Name: Monitoramento em Tempo Real de intracelular Bile Ácido Dynamics usando um sensor Ácido Bile baseado em FRET codificados geneticamente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-04T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a monitorar dinâmicas de ácidos biliares intracelulares em tempo real usando um sensor FRET codificado geneticamente. Esta técnica permite visualizar transporte e ativação de FXR em células vivas sem necessidade de marcação.

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Este trabalho foi apoiado por bolsas iniciais do ERC (ERC-2011-StG 280255 e ERC-2013-StG 337479) e pela Organização Holandesa para Pesquisa e Desenvolvimento em Saúde (Vidi 91713319).

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui é apresentado um protocolo detalhado para a utilização de um sensor de ácido biliar romance geneticamente codificado capaz de controlar a dinâmica espaço-temporais de transporte de ácido biliar em células vivas. Este biossensor consiste em proteínas fluorescentes cerúleas e citrino que são fundidos para FXR-LBD, formando deste modo um sensor de ácido biliar à base de FRET (BAS). O Sensor Ácido Bile é relativamente simples e conveniente em uso quando se tem experiência básica com cultura...

Förster Ressonância Energia Transferência (FRET) é amplamente utilizado para obter uma melhor compreensão das funções celulares em células vivas com alta resolução temporal e espacial 1. Na FRET, a energia a partir de um fluoróforo dador animado é transferido para um fluoróforo aceitador. Eficiência de TERF é fortemente dependente da distância entre o fluoróforo dador e o aceitador e a sua orientação e é, por conseguinte, um visor sensível de mudanças conformacionais que afectam os dois fluoróforos. Este fenômeno é explorada para gerar biosensores baseados em FRET para a imagem de pequenas moléculas. Alterações na sua concentração pode ser monitorado à medida que aumenta / diminui na proporção de intensidade de emissão do aceitador em relação ao fluoróforo dador 2. Por exemplo, os biossensores de cálcio baseados em FRET permite a detecção rápida e estável de concentrações de cálcio livres nas células 3 viva. Outras vantagens de biosensores baseados em FRET são imagem latente em células vivas individuais, therdeiro não-invasivo, sua capacidade de ser direcionados para diferentes tipos de células e compartimentos celulares 4. Muitos aspectos da dinâmica de ácidos biliares intracelular ainda são pouco conhecidos. Por exemplo, pouco se sabe sobre o mecanismo de regulação subjacente de transporte de ácido biliar conjugado e não conjugado. Técnicas existentes para monitorar este transporte fazer uso principalmente de repórteres à base de luciferase, ácidos biliares radiomarcados, ou fluorescentes análogos de ácidos biliares. O último requer a modificação de ácidos biliares, possivelmente afetando suas propriedades. Repórteres à base de luciferase tem resolução de tempo pobre. Além disso, estas técnicas de resultar em perda da amostra e não são aplicáveis ​​para a imagem latente em células individuais. Por isso, seria benéfico utilizar métodos que permitem a imagiologia de célula única ao vivo da actividade de transporte de FRET utilizando biossensores, especialmente uma vez que inclui a vantagem de a detecção raciométrica 5, 6. Embora variantes de CFP / YFP forma mais frequentemente utilizada pares FRET, novas estratégias usando Morange e mCherry transportando mutações auto-associação indutores levaram a uma expansão da caixa de ferramentas FRET com novos sensores, incluindo um sensor de ácido biliar vermelho-deslocada 7. Nós previamente criado um FRET do sensor geneticamente codificado ácido biliar (BAS), que consiste de um fluoróforo dador (azul celeste) e um fluoróforo aceitador (citrino) que estão fundidos com o receptor X farnesoid (FXR) ligando de domínio de ligação (FXR-LBD) e um péptido que contém um motivo LXXLL 8. Este péptido associados com o FXR-LBD de um modo dependente-ácidos biliares. Após a activação FXR, a distância entre o citrino e azul celeste irá alterar devido a uma alteração conformacional. Em linhas celulares de mamíferos, FXR resultados da activação de um aumento claramente detectável na relação de citrino / azul celeste, enquanto o sensor purificada funciona no sentido oposto e leva a uma diminuição do rácio de FRET após activação FXR. Este sensor (CytoBAS)permite o monitoramento da dinâmica dos ácidos biliares citosólicas. Através da adição do terminal carboxilo de motivos alvo subcelulares, a construção pode ser BAS encaminhada para o núcleo (NucleoBAS) e peroxissomas (PeroxiBAS), permitindo medições de concentrações de ácidos biliares em diferentes compartimentos celulares. Embora a adição do motivo de direccionamento peroxissomal não prejudicar a sua capacidade de resposta aos ácidos biliares, células permeáveis ​​FXR-ligandos não induziu qualquer alteração de FRET PeroxiBAS dentro peroxissomas 8. Como a natureza dessa discrepância é desconhecida, o protocolo abaixo está focada em CytoBAS e NucleoBAS. A utilização deste sensor de FRET geneticamente codificado foi recentemente demonstrada em células contendo os transportadores de ácido biliar hepáticas Na + / taurocolato de co-transporte polipéptido (NTCP) e soluto orgânico alfa / beta transportador (8) OSTαβ. PNCT é o principal importador de ácido biliar hepática e OSTαβ é um bile intestinal basolateraltransportador de ácido que pode funcionar tanto como um importador e exportador dependente do gradiente de concentração de ácido biliar eletroquímica 9, 10. Dados recentes mostraram que mediante transporte de ácido biliar por NTCP e / ou OSTαβ, respostas rápidas e robustas em relação FRET como um resultado da interacção ligando-FXR-LBD pode ser observada. Aqui, descrevemos protocolos detalhados para métodos para medir FRET como a análise microscópica confocal e de células activada por fluorescência (FACS), realce passos críticos, face a eventuais problemas e discutir métodos alternativos. Usando este sensor de FRET geneticamente codificado, interacção de ácidos biliares com FXR-LBD pode ser quantificado e monitorada directamente em células vivas e proporciona um método rápido e simples de visualizar transporte de ácido biliar e dinâmica em tempo real. Plasmídeos de expressão de mamífero que codifica CytoBAS NucleoBAS e estão comercialmente disponíveis. Portanto, esse biosensor pode contribuir ainda mais para ocompreensão dos transportadores de ácidos biliares ou compostos que ativam FXR e fornecem uma visão mais profunda da biologia ácido biliar e sinalização.

