Name: 从混合三维培养使用近红外Photoimmunotherapy技术选择性细胞消除 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: 学习利用近红外光免疫疗法从混合三维细胞培养中选择性消除靶细胞的技术。该方法通过IR700抗体偶联实现精准靶向，最大限度减少对周围细胞的损伤，为组织工程和再生医学研究提供高效工具。

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本研究由美国国立卫生研究院、国家癌症研究所、癌症研究中心的院内研究计划资助。

注意：以下方案描述了使用近红外光免疫治疗（NIR-PIT）清除特定细胞所需的步骤。有关NIR-PIT的对照设置及其他细节以及细胞活力的信息，可参见其他文献18。
1. 将 IR700 与单克隆抗体（mAb）偶联
<ol>
	<li>将待研究的单克隆抗体在 0.1 M Na 中配制为 2–5 mg/ml 的浓度2HPO4 (pH 8.6) 溶液</li>
	<li>将 6.8 nmol 的 mAb 与 30.8 nmol 的 10 mM IR700 在 0.1 M Na 中混合2HPO4 在微量离心管中加入溶液（pH 8.6），避光室温孵育1小时。</li>
	<li>用15 ml PBS洗涤PD-10层析柱（见材料/设备表）两次，然后上样步骤1.2中的样品。</li>
	<li>按照制造商说明书，通过PD-10柱以PBS洗脱纯化混合物。 
	注意：此处洗脱位置依据IR700的条带颜色确定。对于300 µl样品，PBS洗脱组分通常在2.5 ml至4.4 ml之间。</li>
	<li>使用分光光度计在595 nm处测定考马斯亮蓝染色的吸光度以确定蛋白质浓度9. 通过在 689 nm 处的吸光度测定 IR700 的浓度，以确认每个单克隆抗体分子上偶联的荧光染料分子数量9. 
	注意：使用分光光度计确定每分子单克隆抗体（mAb）上偶联的IR700分子的最佳数量至关重要。通常，每分子mAb偶联约3个IR700分子时，效果最佳 体外 和 体内 工作。可使用高效液相色谱法（HPLC）和SDS-PAGE方法来确认单克隆抗体（mAb）与IR700是否结合。</li>
	<li>测定蛋白浓度后，于 4 °C 保存。</li>
</ol>
2. 混合三维细胞培养物（混合类球体）的制备
<ol>
	<li>向悬滴板的板槽部分加入无菌水（约1 ml）。</li>
	<li>制备不同比例的目标细胞类型——A431-luc-GFP 细胞和 3T3-RFP 细胞——每个样品总细胞数为 5,000 个，悬浮于 50 µl 培养基中。 
	注意：配制 1:100、10:100、25:100、50:100 等等。 根据细胞类型，培养基中目标细胞类型的比率。</li>
	<li>在37 °C、5%二氧化碳的湿化培养箱中，将混合物于96孔悬滴板中孵育5-7天。每2天更换一次培养基。注意：为精确形成三维球状体，操作板时应轻柔，因为在形成三维结构前，含细胞的液滴容易脱落。</li>
	<li>使用倒置明场显微镜在10X至40X放大倍数下观察类球体的形态和大小。注意：尽管类球体大小取决于细胞类型和悬滴体积，但应确保在96孔悬滴板中培养7天后，类球体直径约为400–600 µm。</li>
</ol>
3. 体外 用于混合三维细胞共培养的近红外光免疫治疗
<ol>
	<li>将悬滴培养板中的培养基更换为含有10 µg/ml抗体-光吸收剂偶联物（APC）的培养基，并在37 °C、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育6小时。</li>
	<li>孵育6小时后，用新鲜的培养基（不含酚红）清洗类球体两次。使用已剪去尖端的无菌200 µl移液枪头，将类球体轻柔转移至含有100 µl新鲜不含酚红培养基的玻璃底50 mm培养皿中。每个培养皿中放置一个类球体。</li>
	<li>使用倒置明场显微镜观察类球体，检测其形态变化。若需观察光学报告分子（例如，GFP和RFP），请使用荧光显微镜并设置以下滤光片：GFP — 469 nm激发滤光片和525 nm发射滤光片；RFP — 559 nm激发滤光片和630 nm发射滤光片。</li>
	<li>将发光二极管（LED）置于玻璃底培养皿上方进行照射。 
	注意：类球体可在显微镜下或超净台内接受近红外光（NIR）照射。
	<ol>
		<li>使用光学功率计9测量近红外光的功率密度。根据该测量结果，通过发射波长为670至710 nm的发光二极管（LED）照射近红外光，剂量为2 J/cm2。 
		注意：LED光最大穿透深度约为5英寸。近红外光免疫治疗（NIR-PIT）的细胞毒性效应仅取决于给予的能量，与功率密度和照射时间无关23。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>照射后，将类球体转移至新的悬滴培养板中，加入50 µl新鲜培养基，并在37 °C、5%二氧化碳的湿化培养箱中继续孵育1天。</li>
	<li>使用已剪去尖端的无菌200 µl移液枪头，将类球体轻柔转移至含有100 µl新鲜培养基（不含酚红）的玻璃底培养皿中。在近红外光免疫治疗（NIR-PIT）后1天，使用步骤3.3中所述的滤光片设置，通过荧光显微镜观察类球体。
	<ol>
		<li>通过向培养基中加入碘化丙啶至终浓度为2 µg/ml，或通过荧光显微镜观察胞质GFP荧光的丢失情况来检测死亡细胞（图2B）14,18,22。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若靶细胞未被完全清除，则重复步骤3.1–3.6。</li>
</ol>

