Name: Indução de Maternal Immune Activation em Ratos na Fase Mid-gestação com Viral Mimic poli (I: C) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda a induzir ativação imune materna em camundongos gestantes usando injeção intraperitoneal de poli(I:C) no estágio médio da gestação. Este método padronizado auxilia pesquisadores a estudar disfunções imunes no desenvolvimento cerebral e comportamento.

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Nós gostaríamos de homenagear o falecido Dr. Paul H. Patterson por suas contribuições para o progresso do modelo MIA, autismo e pesquisa da esquizofrenia. Nós reconhecemos Sarkis K. Mazmanian por seu grande apoio a este protocolo; Ruben M. Bayon, Yvette Garcia-Flores, Karen C. Lencioni, e Leslie A. Neumann de assistência administrativa; Ali Khoshnan e Jan C. Ko para a assistência sobre as filmagens; Elaine Y. Hsiao e Natalia Malkova para os seus conselhos na indução MIA; Jeffrey S. Cochrane, Joaquin Gutierrez, Kwan F. Lee, Jaime Rodriguez, Lorena C. Sandoval, e Natalie A. Verduzco para a sua criação de animais especialista. Este trabalho foi financiado pelo NIH Award Conte Center (NIH 5P50MH086383-04, de Paul H. Patterson); Autism Speaks (# 7670, a Paul H. Patterson); Fundação Simons (# 322839, com Sarkis K. Mazmanian); NIH Training Grant (NIH / NRSA T32GM07616 de K.-HC); Caltech Verão Graduação Research Fellowship (SURF) (para ZY); Amgen Scholars Programa no Caltech (para ZY); e pós-doutorado frConselho om National Science, Taiwan (NSC 101-2917-I-564-039, para W.-LW).

