Name: Propriedades eletroativo Polymer Nanopartículas Exhibiting fototérmicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-08T14:00:01.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a sintetizar nanopartículas poliméricas condutoras com propriedades fototérmicas para terapia anticâncer. Este método demonstra técnicas de síntese sem ar e avaliação de citotoxicidade em células tumorais.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo Fundo Texas Tecnologia Emergente (Startup a TB), o Programa de Aperfeiçoamento Texas State University Research, o Texas State University Doutorado Research Fellowship (a TC), a Parceria NSF para Pesquisa e Educação em Materiais (PREM, DMR-1205670), a Fundação Welch (AI-0045), e os Institutos Nacionais de Saúde (R01CA032132).

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Os autores não têm nada a divulgar.

Neste trabalho, o NPS polímeros electroactivos foram sintetizados como agentes potenciais PTT para o tratamento do cancro. A preparação das nanopartículas está descrito, começando com a síntese dos monómeros seguida por polimerização em emulsão. Embora a preparação de PN utilizando polímeros electroactivos tais como pirrole e eDOT foi descrito antes, este documento descreve a preparação de nanopartículas poliméricas começando com monómeros de conjugação prolongados exclusivos, demonstrando que este processo pode ser est...

Polímeros electroactivos alterar as suas propriedades (cor, condutividade, reactividade, de volume, etc.) na presença de um campo eléctrico. Os tempos de comutação rápidos, tunability, durabilidade e características de polímeros eletroativos leves têm levado a muitas aplicações propostas, incluindo energia alternativa, sensores, eletrocrômicos e dispositivos biomédicos. Polímeros eletroativos são potencialmente úteis como, de peso leve e bateria de condensadores eletrodos flexíveis. 1º Os pedidos de polímeros eletroativos em dispositivos electrocrómicos incluem sistemas de redução de brilho-de edifícios e automóveis, óculos de sol, óculos de proteção, dispositivos de armazenamento ópticos, e têxteis inteligentes. 2-5 janelas inteligentes podem reduzir as necessidades energéticas através do bloqueio de comprimentos de onda específicos de luz on-demand e proteger interiores de casas e automóveis. Têxteis inteligentes pode ser usado em roupas para ajudar a proteger contra a radiação UV. 6 polímeros eletroativos ter alsO começaram a ser utilizados em dispositivos médicos. Entre os polímeros electroactivos utilizados em dispositivos biomédicos, polipirrol (PPy), polianilina (PANI), e poli (3,4-etilenodioxitiofeno) (PEDOT) estão entre os mais comuns. Por exemplo, esses tipos de polímeros são normalmente utilizados como transdutores em dispositivos biossensores 7 Aplicações em administração terapêutica também mostraram-se promissoras.; Estudos demonstraram a libertação de fármacos e proteínas terapêuticas a partir de dispositivos preparados a partir de polímeros electroactivos 8-12. Mais recentemente, polímeros electroactivos têm sido utilizados como agentes terapêuticos em terapia fototérmico. 13-15 Em terapia fototérmico, agentes fototérmicas deve absorver a luz no próximo -infrared (NIR) região (~ 700-900 nm), também conhecida como a janela terapêutica, em que a luz tem a profundidade máxima de penetração no tecido, tipicamente até 1 cm. 16,17 Neste intervalo, cromóforos biológicos, tais como a hemoglobina , oxigenado hemoglobina, lípidos e água têm pouco ou nenhumabsorção, o que permite que a luz penetre facilmente. Quando os agentes fototérmicas absorvem a luz nesta janela terapêutica, o fotoenergia é convertida em energia fototérmico. Irvin e colaboradores tenham relatado anteriormente bis-eDOT monómeros de benzeno que foram sintetizados utilizando o acoplamento de Negishi alcoxi-substituído. 18 acoplamento de Negishi é um método preferido para a formação da ligação carbono-carbono. Este processo tem muitas vantagens, incluindo o uso de intermediários de organozinco, que são menos tóxicos e tendem a ter uma maior reactividade do que outros compostos organometálicos utilizados. 19,20 compostos de organozinco também são compatíveis com uma vasta gama de grupos funcionais sobre os organohalides. 20 No reacção de acoplamento de Negishi, um organohalide organometálico e estão acoplados através da utilização de um catalisador de paládio (0) como catalisador. 20 No trabalho aqui apresentado, este método de acoplamento cruzado é utilizado na síntese de 1,4-dialcoxi-2,5-bis ( 3,4-ethylenedioxythienyl) Benzemonômeros ne (2 Bedot-B (OR)). Estes monómeros podem então ser facilmente polimerizado electroquimicamente ou quimicamente para produzir polímeros que são candidatos promissores para utilização em aplicações biomédicas. Os métodos convencionais para a preparação de suspensões poliméricas coloidais em soluções aquosas para aplicações biomédicas envolvem tipicamente a dissolução de polímeros granel seguido por técnicas de evaporação de emulsão ou nanoprecipitação-solvente 21,22. De modo a produzir nanopartículas de poli (Bedot-B (OU) 2) , uma abordagem bottom-up é demonstrado aqui, onde os PN são sintetizados através de polimerização em emulsão situ. Polimerização em emulsão é um processo que é facilmente escaláveis ​​e é um método relativamente rápido para a preparação NP. 22 Estudos utilizando polimerização em emulsão para produzir NPs de outros polímeros electroactivos têm sido relatados para PPy e PEDOT. 15,23,24 PEDOT NPs, por exemplo, foram preparadas usando emulsão de pulverização polymerization. 24 Este método é difícil de reproduzir, e, normalmente, produz partículas micronizadas maiores. O protocolo descrito neste artigo explora a utilização de um método de drop-sonicação para preparar reprodutivelmente NPs de polímero de 100 nm. Neste protocolo, polímeros eletroativos adaptado para absorver a luz na região do NIR semelhante ao poli relatado anteriormente (Bedot-B (OR) 2) são sintetizados e caracterizados para demonstrar o seu potencial em dispositivos electrocrómicos e como agentes de PPF. Em primeiro lugar, o protocolo para a síntese dos monómeros de acoplamento de Negishi via é descrita. Os monómeros são caracterizados por RMN e espectroscopia de UV-Vis-NIR. A preparação de suspensões coloidais NP através de polimerização em emulsão em meios aquosos oxidativo também é descrito. O procedimento baseia-se num processo de polimerização por emulsão em dois passos anteriormente descrito por Han et al., Que é aplicado aos diferentes monómeros. Um sistema de dois surfactante éutilizado para controlar a monodispersity NP. Um ensaio de viabilidade celular é utilizada para avaliar citocompatibilidade das NPs. Por último, o potencial destes NPS para actuar como transdutores de PTT é demonstrada por irradiação com um laser NIR.

