Indução de Maternal Immune Activation em Ratos na Fase Mid-gestação com Viral Mimic poli (I: C)

O objetivo geral deste procedimento é induzir a ativação imune materna, ou MIA, em camundongos por meio da injeção intraperitoneal do análogo viral poli em estágio embrionário de meio de gestação. Este método pode nos ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neuroimunologia, como, por exemplo, como a disfunção imunológica pode levar a perturbações no desenvolvimento cerebral e no comportamento. A principal vantagem desta técnica é que ela foi especificamente projetada para pesquisadores interessados em estudar a MIA como um fator de risco ambiental para autismo e esquizofrenia.

Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois pequenas diferenças no método de indução de MIA podem alterar significativamente a resposta posterior na prole. Para montar um casal de acasalamento cronometrado, comece alojando cinco camundongos fêmeas por gaiola lado a lado em gaiolas padrão para camundongos, a fim de sincronizar seus ciclos estrais, e utilize uma perfuração na orelha para identificar cada animal. De zero a duas horas antes do início do ciclo escuro, aloje as fêmeas duas por gaiola, pese e registre o peso corporal de cada camundongo individualmente, e então adicione um camundongo macho por gaiola contendo duas fêmeas.

De zero a quatro horas após o término do ciclo escuro, levante suavemente cada camundonga pela base da cauda, permitindo que o animal segure a grade da gaiola com as patas dianteiras, para verificar a existência de uma massa esbranquiçada na abertura vaginal. Se uma tampão não for aparente, insira suavemente uma ponteira de pipeta de 200 microlitros na abertura vaginal. A resistência proveniente da coagulação confirma a formação de um tampão.

Agrupe os camundongos com tampão vaginal em uma nova gaiola, pois a presença de um tampão vaginal confirma apenas que a cópula ocorreu. Nos dias embrionários 10,5 a 11,5, levante cada fêmea com tampão pelo início da cauda e observe uma saliência no abdômen, depois pese os camundongos para verificar a gravidez e aloje os animais prenhes em gaiolas limpas individuais. Pese o pó de poli(I:C) em um cônico de 50 mililitros.

No dia embrionário 12,5, adicione o volume apropriado de cloreto de sódio 0,9% ao volume correspondente de poli(I:C) em um tubo cônico e feche a tampa. Gire suavemente a gota de solução salina sobre o pó até que a solução fique límpida. Em seguida, centrifugue o tubo e transfira a solução de poli(I:C) para um tubo de microcentrífuga.

Utilize um espectrofotômetro para medir a razão entre 260 e 280 nm da solução de poli(I:C). A razão deve estar entre 1,54 e 1,82, conforme descrito pelo fabricante. Em seguida, pese o primeiro camundongo e carregue uma seringa de insulina de 0,3 mililitro com o volume calculado correspondente da solução de poli(I:C).

Em seguida, pegue o camundongo pela cauda, coloque-o sobre a tampa da gaiola e segure-o firmemente pela nuca. Agora, insira a agulha, com o bisel voltado para cima, no centro dos dois mamilos superiores em um ângulo de aproximadamente 20 graus em relação ao camundongo, e administre a solução de poli(I:C). Em seguida, devolva o camundongo à gaiola.

Após a injeção de todos os camundongos, mantenha as gaiolas em um ambiente silencioso e com pouco tráfego para evitar outros efeitos de confusão e pese os camundongos na manhã seguinte. Pelo menos três dias antes dos testes comportamentais, troque a cama das gaiolas dos descendentes adultos com ativação imune materna ou MIA, com idade entre oito e doze semanas. Trinta minutos antes do teste, aclimatize os camundongos ao ambiente de testes.

Para um teste de inibição do estímulo prepulsante, imobilize os camundongos em cilindros de plexiglass sobre um sensor piezoelétrico. Acostume o camundongo à câmara de inibição do estímulo prepulsante por cinco minutos, com seis ensaios de 120 decibéis de ruído branco. Em seguida, exponha os camundongos a misturas aleatórias de sons, conforme descrito na tabela, e compare os resultados com a resposta inicial de sobressalto, para determinar a inibição do estímulo prepulsante nos animais com ativação imunológica materna (MIA).

Para um teste de campo aberto, coloque um camundongo no canto de uma arena quadrada aberta, com uma zona central definida de 17 por 17 centímetros, e registre a trajetória do camundongo por 10 minutos por meio de uma câmera montada no teto. Em seguida, quantifique as entradas na zona central e o tempo gasto nessa zona. Para o teste de enterramento de bolinhas, acostume um camundongo a uma gaiola de teste com cama de pinho aspen limpa, compactada com cinco centímetros de profundidade, por 10 minutos; depois, devolva o camundongo à sua gaiola de origem e organize cuidadosamente 20 bolinhas de vidro azul-marinho com diâmetro de 1,5 centímetro em uma grade de quatro por cinco na gaiola de teste.

Agora, retorne o camundongo à gaiola de teste por 10 minutos, depois coloque o animal de volta à gaiola de vivência e conte o número de bolinhas de gude enterradas durante o período do teste. A injeção de poly(I:C) no dia embrionário 12,5 pode provocar uma resposta inflamatória aguda no eixo materno-placentário-fetal e desencadear um efeito crônico no desenvolvimento cerebral e em fenótipos comportamentais. De fato, o poly(I:C) induz uma expressão mais elevada do gene Il6 no baço materno, na placenta e no cérebro fetal, três horas após a injeção.

De modo geral, quando comparados com descendentes adultos tratados com solução salina, os descendentes adultos de MIA apresentam menor número de entradas na zona central e uma duração mais curta na zona central no teste de campo aberto. Os animais injetados com poli(I:C) também exibem comportamentos de enterramento mais frequentes no teste de enterramento de bolinhas, além de uma inibição do pré-estímulo reduzida. A perda de células de Purkinje no lobo sete do cerebelo é outra característica marcante dos descendentes de MIA, com um número menor de células de Purkinje positivas para calbindina observado no lobo sete do cerebelo desses animais, em comparação com os controles injetados com solução salina.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de não perturbar os camundongos prenhes após a indução de IAM. Posteriormente, fatores adicionais, como estresse ou infecção pós-natal, podem ser induzidos para estudar interações ambientais adicionais.