Todos os protocolos foram realizados sob a aprovação do California Institute of Comité Cuidados e Uso de Animais Institucional Tecnologia (IACUC). 1. Preparação para Pairs cronometrado-acasalamento <ol><li> Use pelo menos 6 barragens para experimentos comportamentais e 3 para análise da expressão gênica. NOTA: Use o dobro do número de ratos fêmeas estimados, já que apenas cerca de 50% dos ratos será conectado a partir da cronometrado-acasalamento. </li><li> Use ratos fêmea com nenhum gravidez antes e, 8-16 semanas de idade. NOTA: os ratos fêmeas que tenham exposição sexual antes de camundongos machos, mas não foram grávida são aceitáveis. </li><li> Casa a ratos fêmea juntos e colocar as gaiolas ao lado do outro, a fim de sincronizar o ciclo estral. Use uma gaiola de ratos padrão com uma altura de mais de 5,5 polegadas e um piso interior 75 polegada quadrada para permitir habitação de 5 ratos adultos. Etiquetar cada rato fêmea utilizando um soco orelha. </li></ol> 2. Configurando cronometrado-mating Pair <ol><li> Configure o cronometrado-acasalamento 0-2 horas antes do ciclo escuro começa. Coloque dois ratos fêmeas em cada gaiola. Retire os ratos e pesá-los individualmente. Registe o peso do corpo de cada ratinho fêmea. </li><li> Coloque um rato macho em cada gaiola com as duas fêmeas de camundongo. Use trio de acoplamento para minimizar o efeito paterno confundindo. </li></ol> 3. Vaginal bujão de verificação (E0.5) <ol><li> Verifique a fêmea ratos 0-4 horas após o ciclo escuro termina. Levante cuidadosamente o rato fêmea da base da cauda e permitir que o mouse para pegar a grade de arame, gaiola superior, ou a borda gaiola. </li><li> Procurar sinais de plugue vaginal: plugue vaginal é uma massa esbranquiçada visível na abertura vaginal. Se a ficha não é óbvio, insira suavemente uma ponteira 200 mL na abertura vaginal. Resistência de coagulação confirma formação de um tampão vaginal. Verifique o plugue vaginal uma vez por dia. NOTA: plugue Vaginal é apenas uma indicação de que a cópula ocorreu e, portanto, não ggravidez ARANTIA. rolhão vaginal podem ser difíceis de identificar, em determinadas estirpes de murganhos. Procure a ajuda de um cuidador ratos experiente para aumentar a precisão da identificação plugue. </li><li> Mova os ratos ligados a uma nova gaiola e grupo abrigá-los. Definir o dia da aparição plugue vaginal como embrionária 0,5 dia (E0.5). </li></ol> 4. Na E10.5-11.5, verificar se a gravidez <ol><li> Levante cuidadosamente a base da cauda e permitir que o mouse para pegar a grade de arame, gaiola superior, ou a borda gaiola. Observe a área do abdômen para verificar se há sinais de gravidez, por exemplo, uma protuberância no abdômen (Figura 1). NOTA: O sinal de gravidez é sempre mais óbvio à E11.5 do que em E10.5. </li><li> Pesar os ratinhos para verificar a gravidez. O ratinho grávida geralmente pesa cerca de 20% mais pesados ​​em E10.5 e 30% mais pesados ​​em E12.5 em comparação com um ratinho não grávidas (Figura 2). Única casa os ratos grávidas em gaiolas limpas. </li></ol> 5. 20 mg /kg de poli (I: C) Preparação <ol><li> Use pelo menos 6 barragens por grupo para experimentos comportamentais e 3 por grupo para análise de expressão de genes. Prepara-se o valor correspondente de poli (I: C). </li><li> Pesa-se o poli (I: C) de pó num tubo de 50 ml para fazer uma concentração final de 40 mg / ml. A fim de minimizar e padronizar o stress causado pelo volume de injecção, injectar 5 ul de poli (I: C) por cada grama de peso corporal do rato (5 mL / g, ou 5 ml / kg). Para induzir a MIA, que injectar 20 mg de poli (I: C) por kg. NOTA: A concentração de poli (I: C) é necessária (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml. Uma vez que a poli (I: C) em pó contém 10% de poli (I: C), é necessário fazer uma concentração final de ml de poli (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / (I: C). CUIDADO: O poli (I: C) em pó é muito leve. Tenha cuidado para não perder qualquer pó durante a transferência da espátula para o tubo cônico. </li><li> Adicionar o volume correspondente de cloreto de sódio a 0,9% (solução salina) para a banheira cónicae e fechar a tampa. Dissolve-se o pó por laminagem suavemente a gota de solução salina através da poli (I: C) de pó até a solução ficar clara. Centrifuga-se o tubo cónico a 800 xg durante 1 min (Figura 3C). Filtra-se o poli: solução por filtro de 0,22? M (I C). Transferir o poli: solução (I C) para um tubo de 1,5 ou 2 ml de microcentrífuga. Opcional: Use um espectrofotómetro para medir a razão entre o poli (I: C) 260/280 solução. Assegurar o rácio situa-se entre 1,54-1,82 (Figura 3) tal como descrito pelo fabricante. NOTA: A solução salina utilizada para dissolver o poli (I: C) em pó e servem como controlo de injecção deve ser de grau farmacêutico e estéril. </li></ol> 6. Saline ou poli (I: C) Injeção em E12.5 <ol><li> Pesar o rato na escala e colocá-lo de volta para a jaula. Utilize a seguinte fórmula para calcular o volume de injecção tanto para solução salina e poli (I: C) ratos: o peso corporal (g) multiplicados por 5 = volume de injecção desejado (ul). Use um insul 0,3 mlem seringa para elaborar o volume calculado de solução salina ou 20 mg / kg de poli (I: C), por exemplo, 150 mL de um rato 30 g. </li><li> Gentilmente pegar o mouse pela base da cauda e colocá-lo no topo da gaiola. Lidar com o mouse com cuidado para evitar efeitos de confusão induzida por stress. Inserir a agulha, bisel para cima, a aproximadamente 20 ° em relação ao rato para o centro dos seus dois bocais superiores (Figura 4), ​​e injectar o (I: C) solução salina ou solução de poli. NOTA: A agulha deve ser substituída para cada rato após a injeção. </li><li> Posicione o mouse de volta para sua gaiola. Coloque as gaiolas numa zona calma, de baixo sala de tráfego para evitar outros efeitos de confusão. </li></ol> 7. O Dia Depois de poli (I: C) Injeção (E13.5) <ol><li> Verificar os ratinhos injectados na manhã seguinte. Use uma escala para medir o peso corporal. NOTA: poli (I: C) injectados murganhos grávidas geralmente ganhar menos peso do que os murganhos injectados solução salina no dia após a injexão. </li><li> Não perturbe os ratos até que a prole nascem. </li></ol> 8. Medidor de MIA Offspring <ol><li> A fim de minimizar os efeitos de indução de MIA, siga as diretrizes listadas abaixo para medir o uso de MIA prole. <ol><li> Excluir as ninhadas de prematuro ou nascimento atrasado, ou se o tamanho da leitegada é menor do que 5. </li><li> Euthanize os filhotes excessivas de CO 2, se o tamanho da ninhada é maior do que 10. </li></ol></li></ol> 9. Opcional: Examine a resposta inflamatória aguda Após MIA <ol><li> Sacrificar a grávida ratos 3 horas após soro fisiológico ou poli (I: C) injecção utilizando o método descrito no protocolo aprovado-comité cuidados com os animais da instituição. NOTA: Deslocação cervical é muitas vezes preferido, uma vez que minimiza o efeito de CO drogas 2 / eutanásia sobre a barragem e do embrião. </li><li> Recolher o baço dos camundongos grávidas adultos e isolar a placenta e bra fetalno sob o microscópio estereoscópico. <ol><li> Para a coleta de baço, coloque o mouse sobre a placa de dissecação e pulverizar 70% de etanol na região abdominal dos ratos grávidas. Utilizar um par de tesouras estéreis para fazer um corte vertical, no centro da área abdominal abaixo da caixa torácica através da pele. </li><li> O baço fica no quadrante abdominal superior, esquerda. Use uma pinça para isolar o baço. Rolar o baço em limpadores tarefa delicada para remover o tecido adiposo em torno do órgão. Recolher cerca de 50 mg de tecido do baço e colocá-los individualmente em tubos de Eppendorf com 500 RNA ul estabilizar