<table><tbody><tr><td>Eletrodo de trabalho de platina de 2 mm de diâmetro</td><td>CH Instruments</td><td>CH102</td><td>Polido usando lixa muito fina</td></tr><tr><td>3,4-etilenodioxitiofeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>483028</td><td>Purificado por destilação a vácuo</td></tr><tr><td>Brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazólio (MTT) 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L11939</td><td></td></tr><tr><td>505 Desmembrador Sônico</td><td>Fisher Scientific&trade; &nbsp;</td><td>FB505110</td><td>ponta de 1/8" e classificada em 500&nbsp; watts</td></tr><tr><td>de diodo laser de 808 nm</td><td>ThorLabs</td><td>L808P1WJ</td><td>Avaliado em 1 W</td></tr><tr><td>Acetonitrila anidra 99%</td><td>Acros</td><td>61022-0010</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>Bromohexano 98%</td><td>MP Biomedicals</td><td>202323</td><td></td></tr><tr><td>Diálise (100.000) MWCO</td><td>SpectrumLabs</td><td>G235071</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido 99% (DMSO)</td><td>BDH</td><td>BDH1115</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamida anidra (DMF) 99%</td><td>Acros</td><td>326870010</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil benzenossulfonato (DBSA)&nbsp;</td><td>TCI</td><td>D0989</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s meio de águia modificado (DMEM)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-013 CV</td><td></td></tr><tr><td>EMS 150 TES revestidor por pulverização catódica</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol (EtOH) 100%</td> <td>BDH</td><td>BDH1156</td><td></td></tr><tr><td>etil 4-bromobutirato (98%)</td> <td>Acros</td><td>173551000</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etila 99%</td> <td>Fisher</td><td>UN1173</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td> <td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Helios NanoLab 400</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Fisher</td><td>H306-4</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl)</td><td>Fisher</td><td>A142-212</td><td></td></tr><tr><td>Hidroquinona 99,5%</td><td>Acros</td><td>120915000</td><td></td></tr><tr><td>Hidrozina anidra 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215155</td><td></td></tr><tr><td>óxido de índio estanho (ITO) revestido galss</td><td>Delta Technologies</td><td>CG-41IN-CUV</td><td>4-8 &Omega;/sq</td></tr><tr><td>Cloreto de ferro 97% FeCl3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio (MgSO4)</td><td>Fisher</td><td>593295</td><td>Seco a 100 &#176; C</td></tr><tr><td>SKOV-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>BDH</td><td>BHD1135</td><td></td></tr><tr><td>n-Butlithium (2,5 M)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230707</td><td></td></tr><tr><td>Poli(ácido estirenossulfonato-co-málico) pirofórico (PSS-co-MA) 20.000 MW</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434566</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209619</td><td>Seco a 100 &#176; C</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de potássio</td><td>Fisher</td><td>P410-100</td><td></td></tr><tr><td>RO-5 placa de agitação</td><td>IKA-Werke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SC4000 Câmera IR</td><td>FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Hybrid Reader</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perclorato de tetrabutilamônio (TBAP) 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>3579274</td><td>Purificado por recristalização em acetato de etila</td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano anidro (THF) 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>tetraquis(trifenilfosfina) paládio(0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216666</td><td>Termomixer sensível à umidade</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>USB potenciostato/galvanostato WaveNow</td><td></td><td>AFTP1</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano Zs</td><td>Arranjo Óptico Malvern</td><td></td><td>175&#176;</td></tr><tr><td>Cloreto de zinco (1 M) ZnCl2</td><td>Acros</td><td>370057000</td><td></td></tr></tbody></table>