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<li>Sato, K., Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy%3A+Comparative+effectiveness+of+two+monoclonal+antibodies+targeting+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor.</a> Mol. Oncol. 8 (3), 620-632 (2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+for+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases.</a> Cancer Lett. 365 (1), 112-121 (2015).</li>
<li>Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Photoimmunotherapy+in+the+Treatment+of+Disseminated+Peritoneal+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer.</a> Mol. Cancer Ther. 14 (8), 141-150 (2014).</li>
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<li>Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+Targeting+Prostate-Specific+Membrane+Antigen%3A+Are+Antibody+Fragments+as+Effective+as+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies.</a> J. Nucl. Med. 56 (1), 140-144 (2014).</li>
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<li>Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+prevents+lung+cancer+metastases+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model.</a> Oncotarget. 6 (23), 19747-19758 (2015).</li>
<li>Nakajima, T., Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+conjugate+and+light+dose+on+photo-immunotherapy+induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity.</a> BMC cancer. 14 (1), 389(2014).</li>
<li>Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derive+and+conquer%3A+sourcing+and+differentiating+stem+cells+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7 (2), 131-142 (2008).</li>
<li>Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+cell+and+cytokine+targets+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 10 (2), 77-88 (2014).</li>
<li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们展示了一种利用近红外光免疫治疗（NIR-PIT）在不损伤非靶细胞的前提下，从混合的三维细胞培养物中特异性清除目标细胞的方法。迄今为止，一旦组织构建完成或移植后，尚无切实可行的细胞清除方法。因此，NIR-PIT 是实现这一目标的有前景的技术。该技术还可被用于 体内18,22, 由于APC的药代动力学与单克隆抗体（mAb）本身相似，因此可通过使用不同类型的APC来靶向特定的细胞类型。已有多种抗体或抗体片段被用作APC，包括抗EGFR、抗PSMA、抗间皮素（anti-mesothelin）和抗CEA抗体。15-21此外，通过改变近红外光照射区域，可缩小治疗范围。在此，通过定量检测靶细胞中的荧光素酶活性和荧光信号，证实了特定细胞的完全清除。
近红外光免疫治疗（NIR-PIT）是一种基于光的治疗方法，因此光源与靶点之间的距离至关重要，因为光能量及其导致的细胞坏死效应随距离的平方成反比递减（步骤 3.4）。为了精确形成三维球状体，应尽可能轻柔地处理和孵育培养板。在形成...