tampão ou TRIzol para evitar a degradação do ácido nucleico. Armazenar as amostras a -80 ° C até à sua utilização congelador. </li><li> Para a coleta de placenta, retire com cuidado os cornos uterinos do corpo. Coloque as trompas uterinas num prato de Petri cheio com solução salina tamponada com fosfato autoclavado (PBS) e deixar o prato em gelo. Use duas pinças para rasgar a parede uterina e expor o saco amniótico. <ol><li>Cuidadosamente usar a pinça para abrir o saco amniótico, sem danificar a placenta e o feto. Separa-se a placenta do feto e cortar o cordão umbilical tão perto quanto possível da placenta. Remover o saco amniótico detritos a partir da placenta. Coloque a placenta individualmente em tubos de Eppendorf com 500 ul de ARN estabilizar tampão ou Trizol. Armazenar a amostra a -80 ° C até à sua utilização congelador. </li></ol></li><li> Para a coleta de cérebro fetal, armazenar o feto no RNA estabilizar tampão do passo 9.2.2 até dissecção. Amole fora da membrana pial do ventrículo do cérebro utilizando fórceps delicados # 5 sob o microscópio estereoscópico. Remova cuidadosamente toda a membrana do cérebro fetal. Coloque os cérebros fetais individualmente em tubos de Eppendorf com 500 RNA ul estabilizar tampão ou TRIzol. Armazenar a amostra a -80 ° C até à sua utilização congelador. </li></ol></li><li> Extrai-se a ARN a partir do tecido e converter o ARN em ADNc. Analisar a expressão de genes IL6 no cDNA por real-time PCR. </li><li> Extrai-se a ARN dos tecidos, seguindo o protocolo de fabrico de TRIzol. Se os tecidos são armazenados no buffer de estabilização de ARN. Descongelar a amostra e girar o buffer. Transferir o tecido por ponta para outro eppendorf com 500 mL de TRIzol e continuar a extracção de ARN. </li><li> Utilizar um espectrofotómetro para determinar a concentração de, 260/280 e 260/230 razão do ARN. Certifique-se os índices são acima de 2,0. </li><li> Eliminar a contaminação de ADN do ARN por tratamento com ADNase I. mistura de 1 ug de ARN, 1 ul de tampão de reacção 10X, 1 ul de DNase isenta de RNase, e água isenta de nuclease para um volume final de 10 ul. Incubar a mistura principal a 37 ° C durante 30 min. Adicione 1 solução DNase parada ul para terminar a reacção. Incubar a mistura a 65 ° C durante 10 min. </li><li> Reverter transcrever o RNA para cDNA. Usar 20 reacções ul, e até 1 ug de ARN total por reacção. Misture 4 l de 5x tampão de transcrição reversa (RT) mistura de reacção, 1 ul reverse transcriptase, 11 ul de molde de ARN após tratamento com ADNase I e 4 ul livre de nuclease H2O para fazer uma solução final de 20 ul. Programar as condições termociclador para RT. Uma condição genérica incluem: Passo 1: 25 ° C durante 5 min; Passo 2: 42 ° C durante 30 min; Passo 3: 85 ° C durante 5 min; Passo 4: manter a 4 ° C. Dilui-se o ADNc de 5 vezes. Para armazenagem a curto prazo, armazenar o ADNc a 4 ° C. Para armazenamento a longo prazo, congelar o cDNA a -20 ° C. </li><li> Analisar a expressão do gene IL6 no cDNA por PCR em tempo real e normalizar a expressão do gene IL-6 para a p-actina a expressão do gene. <ol><li> Faça uma mistura mestre para IL6 e detecção de β-actina. Usar 25 ul de reacção, a mistura principal para cada gene inclui 12,5 uL da mistura de SYBR Verde, 0,5 ul de 10 mM iniciador directo, 0,5 ul de 10 pM e iniciador inverso 6,5 ul livre de nuclease H 2 O. </li><li> Coloque 5 jul 5x diluída cDNA umt o fundo do poço da placa de reacção óptica de 96 poços. Pipetar 20 ul de mistura principal para cada poço, para fazer uma de 25 uL finais mistura de PCR. Triplicado, cada gene para cada amostra. Selar a placa usando película adesiva óptica. Girar a placa a 800 xg durante 3 min a 4 ° C, utilizar o programa standard de PCR em tempo real: Passo 1: 50 ° C durante 2 min; Passo 2: 95 ° C durante 10 min; Passo 3: 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos e a temperatura de 60 ° C durante 1 min. Adicionar uma etapa adicional para a curva de dissociação. </li></ol></li></ol> 10. Examine as anormalidades comportamentais em Offspring MIA Adulto (opcional): <ol><li> Execute os testes de comportamento nas idades de 8-12 semanas. Mudar a cama gaiola de pelo menos 3 dias antes do teste. Aclimatar os ratos ao ambiente de teste comportamental, pelo menos, 30 min antes do teste. </li><li> Para a inibição pré-pulso (PPI), restringir os ratos no cilindro de plexiglass com um sensor piezo-elétrico debaixo dela. Aclimatar os ratos ao PPIcâmara por 5 min. Expor os ratos com 6 ensaios de 120 dB de ruído branco (sobressalto). </li><li> Em seguida, expor os ratos com misturas randomizados de 14 ensaios de ruído de fundo, 14 ensaios de sobressalto, 14 ensaios de pré-pulso 5 dB (5 dB maior do que o ruído de fundo) + Startle (PPI5), e 14 ensaios de pré-pulso de 15 dB (15 dB mais elevados do que o ruído de fundo + Startle (PPI15). </li><li> Em média, a resposta de sobressalto para os primeiros 6 ensaios de 120 ensaios dB. Em média, a resposta de sobressalto para os outros estímulos individuais. Converter o valor para a inibição pré-pulso por (Startle - PPI5 ou PPI15) / Startle. </li><li> Para o teste de campo aberto, coloque o mouse no canto de uma arena praça aberta (50 x 50 x 50 cm 3). Grave a trajetória do rato durante 10 min através de uma câmera montada no teto. Definir o centro de como a zona central (17 x 17 cm2) na arena. Quantificar a distância percorrida, entradas de fuso centro, eo tempo passado na zona centro manualmente ou por software de análise automática baseada em imagem. </li&gt; <li> Para o teste de enterramento mármore, aclimatar o mouse para uma gaiola de teste com cinco centímetros de profundidade comprimido, roupas de cama de pinho, limpo Aspen para 10 min. Devolver o mouse para a sua homecage. Delicadamente, coloque 20 azul marinho 1,5 cm de diâmetro bolinhas de vidro na forma de 4 x 5 arranjo. Coloque o mouse de volta para a jaula de teste com berlindes para 10 min. Conte os mármores que tem sido enterrados no período de testes de 10 min. </li></ol> 11. Examine a neuropatologia cerebelar em Offspring MIA Adulto (opcional): <ol><li> Eutanásia do salina e MIA filhos adultos pelo anestésico. Perfundir o rato com 50 ml de PBS e, subsequentemente, 50 ml de 4% de paraformaldeído através do sistema cardiovascular. </li><li> Remover cuidadosamente o cérebro e pós- fixarem o cérebro em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C. Lavar o cérebro com PBS três vezes, e armazenar o cérebro em PBS com 0,02% de azida de sódio num frigorífico a 4 ° C até à sua utilização. NOTA: O cérebro fixadas posteriormente pode ser armazenado em PBS com 0,02% de SODazida ium na geladeira por até um mês. </li><li> Seção do cérebro em 50 mm fatias finas sagital utilizando vibratome. Recolher as seções do cérebro usando um pincel macio. Terminar a actividade da peroxidase endógena por incubação das secções em peróxido de hidrogénio a 0,6% durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Incubam-se as secções em anticorpo anti-calbindina diluído no tampão de bloqueio (soro de cabra a 10% com 0,1% de Triton X-100 e 0,02% de azida de sódio em PBS) durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, incubar as secções na correspondente anticorpo secundário biotinilado diluído em tampão de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Incubam-se as secções em DH avidina - peroxidase de tampão H complexo biotinilado para detectar a biotina, durante 1 h à temperatura ambiente. Desenvolver as secções utilizando o substrato de peroxidase para visualizar o antigénio. Lavam-se as secções com PBS três vezes entre os passos. Montar as secções em lâminas de microscópio. Imagem as seções sob o microscópio. </li></ol&gt;

