;</td><td>Molecular Devices, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitdata 1440A</td><td>Molecular Devices, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PClamp software, Versão 10</td><td>Molecular Devices, EUA</td><td></td><td>usado para controlar a aquisição de dados e estimulação</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura do banho, TC05</td><td>Luigs & Neumann, Alemanha</td><td>200-100 500 0145</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador de três eixos Mini 25</td><td>Luigs & Neumann, Alemanha</td><td>210-100 000 0010</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de micromanipulador SM7</td><td>Luigs & Neumann, Alemanha</td><td>200-100 900 7311</td><td></td></tr><tr><td>capilares de vidro para pipetas de patch</td><td>World Precision Instruments, Alemanha</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro de nitrato de celulose para câmara de interface&nbsp;</td><td>Satorius Stedim Biotech, Alemanha</td><td>13006--50----ACN</td><td></td></tr><tr><td>unidade de LED, CoolLED pE</td><td>CoolLED, Reino Unido</td><td>244-1400</td><td>CoolLED ou USL 70/470 e adaptadores apropriados são duas opções alternativas para estimulação de LED</td></tr><tr><td>CoolLED 100 Dual Adapt</td><td>CoolLED, Reino Unido</td><td>pE-ADAPTOR-50E</td><td>CoolLED ou USL 70/470 e adaptadores apropriados são duas opções alternativas para unidade de LED de estimulação de LED</td></tr><tr><td>, USL 70/470</td><td>Rapp Optoelectronic</td><td>L70-000</td><td>CoolLED ou USL 70/470 e adaptadores apropriados são duas opções alternativas para estimulação de LED</td></tr><tr><td>Adaptador de porta dupla</td><td>Rapp Optoeletrônico</td><td>consulte a empresa</td><td>CoolLED ou USL 70/470 e os adaptadores apropriados são duas opções alternativas para estimulação de LED</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros vermelho (excitação)</td> <td>AHF, Alemanha</td><td>F49-560</td><td>Os filtros podem ser comprados como conjunto F46-008</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (divisor de feixe)</td><td>AHF, Alemanha</td><td>F48-585</td><td>Os filtros podem ser comprados como conjunto F46-008</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (emissão)</td><td>AHF, Alemanha</td><td>F47-630</td><td>Os filtros podem ser comprados como conjunto F46-008</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros verde (excitação)</td><td>AHF, Alemanha</td><td>F39-472</td><td>Alternativas: conjunto de filtros F36-149 ou F46-002 (com emissão passa-banda)</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (divisor de feixe)</td><td>AHF, Alemanha</td><td>F43-495W</td><td>Alternativas: conjunto de filtros F36-149 ou F46-002 (com emissão passa-banda)</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (emissão)</td><td>AHF, Alemanha</td><td>F76-490</td><td>Alternativas: conjunto de filtros F36-149 ou F46-002 (com emissão passa-banda)</td></tr><tr><td>LaserCheck, medidor de potência portátil</td><td>Coherent, EUA</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>IgorPro Software, Versão 6</td><td>Wavemetrics, EUA</td><td></td><td>para análise de dados de eletrofisiologia, outros pacotes de software alternativos também podem ser usados&nbsp;</td></tr><tr><td>Suíte neuromática de macros para IgorPro</td><td>http://www.neuromatic.thinkrandom.com</td><td></td><td>para análise de dados de eletrofisiologia, outros pacotes de software alternativos também podem ser usados&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Análise post hoc de injeções e projeções</td></tr><tr><td>Paraformaldeído em pó (PFA)</td><td>Roth, Alemanha</td><td>0335.2</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrace 435/455 mancha de Nissl fluorescente azul</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479</td><td></td></tr><tr><td>ágar-ágar para incorporação e ressecção</td><td>Roth, Alemanha</td><td>5210.3</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri de 30 x 10 mm para incorporação</td><td>SPL Life Podem</td><td>ser utilizadas alternativas</td>de ciências <td></td></tr><tr><td>Slides, Super Frost</td><td>R. Langenbrinck, Alemanha</td><td>61303802</td><td>podem ser utilizadas</td></tr><tr><td>lamínulas de cobertura</td><td>R. Langenbrinck, Alemanha</td><td>3000302</td><td>podem ser utilizadas</td></tr><tr><td>Suportes de montagem alternativos Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories, EUA</td><td>Podem ser utilizados meios de montagem alternativos</td><td>H-1000</td></tr> filtro de <tr><td>nitrato de celulose para achatamento fatias para fixação</td><td>Satorius Stedim Biotech, Alemanha</td><td>11406--25------N</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal de Varredura a Laser LSM 710</td><td>Zeiss, Alemanha</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo optogenética dissection de circuitos medo no cérebro slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