propriedades eletroativo polymer nanopartículas exhibiting fototérmicos

Electroactive Polymer Nanoparticles Exhibiting Photothermal Properties

Um método para a síntese de polímeros eletroativos é demonstrado, começando com a síntese de monômeros de conjugação estendida usando um processo de três etapas que termina com o acoplamento de Negishi. O acoplamento de Negishi é um processo de acoplamento cruzado no qual um precursor químico é primeiro litiado, seguido de transmetalação com ZnCl2. O composto organozinco resultante pode ser acoplado a um precursor aromático dibromado para dar o monômero conjugado. Os filmes de polímero podem ser preparados por meio de eletropolimerização do monômero e caracterizados usando voltametria cíclica e espectroscopia ultravioleta-visível-infravermelho próximo (UV-Vis-NIR). As nanopartículas (NPs) são preparadas por meio da polimerização em emulsão do monômero usando um sistema de dois surfactantes para produzir uma dispersão aquosa dos NPs do polímero. Os NPs são caracterizados usando espalhamento dinâmico de luz, microscopia eletrônica e espectroscopia UV-Vis-NIR. A citocompatibilidade de NPs é investigada usando o ensaio de viabilidade celular. Finalmente, as suspensões NP são irradiadas com um laser NIR para determinar sua eficácia como materiais potenciais para terapia fototérmica (PTT).

O protocolo de reacção obtendo-se M1 e M2 é mostrado na Figura 1. Os monómeros podem ser caracterizados por 1 H e 13 C RMN espectroscopia, ponto de fusão e análise elementar. O espectro de RMN 1 H fornece informações sobre a conectividade de átomos e seus ambientes eletrônicos; Assim, é rotineiramente utilizada para verificar que as reacções tenham sido concluída com êxito. Reacções de acoplamento de Negishi envolvem o ac...

Um protocolo é apresentado para a síntese e preparação de nanopartículas constituídas por polímeros eletroativos.

Propriedades eletroativo Polymer Nanopartículas Exhibiting fototérmicos

A method for the synthesis of electroactive polymers is demonstrated, starting with the synthesis of extended conjugation monomers using a three-step ...