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<li>Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+transformations+of+neurodevelopmental+sequences+across+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species.</a> J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).</li>
<li>Abazyan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+interaction+of+mutant+DISC1+and+immune+activation+produces+adult+psychopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology.</a> Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).</li>
<li>Meyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+behavioral+and+pharmacological+dysfunctions+following+disruption+of+the+fetal+brain+balance+between+pro-inflammatory+and+IL-10-mediated+anti-inflammatory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling.</a> Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).</li>
<li>Vuillermot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+immune+activation+interacts+with+genetic+Nurr1+deficiency+in+the+development+of+attentional+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments.</a> J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).</li>
<li>Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Litter+size+predicts+adult+stereotypic+behavior+in+female+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).</li>
<li>Harvey, L., Boksa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereological+comparison+of+GAD67+and+reelin+expression+in+the+hippocampal+stratum+oriens+of+offspring+from+two+mouse+models+of+maternal+inflammation+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy.</a> Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

indução MIA em diferentes janelas de tempo perturba diferentes eventos de desenvolvimento cerebral em roedores e, consequentemente, leva a anomalias comportamentais diferentes e neuropatologias na prole. Aqui, descrevemos um protocolo para induzir MIA em camundongos com poli (I: C) injecção a E12.5. Este método de indução MIA leva a comportamental, neurológica, imunológico, e anomalias gastrointestinais associados com o autismo e esquizofrenia na prole 8,10,11,16. É importante notar que, porque MIA é um facto...