在已形成的组织中，特异性清除特定细胞而不损伤其他细胞极为困难，组织工程领域迫切需要一种能够在组织中实现细胞清除的方法。目前，在再生医学领域，利用胚胎干细胞（ES）、多能干细胞（PSCs）或诱导性多能干细胞（iPS）进行的组织培养被视为极具前景的材料1-3。
尽管这种组织再生具有广阔前景，但存在 unwanted 细胞污染的重大隐患。此外，移植后还存在致瘤性的安全顾虑4,5。尽管已有许多研究聚焦于解决这些问题，以清除特定细胞，尤其是在再生医学领域6-8，但至今尚未开发出切实可行的方法。
近红外光免疫治疗（NIR-PIT）是一种基于抗体-光吸收剂偶联物（APC）的治疗方法。APC由靶向细胞特异性单克隆抗体（mAb）和光吸收剂IR700组成。IR700是一种亲水性硅基酞菁衍生物，其本身不产生光毒性9。IR700通过赖氨酸分子侧链上的酰胺残基与抗体共价结合。APC可结合细胞膜上的靶分子，在690 nm近红外光照射后几乎立即诱导细胞坏死。在近红外光照射过程中，细胞膜破裂，导致细胞死亡9-14。研究表明，NIR-PIT可与多种抗体或抗体片段联合使用，包括抗EGFR、抗HER2、抗PSMA、抗CD25、抗间皮素、抗GPC3和抗CEA15-21，因此NIR-PIT可用于多种不同的靶分子。此外，通过限制近红外光的照射区域，NIR-PIT可实现精确控制，选择性地治疗特定部位18,22。
本文介绍了一种利用近红外光免疫治疗（NIR-PIT）从混合的三维培养物中特异性清除目标细胞的方法。

<table><tbody><tr><td>IRDye 700DX 酯类近红外染料</td><td>LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)</td><td>929-70011</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 柱（PD-10）&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie（Bradford）Plus 蛋白定量试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)</td><td>PI-23200</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta3D 96 孔悬滴培养板</td><td>3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)</td><td>HDP1096-8</td><td></td></tr><tr><td>光功率计</td><td>Thorlabs (Newton, NJ, USA)</td><td>PM100</td><td></td></tr><tr><td>LED：L690-66-60</td><td>Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)</td><td>L690-66-60</td><td></td></tr><tr><td>Vectibix（帕尼单抗）</td><td>Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35&amp;nbsp;mm 玻璃底培养皿，皿直径 35&amp;nbsp;mm，孔直径 10&amp;nbsp;mm</td><td>Cellvis (Mountain View, CA, USA)</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr></tbody></table>

利用近红外光免疫疗法从混合三维培养物中选择性清除细胞

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

近年来，组织工程领域的进展为多种疾病提供了创新的解决方案。例如，利用诱导性多能干细胞（iPS细胞）进行组织工程已成为再生医学中的一种新方法。尽管这种组织再生技术前景广阔，但在组织培养过程中存在非目标细胞污染的主要问题。此外，移植后还存在致瘤性的安全顾虑。因此，迫切需要一种能够在不损伤需保护细胞的前提下，特异性清除特定细胞的方法，尤其是在已形成的组织中。本文介绍了一种从混合的三维细胞培养体系中特异性清除目标细胞的方法。 体外 利用近红外光免疫治疗（NIR-PIT）在不损伤非靶向细胞的情况下，实现对混合细胞培养物或组织中特定细胞的清除。

为了光学监测近红外光免疫治疗（NIR-PIT）的效果，对过表达EGFR的A431细胞系进行基因改造，使其同时表达GFP和荧光素酶（A431-luc-GFP）。作为NIR-PIT的非靶向细胞，Balb/3T3细胞系则经光学改造表达RFP（3T3-RFP）。合成了抗体-光敏剂复合物APC，即帕尼单抗-IR700（pan-IR700）。根据本方案构建了由不同比例细胞（A431-luc-GFP与3T3-RFP）组成的混合类球体（图1）。通过加入pan-IR700并进行重复的NIR-PIT处理（参见图2A中的处理方案），实现了对混合三维培养体系中靶向细胞的清除，并通过荧光信号和荧光素酶活性进行监测（图2B, C）。另一方面，非靶向细胞则持续生长。
<img alt="A431-luc-GFP 和 3T3-RFP 混合分析、荧光显微镜、GFP/RFP 在不同细胞比...