O objetivo geral deste protocolo é preparar nanopartículas poliméricas condutoras que exibam propriedades fototérmicas e avaliar sua citotoxicidade. As nanopartículas de polímero condutor são agentes ideais para terapia fototérmica porque absorvem a luz na faixa do infravermelho próximo e a convertem em calor para matar as células cancerígenas. A principal vantagem dos agentes de fototerapia polimérica é que eles podem ser adaptados para ajustar suas propriedades de absorção por uma capacidade de compatibilidade e direcionamento do tumor para permitir uma terapia eficaz e não invasiva do câncer localizado.Os polímeros que estamos usando para terapia fototérmica também podem ser usados para aplicações de energia alternativa, sensores e eletrocrômicos. Indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque a reação é sensível à umidade. Uma boa compreensão das técnicas de síntese sem ar é essencial.A demonstração visual de ensaios de cultura de células é fundamental, pois as técnicas estéreis são difíceis de dominar. Todos os ensaios multifuncionais requerem precisão e consistência para alcançar resultados adequados. Em um balão de fundo redondo de três gargalos, prenda um septo, um condensador equipado com um adaptador de controle de entrada e um adaptador de controle de saída de gás.Conecte o adaptador de saída de gás a um borbulhador. Em seguida, conecte o adaptador de entrada a uma linha Shlenk de argônio com tubo de PVC de parede grossa. Iniciar o fluxo de argônio para o balão de reação e deixar o gás fluir por vários minutos.Depois de ligar o aspirador, use um bico de Bunsen para secar a reação e, em seguida, purgue o aparelho com argônio. Repita isso mais duas vezes para obter um ambiente sem ar. Use uma seringa para adicionar um vírgula zero sete gramas de EDOT ao aparelho através do septo.Adicione 20 mililitros de tetrahidrofurano ao frasco e mexa. Preparar um banho de acetona com gelo seco num balão Dewar de forma baixa e arrefecer o balão EDOT durante 15 minutos a 78 graus Celsius negativos. Em seguida, caia a 11 milimoles de n-butillítio em hexanos, mantendo uma temperatura de menos 78 graus Celsius.Após a adição completa, mexa por mais uma hora. Deve-se ter extremo cuidado ao manusear reagentes de organolítio. Essas soluções são excepcionalmente perigosas e só devem ser manuseadas por alguém que tenha sido extensivamente treinado em seu uso.Remova o banho de acetona com gelo seco. E, imediatamente, comece uma adição gota a gota de 14 vírgula 13 mililitros de uma solução de cloreto de zinco molar, mexendo por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, adicione quatro milimoles de um quatro dialcoxi, dois cinco dibromobenzeno e 80 micromoles de paládio tetraquis, trifenilfosfina, à reação.Comece a refluir a reação a 75 graus Celsius com um banho de óleo. Todos os dias, use uma seringa para coletar uma pequena amostra da mistura de reação. Precipite a amostra em dois mililitros de ácido clorídrico molar e use dois mililitros de diclorometano para extrair o material.Localize o extrato em uma cromatografia de camada fina de sílica, ou placa TLC, ao lado de soluções pré-fabricadas de EDOT purificado e o correspondente quatro dialcoxi dois cinco dibromobenzeno. Use uma solução 60 a 40 de acetato de etila e hexanos para desenvolver a placa em uma câmara de vidro. Quando a reação estiver completa, em três a cinco dias, resfrie a reação à temperatura ambiente.Adicione 10 mililitros de um ácido clorídrico molar seguido de 20 mililitros de diclorometano para extinguir a reação. Transferir a reacção para uma ampola de separação e isolar a camada orgânica. Lave os orgânicos com água deionizada até que as lavagens com água não sejam mais ácidas.Em seguida, seque os orgânicos em mais de 15 gramas de sulfato de magnésio. Depois de filtrar o sólido, remova o solvente usando um evaporador rotativo para produzir um sólido amarelo laranja. Em um copo vil, prepare um mililitro de dois por cento de peso em volume PSS-co-MA em água e adicione uma pequena barra de agitação.Prepare uma solução de monômero de 16 miligramas por mililitro em clorofórmio e transfira 100 microlitros para um tubo microcentrifugado. Dissolva 30 miligramas de ácido dodecilbenzeno sulfônico no tubo da microcentrífuga e, em seguida, use um misturador de vórtice automático por 30 a 60 minutos para homogeneizar a solução. Em seguida, adicione a fase orgânica homogeneizada em alíquota