O conceito de ativação imune materna (MIA) tem origem nos estudos epidemiológicos sobre a associação da infecção materna com autismo e esquizofrenia 1. Devido à ausência de agentes patogénicos virais detectáveis ​​se replicar na placenta ou do cérebro fetal após a infecção viral materna 2,3, o efeito da infecção sobre a descendência é a hipótese de ser causadas pela activação do sistema imune materno, em vez do que os próprios agentes patogénicos . Para elucidar a relação de causa e efeito entre MIA e distúrbios psiquiátricos, injecção de quimicamente sintetizados, viral mímico dupla polyinosinic ARN de cadeia: ácido polycytidylic (poli (I: C)) em roedores grávida tem sido amplamente utilizado como modelo animal para a MIA 4,5. Poli (I: C) é reconhecida pelo receptor? Toll-like 3 (TLR3), e a administração sistémica de poli (I: C) induz-viral como a resposta inflamatória aguda. Um dos mecanismos pelos quais a poli (I: C) PRoduces anomalias comportamentais e neuropatologias na prole é por causando um desequilíbrio de citocinas pró-inflamatórias e anti no eixo materno-placentária-fetal 6. Vários grupos adotaram o modelo MIA para compreender a etiologia dos transtornos psiquiátricos 7, e devido aos diversos interesses entre grupos de pesquisa, vários pontos de tempo de ativação imune têm sido utilizados para alcançar diferentes perturbações no desenvolvimento do cérebro e comportamentos 7. O laboratório Paul H. Patterson no Califórnia Institute of Technology adota a estratégia de injecção de poli (I: C) em murganhos grávidas no dia embrionário 12,5 (E12.5), que demonstrou com sucesso que a MIA é capaz de induzir comportamental, neurológica, e alterações imunológicas na descendência que estão associados com a esquizofrenia e autismo 8-11. Nossas obras anteriores mostram que MIA prole apresentar anomalias comportamentais (por exemplo, impairmen sociaist, défice de comunicação, comportamentos repetitivos, comportamento de ansiedade-like, e latente déficit de inibição 8,10,12), imune desregulação e citocinas desequilíbrio 8,13,14, alteração da expressão do gene do cérebro fetal 15, perda de células de Purkinje no lóbulo VII do cerebelo 11, alteração de propriedades sinápticas no hipocampo 9, gene x interação ambiente 13, alteração da permeabilidade do intestino e intestino composição da microbiota 16. Além disso, as estratégias terapêuticas e profiláticas são também desenvolvido a partir deste sistema modelo 13,16,17. Ao induzir MIA em E12.5, outros mostraram que MIA produz ativação fetal microglial e alteração de desenvolvimento colinérgicos no cérebro anterior basal 18, cepa específica de interacção 19, anormalidades ultra-estruturais do cérebro sinaptossomais cerebral, mitocondriais respiratórias anormalidades cadeia hiperfunção, o downregulation das moléculas sinaptossomais cerebrais 17 ,comportamentos de tipo depressivo, déficit cognitivo e do hipocampo potenciação de longa duração (LTP) e déficit de neurogênese adulta 20. Aqui, nós fornecemos um método detalhado de como induzir MIA em E12.5 por poli (I: C), bem como os paradigmas de como aplicar este modelo para estudar a etiologia da esquizofrenia e autismo. É importante notar que a MIA é um factor de risco para uma variedade de distúrbios 4, e os seus resultados são extremamente sensíveis ao tempo e método de indução, bem como a criação de barragens grávidas. Como tal, mesmo pequenas inconsistências entre laboratórios muitas vezes resultam em baixa reprodutibilidade e / ou diferentes fenótipos na descendência. Nosso método é projetado especificamente para os interessados ​​em estudar MIA como um fator de risco ambiental para o autismo e esquizofrenia, e a descrição detalhada fornecida irá ajudar os pesquisadores a melhorar a reprodutibilidade dos seus dados.