optogenetic abordagens são agora amplamente utilizados para estudar a função de populações neurais e circuitos através da combinação de expressão de proteínas alvo activado por luz e subsequente manipulação da actividade neuronal pela luz. Channelrhodopsins (CHRS) são-canais de catiões de luz fechado e quando fundida com uma proteína fluorescente sua expressão permite a visualização e a activação simultânea de tipos específicos de células e as suas projecções axonais em áreas definidas do cérebro. Através de injecção estereotáxica de vectores virais, as proteínas de fusão CHR pode ser expresso constitutivamente ou condicionalmente em células específicas de uma região do cérebro definido, e as suas projecções axonais pode subsequentemente ser estudados anatomicamente e funcionalmente através da activação optogenetic ex vivo em fatias de cérebro. Isto é de particular importância quando se pretende entender propriedades sinápticas de ligações que não podem ser abordados com as abordagens de estimulação elétrica convencional, ou na identificação de romance affealuguel e conectividade eferente que anteriormente foi mal compreendida. Aqui, alguns exemplos ilustram como esta técnica pode ser aplicada para investigar estas perguntas para elucidar circuitos relacionados com o medo na amígdala. A amígdala é uma região-chave para a aquisição e expressão do medo, e armazenamento de medo e memórias emocionais. Muitas linhas de evidência sugerem que o córtex pré-frontal medial (mPFC) participa em diferentes aspectos da aquisição medo e extinção, mas a sua conectividade preciso com a amígdala está apenas começando a ser entendida. Em primeiro lugar, é mostrado como a activação ex vivo optogenetic pode ser usado para estudar os aspectos da comunicação sináptica entre os aferentes mPFC e células-alvo na amígdala basolateral (BLA). Além disso, está ilustrado que como esta abordagem ex vivo optogenetic podem ser aplicadas para avaliar novos padrões de conectividade utilizando um grupo de neurónios GABAérgicos na amígdala, o cluster paracapsular célula intercalada (mpITC), como um exemplo.

Esta seção mostra o fluxo de trabalho de uma abordagem ex vivo optogenética e resultados representativos de diferentes estratégias experimentais para investigar as propriedades fisiológicas das projeções sensoriais e moduladores de longo alcance para BLA e neurônios mpITC bem como propriedades de conectividade local entre mpITC e BLA. Após a injecção estereotáxica de o vector viral seleccionado nas coordenadas desejad...

abordagens optogenética são amplamente utilizados para manipular a atividade neural e avaliar as consequências para o funcionamento do cérebro. Aqui, uma técnica que é descrita por expressão in vivo do activador channelrodopsina óptico, permite a análise ex vivo de propriedades sinápticos de longo alcance específico e conexões neurais locais em circuitos relacionados com o medo.

Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

O objetivo geral deste experimento é investigar as propriedades funcionais e sinápticas de projeções neurais e microcircuitos utilizando optogenética ex-vivo. Isso inclui a expressão da canalrorodopsina e sua ativação em projeções específicas combinadas com gravações por patch-clamp. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre as propriedades sinápticas da conectividade local e de longa distância dentro e entre áreas cerebrais.Isso é ilustrado aqui por meio da investigação dos circuitos neurais que sustentam o comportamento de medo. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite estudar circuitos e sinapses que não podem ser analisados com técnicas convencionais de estimulação elétrica. Em geral, pessoas novas nesse método precisarão superar o desafio de realizar todas as etapas necessárias da forma mais adequada.Isso inclui o direcionamento estereotáxico de injeções virais, a identificação do tempo ótimo de expressão para a canalorodopsina, o preparo de fatias cerebrais de boa qualidade e a ativação luminosa estável e as gravações. Antes de iniciar esta parte do procedimento, um vetor viral adeno-associado recombinante projetado para expressar a canalorod

ex-vivo-optogenetic-dissection-of-fear-circuits-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O vídeo demonstra a geração de fatias de amígdala inclinadas a partir de um cérebro de camundongo. O cérebro é posicionado em um ângulo no estágio de espécime de vibratomo para obter fatias contendo a amígdala e os axônios do córtex pré-frontal medial que formam conexões sinápticas com a amígdala. As fatias do cérebro são mantidas na temperatura fisiológica para preservar o tecido para experimentos futuros.