<table><tbody><tr><td>CytoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62860</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62861</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Eagles modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>Glicose alta sem L-glutamina</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (caneta/estreptococo)</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200mM)</td><td>Soro Fetal Bovino Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>(FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>102-70</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (10x)</td><td>Balão</td> de cultura de células Lonza <td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>T-25</td><td>VWR international</td><td>392-0253</td><td></td></tr><tr><td>Balão de cultura de células T-175</td> revestido com laminina <td>VWR international</td><td>392-0238</td> Placa de 6 poços <td>revestida com laminina</td></tr><tr><td></td><td>VWR international</td><td>734-0229</td><td>Placa de 10 cm revestida com poli-L-lisina e laminina</td></tr><tr><td></td><td>VWR international</td><td>392-0243</td><td>Revestida com laminina</td></tr><tr><td>Dietilaminoetil (DEAE) - Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>G418 (geneticina) 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina B, 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de clonagem (6 x 8 mm)</td><td>Bellco</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Leibovitz meio de cultura</td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>Sem vermelho de</td></tr><tr><td>fenol Tubo de fundo redondo de poliestireno (5 ml) Tubo Facs</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>Sem tampa, não estéril</td></tr><tr><td>Falcon 2.063 tubos (5 ml)</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td>Tampa de pressão, estéril</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 8 poços de vidro</td><td>Thermo scientific</td><td>155409</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Filtrado por carvão FBS</td><td>Life technologies</td><td>12676011</td><td></td></tr><tr><td>GW4064</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5172</td><td></td></tr><tr><td>TCDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6260</td><td></td></tr><tr><td>CDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9377</td><td></td></tr><tr><td>Outros produtos químicos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento em tempo real de intracelular bile Ácido dynamics usando um sensor Ácido bile baseado em fret codificados geneticamente