<table><tbody><tr><td>Poliinosínico&ndash; sal de potássio ácido policitidílico</td><td>SIGMA</td><td>P9582</td><td></td></tr><tr><td>0,9% cloreto de sódio INJ. USP</td><td>HOSPIRA</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT insuline siringagem 3/10 ml 29 G x 1/2"</td><td>COVIDIEN</td><td>8881600145</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de tampa de rosca de 50 ml</td><td>USA SCIENTIFIC</td><td>1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000 espectrofotômetro</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>1000</td><td>Estereomicroscópio</td></tr><tr><td>Opcional</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>M5A</td><td>Fórceps</td></tr><tr><td>Dumont #5 Opcional Tamanho da Ponta Inox .10 X .06 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td>Reagente de</td></tr><tr><td>estabilização de RNA RNAlater</td> opcional <td>Qiagen</td><td>76104</td><td>Reagente TRIzol opcional</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>15596-026&nbsp;</td><td>opcional</td></tr><tr><td>RQ1 Rnase-free DNase</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td>Kit opcional</td></tr><tr><td>de síntese de cDNA iScript</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>Mix master universal SYBR verde FastStart opcional com ROX&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td>PCR</td></tr><tr><td>em tempo real</td> opcional <td>ABI</td><td>7300</td><td>Primer opcional</td></tr><tr><td>: Il6 forward</td><td>Life Technologies</td><td>TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC</td><td>Primer opcional</td></tr><tr><td>: Il6 Reverse</td><td>Life Technologies</td><td>TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC</td><td>Primer opcional</td></tr><tr><td>: beta-actina forward</td><td>Life Technologies</td><td>AGAGGGAAATCGTGCGTGAC</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>Primer: beta-actina Reverse</td><td>Life Technologies</td><td>CAATAGTGATGACCTGGCCGT</td><td></td></tr><tr><td>Placa de reação óptica MicroAmp opcional de 96 poços</td><td>Life Technologies</td><td>4306737</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Filme adesivo óptico MicroAmp&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4311971</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>EthoVision</td><td>Noldus</td><td>EthoVision</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>SR-LAB aparelho (PPI)</td><td>San Diego Instruments&nbsp;</td><td>Mármores de Optionl de SR-LAB</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PENN-PLAX</td><td>Mármores azuis das pedras de gema</td><td>Tecnologias</td></tr><tr><td>21600-069 da vida das tecnologias 21600-069</td> do<td>fosfato-Buffered Saline</td><td></td> de <td>Optionl</td>de Dulbecco 21600-069</tr><tr><td>Optionl Paraformaldeído</td><td>MACRON</td><td>2621-59</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma</td><td>18312</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Rabbit anti-calbindina anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab11426</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Biotinlyated goat anti-rabbit IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td>Optionl</td></tr></tbody></table>

indução de maternal immune activation em ratos na fase mid-gestação com viral mimic poli (i: c)

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

O modelo de ativação imune materna (MIA) é cada vez mais apreciado como um modelo de roedor para o fator de risco ambiental de vários transtornos psiquiátricos. Numerosos estudos demonstraram que o modelo MIA é capaz de mostrar validade de face, construto e preditiva que são relevantes para o autismo e a esquizofrenia. Para modelar MIA, os investigadores costumam usar poliinosínico: ácido policitidílico (poli (I: C)) para ativar o sistema imunológico em roedores prenhes. Geralmente, a prole de uma mãe imune ativada exibe anormalidades comportamentais e alterações fisiológicas associadas ao autismo e à esquizofrenia. No entanto, a injeção de poli (I: C) com diferentes dosagens e em diferentes momentos pode levar a resultados diferentes, perturbando o desenvolvimento do cérebro em diferentes estágios. Aqui, fornecemos um método detalhado de indução de MIA por injeção intraperitoneal (i.p.) de 20 mg / kg poli (I: C) no meio da gestação embrionária 12,5 dias (E12.5). Este método demonstrou induzir uma resposta inflamatória aguda no eixo materno-placentário-fetal, o que acaba resultando em perturbações cerebrais e fenótipos comportamentais associados ao autismo e à esquizofrenia.

<html> A injecção de 20 mg / kg de poli (I: C) em E12.5 pode evocar uma resposta inflamatória aguda no eixo materno-fetal e placentário-precipitar um efeito crónico para o desenvolvimento do cérebro e fenótipos comportamentais 12,13. Os níveis elevados de uma citocina pró-inflamatória, interleucina (IL) -6, é um indicador fiável da resposta inflamatória aguda após MIA. O tempo de pico para a expressão do gene IL6 na placenta e no cérebro fetal é de 3 horas pós-poli (I:...

A ativação imune materna (MIA) é um modelo para um fator de risco ambiental de autismo e esquizofrenia. O objetivo deste artigo é fornecer um procedimento passo a passo de como induzir MIA em camundongos prenhes, a fim de aumentar a reprodutibilidade deste modelo.