Geração de fatias de amígdala inclinadas a partir de um cérebro de camundongo

Este vídeo demonstra a preparação de finas fatias de cérebro coronal de um cérebro murino, expondo as regiões da amígdala ricas em conexões sinápticas do córtex pré-frontal medial. As fatias são então recuperadas em líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado para manter a viabilidade neuronal.

Gerando uma fatia de cérebro coronal expondo as regiões da amígdala de um cérebro de camundongo

Este vídeo descreve um método para obter imagens e registrar simultaneamente a atividade elétrica de fatias cerebrais transgênicas que contêm proteínas fluorescentes específicas de neurônios. O procedimento envolve a manutenção da fatia do cérebro em uma câmara de perfusão com líquido cefalorraquidiano artificial aerado, usando uma fonte de luz para excitar células marcadas com fluorescência e registrando os sinais elétricos com uma sonda multicanal e um grampo de remendo.

Monitoramento óptico e eletrofisiológico simultâneo de células neuronais em fatias cerebrais

Este vídeo demonstra um procedimento para analisar a conectividade sináptica entre o córtex pré-frontal medial (mPFC) e os neurônios da amígdala usando fatias agudas de cérebro de amígdala de camundongos. Os neurônios mPFC nesses camundongos expressam a canalrodopsina fundida a uma proteína fluorescente. As channelrodopsinas facilitam o influxo de íons e a geração de potencial de ação nos neurônios mPFC após a ativação da luz. Consequentemente, os neurônios mPFC liberam neurotransmissores que...

Visualização e mapeamento de vias neuronais em uma fatia de cérebro de amígdala

Descrevemos um método para caracterizar a topografia funcional e as propriedades sinápticas dos circuitos do prosencéfalo usando uma abordagem optogenética para fotoestimular populações neuronais in vitro.

Fotoestimulação de varredura a laser de circuitos de prosencéfalo optogeneticamente direcionados

Este protocolo descreve um conjunto de métodos para identificar a conectividade funcional específica do tipo de célula de entradas de longo alcance de regiões cerebrais distantes usando estimulações optogenéticas em fatias de cérebro ex vivo.

In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato

Com a manipulação optogenética de populações neuronais específicas ou regiões cerebrais, o comportamento pode ser modificado com alta resolução temporal e espacial em animais em movimento livre. Usando diferentes ferramentas optogenéticas em combinação com fibras ópticas cronicamente implantadas, uma variedade de modulações neuronais e testes comportamentais podem ser realizados.

Manipulação optogenética da atividade neuronal para modular o comportamento em camundongos em movimento livre

As fatias cerebrais ex vivo podem ser usadas para estudar os efeitos de anestésicos voláteis em respostas evocadas a diferentes entradas. A optogenética é empregada para ativar independentemente os afferents thalamocortical e corticocortical ao neocórtex não primário, e as respostas sinápticas e de rede são moduladas com isoflurano.

Ativação optogenética de caminhos diferentes em fatias cerebrais e modulação de respostas por anestésicos voláteis

Este protocolo demonstra um método simples e robusto para estudar na dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio. Ele descreve como preparar ex vivo fisiologicamente relevantes fatias cerebrais agudas e fornece um pipeline de análise amigável.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

O paradigma do medo observacional avalia o congelamento vicário em roedores como um modelo de empatia afetiva. Este procedimento envolve a exposição de roedores observadores a demonstradores coespecíficos que recebem choques aversivos nas patas para provocar respostas empáticas de congelamento. Ao empregar ensaios observacionais de medo, os pesquisadores podem investigar os mecanismos neurais subjacentes à empatia afetiva.

Medo observacional como modelo de empatia afetiva em camundongos

Aprenda a investigar propriedades sinápticas de projeções neurais usando optogenética ex vivo com channelrhodopsin e gravações patch-clamp em fatias cerebrais. Este método avança o estudo de circuitos relacionados ao medo.

Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

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