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tornou-se uma ferramenta poderosa para monitorar o dobramento, interação e localização de proteínas em células individuais. Os biossensores baseados no princípio do FRET permitiram a visualização em tempo real de eventos de sinalização subcelular em células vivas com alta resolução temporal e espacial. Aqui, descrevemos a aplicação de um sensor de ácido biliar (BAS) geneticamente codificado que consiste em dois fluoróforos fundidos ao domínio de ligação ao ligante do receptor X (FVR-LBD), formando assim um sensor de ácido biliar que pode ser ativado por um grande número de espécies de ácidos biliares e outros ligantes FXR (sintéticos). Este sensor pode ser direcionado a diferentes compartimentos celulares, incluindo o núcleo (NucleoBAS) e o citosol (CytoBAS) para medir as concentrações de ácidos biliares localmente. Permite a quantificação rápida e simples do influxo de ácidos biliares celulares, efluxo e distribuição subcelular de ácidos biliares endógenos sem a necessidade de marcação com etiquetas fluorescentes ou radionúcleos. Além disso, os sensores BAS FRET podem ser úteis para monitorar a ligação do ligante FXR. Finalmente, mostramos que este biossensor FRET pode ser combinado com imagens de outros fluoróforos espectralmente distintos. Isso permite a análise combinada da dinâmica dos ácidos biliares intracelulares e i) localização e/ou abundância de proteínas de interesse, ou ii) sinalização intracelular em uma única célula.

O sensor de FRET-BAS apresentada baseia-se no domínio de FXR (LBD-FXR) de ligação ao ligando ligado a dois fluoróforos de citrino e cerúleas) e um motivo LXXLL. Este sensor permite investigações de transporte de ácido biliar em células com elevada resolução espacial e temporal (Figura 1 A) vivas. Mutações em celeste e citrino foram aplicados para promover a formação do complexo intramolecular (Figura 1 <...

Fornecemos um protocolo detalhado para estudar a dinâmica dos ácidos biliares em células vivas usando um sensor BAS FRET geneticamente codificado. Este sensor de ácido biliar representa uma ferramenta única para estudar (regulação do) transporte de ácido biliar e ativação de FXR em uma ampla gama de tipos de células.

Monitoramento em Tempo Real de intracelular Bile Ácido Dynamics usando um sensor Ácido Bile baseado em FRET codificados geneticamente