Indução de Maternal Immune Activation em Ratos na Fase Mid-gestação com Viral Mimic poli (I: C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

O objetivo geral deste procedimento é induzir a ativação imune materna, ou MIA, em camundongos por meio da injeção intraperitoneal do análogo viral poli em estágio embrionário de meio de gestação. Este método pode nos ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neuroimunologia, como, por exemplo, como a disfunção imunológica pode levar a perturbações no desenvolvimento cerebral e no comportamento. A principal vantagem desta técnica é que ela foi especificamente projetada para pesquisadores interessados em estudar a MIA como um fator de risco ambiental para autismo e esquizofrenia.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois pequenas diferenças no método de indução de MIA podem alterar significativamente a resposta posterior na prole. Para montar um casal de acasalamento cronometrado, comece alojando cinco camundongos fêmeas por gaiola lado a lado em gaiolas padrão para camundongos, a fim de sincronizar seus ciclos estrais, e utilize uma perfuração na orelha para identificar cada animal. De zero a duas horas antes do início do ciclo escuro, aloje as fêmeas duas por gaiola, pese e registre o peso corporal de cada camundongo individualmente, e então adicione um camundongo macho por gaiola contendo duas fêmeas.De zero a quatro horas após o término do ciclo escuro, levante suavemente cada camundonga pela base da cauda, permitindo que o animal segure a grade da gaiola com as patas dianteiras, para verificar a existência de uma massa esbranquiçada na abertura vaginal. Se uma tampão não for aparente, insira suavemente uma ponteira de pipeta de 200 microlitros na abertura vaginal. A resistência proveniente da coagulação confirma a formação de um tampão.Agrupe os camundongos com tampão vaginal em uma nova gaiola, pois a presença de um tampão vaginal confirma apenas que a cópula ocorreu. Nos dias embrionários 10,5 a 11,5, levante cada fêmea com tampão pelo início da cauda e observe uma saliência no abdômen, depois pese os camundongos para verificar a gravidez e aloje os animais prenhes em gaiolas limpas individuais. Pese o pó de poli(I:C) em um cônico de 50 mililitros.No dia embrionário 12,5, adicione o volume apropriado de cloreto de sódio 0,9% ao volume correspondente de poli(I:C) em um tubo cônico e feche a tampa. Gire suavemente a gota de solução salina sobre o pó até que a solução fique límpida. Em seguida, centrifugue o tubo e transfira a solução de poli(I:C) para um tubo de microcentrífuga.Utilize um espectrofotômetro para medir a razão entre 260 e 280 nm da solução de poli(I:C). A razão deve estar entre 1,54 e 1,82, conforme descrito pelo fabricante. Em seguida, pese o primeiro camundongo e carregue uma seringa de insulina de 0,3 mililitro com o volume calculado correspondente da solução de poli(I:C).Em seguida, pegue o camundongo pela cauda, coloque-o sobre a tampa da gaiola e segure-o firmemente pela nuca. Agora, insira a agulha, com o bisel voltado para cima, no centro dos dois mamilos superiores em um ângulo de aproximadamente 20 graus em relação ao camundongo, e administre a solução de poli(I:C). Em seguida, devolva o camundongo à gaiola.Após a injeção de todos os camundongos, mantenha as gaiolas em um ambiente silencioso e com pouco tráfego para evitar outros efeitos de confusão e pese os camundongos na manhã seguinte. Pelo menos três dias antes dos testes comportamentais, troque a cama das gaiolas dos descendentes adultos com ativação imune materna ou MIA, com idade entre oito e doze semanas. Trinta minutos antes do teste, aclimatize os camundongos ao ambiente de testes.Para um teste de inibição do estímulo prepulsante, imobilize os camundongos em cilindros de plexiglass sobre um sensor piezoelétrico. Acostume o camundongo à câmara de inibição do estímulo prepulsante por cinco minutos, com seis ensaios de 120 decibéis de ruído branco. Em seguida, exponha os camundongos a misturas aleatórias de sons, conforme descrito na tabela, e compare os resultados com a resposta inicial de sobressalto, para determinar a inibição do estímulo prepulsante nos animais com ativação imunológica materna (MIA).Para um teste de campo aberto, coloque um camundongo no canto de uma arena quadrada aberta, com uma zona central definida de 17 por 17 centímetros, e registre a trajetória do camundongo por 10 minutos por meio de uma câmera montada no teto. Em seguida, quantifique as entradas na zona central e o tempo gasto nessa zona. Para o teste de enterramento de bolinhas, acostume um camundongo a uma gaiola de teste com cama de pinho aspen limpa, compactada com cinco centímetros de profundidade, por 10 minutos; depois, devolva o camundongo à sua gaiola de origem e organize cuidadosamente 20 bolinhas de vidro azul-marinho com diâmetro de 1,5 centímetro em uma grade de quatro por cinco na gaiola de teste.Agora, retorne o camundongo à gaiola de teste por 10 minutos, depois coloque o animal de volta à gaiola de vivência e conte o número de bolinhas de gude enterradas durante o período do teste. A injeção de poly(I:C) no dia embrionário 12,5 pode provocar uma resposta inflamatória aguda no eixo materno-placentário-fetal e desencadear um efeito crônico no desenvolvimento cerebral e em fenótipos comportamentais. De fato, o poly(I:C) induz uma expressão mais elevada do gene Il6 no baço materno, na placenta e no cérebro fetal, três horas após a injeção.De modo geral, quando comparados com descendentes adultos tratados com solução salina, os descendentes adultos de MIA apresentam menor número de entradas na zona central e uma duração mais curta na zona central no teste de campo aberto. Os animais injetados com poli(I:C) também exibem comportamentos de enterramento mais frequentes no teste de enterramento de bolinhas, além de uma inibição do pré-estímulo reduzida. A perda de células de Purkinje no lobo sete do cerebelo é outra característica marcante dos descendentes de MIA, com um número menor de células de Purkinje positivas para calbindina observado no lobo sete do cerebelo desses animais, em comparação com os controles injetados com solução salina.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de não perturbar os camundongos prenhes após a indução de IAM. Posteriormente, fatores adicionais, como estresse ou infecção pós-natal, podem ser induzidos para estudar interações ambientais adicionais.