de 10 microlitros à solução de PSS-co-MA de dois por cento a cada 60 segundos.Após a adição completa, dilua a solução com dois mililitros de água e remova a barra de agitação. Coloque a emulsão em um banho de gelo e, em seguida, use uma sonda para sonicar a emlusão com dois intervalos de 10 segundos a uma amplitude de 30 por cento. Remova o frasco do banho de gelo e recoloque a barra de agitação para continuar misturando a emulsão.Em seguida, adicione três vírgula oito microlitros de uma solução aquosa de cem miligramas por mililitro de cloreto de ferro à emulsão de monômero e mexa por uma hora para produzir nanopartículas de polímero estabilizadas com PSS-co-MA. Transfira a suspensão de nanopartículas para tubos de centrífuga de sete mililitros e centrifugue a suspensão a 75.600 vezes G por três minutos. Finalmente, recupere o sobrenadante e dialise em água por 24 horas usando um tubo de diálise de corte de peso molecular de 100 kilodaltons.Cultura SCOV três células de câncer de ovário em DMEMs suplementadas com 10% de soro fetal bovino a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono em frascos T 75. Depois de dissociar e contar as células usando protocolos padrão, alimente as células a uma densidade de 5.000 células por poço em uma placa de 96 poços. Incube as células por 24 horas a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono.Imediatamente antes do uso, iluda a suspensão de nanopartículas em meio de crescimento total a uma concentração de um miligrama por mililitro. Filtre a suspensão de nanopartículas através de um filtro estéril de dois micrômetros de ponto zero. Em seguida, dilua a suspensão até as concentrações de exposição desejadas com meio de crescimento total suplementado com estreptomicina de penicilina a um por cento.Remova suavemente o meio de cada poço e substitua por 100 microlitros da suspensão de nanopartículas em várias concentrações de exposição. Depois de incubar as células, remova cuidadosamente a solução e substitua o meio por 100 microlitros de solução estéril filtrada de cinco miligramas por mililitro de MTT. Incube as células por duas a quatro horas na incubadora.Em seguida, examine as células ao microscópio para verificar a formação de cristais de Formazan. Remova cuidadosamente a solução de MTT e substitua-a por 100 microlitros de dimetilsulfóxido. Coloque o prato em uma coqueteleira e misture por alguns minutos.Finalmente, meça os absorventes de cada poço em 590 nanômetros e 700 nanômetros. Esses valores correspondem ao pico de absorventes do produto Formazan e a uma linha de base, respectivamente. Os monômeros resultantes podem ser caracterizados por espectroscopia de RMN de hidrogênio e carbono 13.As reações de acoplamento de Negishi ligam o anel fenil ao EDOT, fazendo com que o pico do próton fenil mude de sete pontos um PPM para sete pontos oito PPM. O próton de Theyenel também muda para cima para seis vírgula cinco PPM. Os quatro prótons nos carbonos da ponte etilenodioxi se dividem em dois conjuntos de múltiplos em quatro vírgula três PPM.O espectro de RMN do carbono 13 exibe picos em um 70, um 45, um 40 e um 13 para os carbonos do tienel, e um 50, um 20 e um 12 para os carbonos do fenileno. A compatibilidade cital de nanopartículas poliméricas é determinada usando um ensaio de viabilidade celular MTT. Dentro da faixa de concentração de nanopartículas de zero vírgula dois três a 56 microgramas por mililitro, as nanopartículas não diminuem a viabilidade celular para menos de 90% do controle.Normalmente, uma redução na viabilidade celular de menos de 20% é considerada aceitável. Uma vez dominado, leva cerca de uma semana para sintetizar o monômero, outra semana para purificá-lo e menos de um dia para preparar e purificar as nanopartículas. O estudo de citotoxicidade pode ser concluído em dois dias e meio desde a semeadura das células até a conclusão do ensaio.Ao tentar estudos celulares in vitro, é fundamental seguir técnicas assépticas adequadas. Estudos adicionais, como ensaios de mortos vivos, estudos de microscopia e biodistribuição in vivo e estudos de ovulação fototérmica, podem ser realizados com as nanopartículas preparadas por meio desses protocolos para entender melhor seu potencial como agentes fototérmicos para a terapia do câncer.

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Research

JoVE Journal

Engineering

Engenharia

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