在不损伤其他细胞的情况下消除特定细胞极为困难，尤其是在已形成的组织中，然而组织工程领域迫切需要一种能够在组织中实现细胞清除的方法。本文介绍了一种利用近红外光免疫疗法（NIR-PIT）从混合的三维细胞培养体系中特异性清除目标细胞的方法。

近年来，组织工程领域的进展为多种疾病的治疗提供了创新解决方案。例如，利用诱导性多能干细胞进行组织工程……

本实验方案的总体目标是通过近红外光免疫疗法，从混合的三维细胞培养物中清除特定的目标细胞。该方法有助于解答组织工程领域中关于再生医学的关键问题。该技术的主要优势在于，其可针对多种靶分子发挥作用，并且治疗可局限于特定的目标病灶。因此可最大限度地减少副作用。将目标单克隆抗体与IR700在磷酸二钠溶液中混合，于微量离心管中室温避光孵育一小时，以实现IR700与单克隆抗体的偶联。孵育结束后，用15毫升PBS洗涤PD10柱两次。然后，将抗体溶液上样至柱中，并根据制造商说明书通过 PBS 洗脱纯化混合物。为确认每个单克隆抗体分子上偶联的 fluoro-4 分子数量，使用分光光度计测定单克隆抗体的蛋白浓度。随后，将偶联产物于 4 摄氏度保存。为制备混合三维细胞培养，向96孔悬滴培养板的板储液区加入1毫升无菌水。随后，在适宜的细胞培养基中，以每孔至少5,000个细胞/50微升培养基的比例接种目标细胞类型的不同组合，在37°C、5%二氧化碳的湿润培养箱中培养5至7天。每两天更换一次培养基，并使用倒置明场显微镜在10至40倍放大倍数下每日观察类球体的形态和大小。当类球体直径达到400至600微米时，将悬滴培养板中的培养基更换为含抗体-光吸收剂偶联物的培养基，并将培养板放回培养箱中继续孵育6小时。孵育结束后，用新鲜的酚红-free培养基洗涤类球体两次。然后使用剪去末端的200微升枪头，将类球体逐个转移至含有玻璃底的50毫米培养皿中，每个培养皿中预先加入100微升新鲜的酚红-free培养基。使用倒置显微镜观察类球体形态的变化。对类球体进行照射时，将发光二极管置于玻璃底培养皿上方不超过5英寸的位置，并使用光功率计确认发射波长为670至710纳米，能量密度为2焦耳/平方厘米。近红外光免疫治疗后，将类球体转移至新的悬滴培养板中，在细胞培养箱中用每孔50微升新鲜培养基继续培养一天。然后，使用另一支末端切平的200微升移液枪头，轻轻将类球体转移至含有100微升酚红-free培养基的新玻璃底培养皿中，并在荧光显微镜下评估光学报告基因的表达。最后，通过向培养基中加入碘化丙啶来检测死亡细胞。或通过细胞质中GFP荧光的丢失来判断。在此代表性实验中，如前所述制备了由不同比例的A431-luc-GFP和3T3-RFP细胞组成的混合类球体，随后按照图示方法，在加入panitumumab-IR700孵育后，重复进行近红外（NIR）光免疫治疗。通过评估悬滴培养物中的荧光和荧光素酶活性来监测靶细胞的清除情况。若操作得当，掌握该技术后可在一小时内完成实验。在进行该操作时，需注意光强度遵循平方反比定律而衰减。

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学习利用近红外光免疫疗法从混合三维细胞培养中选择性消除靶细胞的技术。该方法通过IR700抗体偶联实现精准靶向，最大限度减少对周围细胞的损伤，为组织工程和再生医学研究提供高效工具。

利用近红外光免疫疗法从混合三维培养物中选择性清除细胞

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