induction-maternal-immune-activation-mice-at-mid-gestation-stage-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Lutz, D., et al. Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural após transdução in utero do cérebro e da medula espinhal de camundongos em desenvolvimento. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra a transdução viral via injeção intra-uterina em embriões de camundongos. Uma rata grávida é preparada para a cirurgia e uma incisão na linha média é feita para expor os cornos uterinos. Uma mistura de um vírus contendo o gene desejado e um corante de rastreamento é injetada nos...

Transdução viral in utero em camundongo

O citomegalovírus (HCMV) A infecção humana de recém-nascidos representa uma importante causa de retardo mental, mas os eventos moleculares que levam à induzida por vírus patogênese ainda são pouco compreendidos. Para investigar a dinâmica da infecção cerebral, adaptamos...

Utilização de<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem para monitorar a progressão da infecção pelo citomegalovírus Experimental Rato em recém-nascidos

Desenvolvemos um modelo de coioamnionite para simular a exposição fetal à inflamação materna (FEMI) sem complicações de organismos vivos para examinar os efeitos do FEMI no desenvolvimento do trato intestinal da prole. Isso permite o estudo de causas mecanicistas para o desenvolvimento de lesões intestinais após a coioamnionite.

Um modelo murino de exposição fetal à inflamação materna para estudar os efeitos da coioamnionite aguda no desenvolvimento intestinal recém-nascido

A infecção materna é um fator de risco para distúrbios do neurodesenvolvimento. Modelos de camundongos de ativação imune materna (MIA) podem elucidar o impacto da infecção no desenvolvimento e função cerebral. Aqui, diretrizes gerais e um procedimento são fornecidos para produzir descendentes confiáveis e suscetíveis expostos ao MIA.

Gerando um Modelo Reprodutível de Ativação Imune Materna de Gestações Médias usando Poly(I:C) para Estudo de Suscetibilidade e Resiliência em Descendentes

O parto prematuro (parto &lt; 37 semanas) é um problema de saúde global urgente com opções de prevenção e tratamento abaixo do ideal. Apresentamos um modelo de camundongo de parto prematuro induzido por infecção bacteriana vaginal ascendente e descrevemos como analisar a morbidade e mortalidade neonatal resultante.

Modelagem de infecção vaginal ascendente, parto prematuro e morbidade neonatal em camundongos

O artigo fornece um protocolo abrangente para gerar um modelo de camundongos de ativação imunológica materna (MIA) para estudar os efeitos da inflamação gestacional precoce no neurodesenvolvimento, incluindo métricas-chave para garantir confiabilidade e reprodutibilidade.

Geração do modelo de camundongo de ativação imunológica materna gestacional precoce para avaliar a inflamação pré-natal no neurodesenvolvimento

Este vídeo mostra como induzir hipofisite auto-imunes em camundongos SJL e como avaliar sua gravidade pela histopatologia.

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Listeria monocytogenes é um organismo modelo para estudar as respostas imunológicas e suscetibilidade genética para as bactérias intracelulares em camundongos. Este método permite que sejam medidos carga bacteriana e gerar uma única célula suspensões de fígado e do baço de ratos para análise FACS para determinar mudanças em células do sistema imunológico devido à infecção por Listeria.

Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

Um protocolo específico e rápido para pesquisar, simultaneamente, a função cardíaca direita, inflamação pulmonar, e da resposta imunológica é descrito como uma ferramenta de aprendizagem. Vídeo e figuras descrevem fisiologia e técnicas de microdissecção em um grupo organizado abordagem, que é adaptável a ser utilizado para as pequenas e grandes estudos porte.

Sistólica do ventrículo direito Medição de Pressão em combinação com colheita de amostras de tecido pulmonar e imunológica em ratos

Aprenda a induzir ativação imune materna em camundongos gestantes usando injeção intraperitoneal de poli(I:C) no estágio médio da gestação. Este método padronizado auxilia pesquisadores a estudar disfunções imunes no desenvolvimento cerebral e comportamento.

Indução de Maternal Immune Activation em Ratos na Fase Mid-gestação com Viral Mimic poli (I: C)

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