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

O objetivo geral deste procedimento é usar um sensor de ácido biliar FRET geneticamente codificado para visualizar facilmente o transporte e a dinâmica do ácido biliar com alta resolução espacial e temporal. Este sensor pode responder a questões metabólicas importantes, como a relação da biles e dinâmica com glicose, lipídios e metabolismo energético. A principal vantagem dessa técnica é que o transporte de ácidos biliares agora pode ser monitorado diretamente para células vivas individuais sem a necessidade de marcar ácidos biliares.Este método pode fornecer informações sobre o transporte e a dinâmica das células e dos ácidos biliares. Também pode ser usado para visuializar efeitos ou ativação e células vivas únicas, ou para combinar imagens de localização de proteínas e transporte de ácidos biliares. O sensor de ácido biliar geneticamente codificado, doravante, o sensor, consiste em um fluoróforo cerúleo doador e um fluoróforo citrino excetor.Os dois fluoróforos estão ligados pelo domínio de ligação ao ligante do receptor de ácido biliar nuclear FXR, fundido a um cofator FXR, peptídeo. Duas mudanças de aminoácidos projetadas nos dois fluoróforos promovem interações intermoleculares entre o cerúleo e o citrino. Duas construções diferentes que transportam o sensor são utilizadas.Em uma construção, o sensor contém o sinal de localização nuclear c-terminal e, portanto, se acumula no núcleo. Na outra construção, o sensor não possui nenhuma sequência de direcionamento e, portanto, localiza-se no citoplasma. O protocolo de vídeo a seguir se concentra em como obter imagens do sensor em células vivas.O protocolo de texto aborda como projetar células que expressam o sensor e como analisá-las por fatos. Em preparação para a imagem das células, coloque as células que expressam o sensor na densidade desejada em uma lâmina de câmara inferior estéril de oito poços em meio de cultura completo. Quando as células crescerem para 60 t0 70 por cento de confluência, prossiga com o experimento.Lave as células que estão aderidas à lâmina da câmara uma vez com 200 microlitros de 1x PBS ou Leibovitz L-15 Meio de Cultura. Em seguida, aspire a solução e substitua-a por 300 microlitros de meio de cultura Leibovitz L-15 para que não seja necessário controle de CO2. Se o DMEM com Vermelho de Fenol for usado, em vez de Leibovitz L-15, planeje acompanhar o PH durante a coleta de dados, porque o sensor é sensível ao PH. Em seguida, prepare diluições dos compostos a serem usados no experimento em concentrados de 3x a 5x, incluindo GW4064 e TCDCA.Prepare-se para adicionar alíquotas de 50 a 100 microlitros durante a imagem, para que as soluções sejam rapidamente misturadas na câmara de lâminas. Agora, inicie o software de imagem de um microscópio confocal e ligue o laser. O microscópio deve ser equipado com uma objetiva de óleo 63x, uma câmara de incubação de 37 graus Celsius e um laser violeta de 405 nanômetros.Em seguida, ajuste as configurações do microscópio. Defina o modo de aquisição como XYT para imagens de lapso de tempo de um único plano focal. Defina a taxa de aquisição de imagem para intervalos de 20 segundos, para que os compostos possam ser adicionados durante os intervalos.Além disso, certifique-se de definir a faixa espectral para uma detecção de missão. Concentre-se nas células usando transiluminação. Em seguida, no controle do software, desenhe círculos para definir as regiões de interesse.Selecione células com intensidades de florescência semelhantes e tamanho e forma normais. Não desenhe muito perto dos perímetros da célula. Em seguida, comece a fazer medições.Anote seu valor e continue fazendo medições até que a florescência cerúlea e citrina se estabilize. Uma vez alcançada a estabilidade da florescência, adicione 50 a 100 microlitros de ácidos biliares ou outros compostos em pontos de tempo escolhidos durante a medição. Evite a borda da câmara ao pipetar e adicione o líquido lentamente.A execução correta desta etapa é fundamental para o experimento. Novamente, deixe a florescência se estabilizar antes de prosseguir. Termine o experimento adicionando cuidadosamente 100 microlitros de GW4064 para uma concentração de cinco a 10 micromolares.Continue gravando até que a florescência se estabilize novamente. Em seguida, salve o experimento e exporte os dados como um arquivo avi. Abra os arquivos avi salvos na imagem J selecionando plugins, stacks, stack interleaver.Em seguida, clique em editar, selecionar e adicionar ao gerenciador para abrir a janela do gerenciador RLI. Em seguida, alterne a opção mostrar tudo. Com a ferramenta de seleção oval, desenhe alguns ROIs que cobrem células específicas.Não se aproxime dos perímetros das células porque as células provavelmente sofrerão algum desvio ou migração focal. Além disso, desenhe um círculo em uma área fora das células para determinar o sinal de fundo. Uma área dentro de uma célula que não expressa o sensor também pode ser usada.Agora, selecione um ROI e clique em plug-ins e, em seguida, no criador de perfil de proporção. Três telas aparecerão. RAW, Ratio e Perfil de Ratio.A janela RAW mostra o aumento na intensidade do citrino como uma linha azul e uma diminuição no cerúleo como uma linha vermelha, se houver FRET. A janela de proporção mostra informações sobre a proporção de citrino para cerúleo, que aumentará com o aumento do FRET. A janela do perfil de proporção mostra os valores para as medições da intensidade da florescência em ambos os canais.Se forem usados arquivos de configuração específicos do microscópio, a ordem dos canais pode aparecer invertida. Agora, copie os dados da janela de perfil de proporção para uma planilha para análise estatística. Em seguida, faça o mesmo para todos os outros ROIs selecionados, bem como para o ROI em segundo plano.Um experimento FRET baseado em intensidade quantitativa de células vivas foi realizado em células U2OS que expressam o sensor e não possuem transportadores endógenos de ácidos biliares. As células foram tratadas com TCDCA. Isso não resultou em nenhuma alteração no FRET.Quando as células foram tratadas com GW4064, a proporção média de citrino para cerúleo aumentou notavelmente. Para demonstrar que o sensor pode ser combinado com outras proteínas, células U2OS co-expressando o sensor com NTCP e OST alfa-beta foram projetadas. Eles mostraram um claro aumento na relação citrino/cerúleo após a adição de TCDCA e GW4064.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar a dinâmica dos ácidos biliares usando o sensor de ácidos biliares. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora. Este procedimento pode ser facilmente estendido para incluir mais informações de imagem, como a localização subcelular de sua proteína de interesse.Desde que o comprimento de onda dessa proteína seja diferente do sensor. Para evitar o fotobranqueamento, é importante manter o sensor que expressa as células no escuro o máximo possível.

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Monitoramento em Tempo Real de intracelular Bile Ácido Dynamics usando um sensor Ácido Bile baseado em FRET codificados geneticamente (Vídeo) | JoVE Journal

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