Name: Cultura pluripotentes humanas e células-tronco neurais em um sistema de cultura celular fechado de Pesquisa Básica e pré-clínica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprenda a cultivar células-tronco pluripotentes e neurais humanas em sistema fechado com controle de gases e temperatura. Este método garante esterilidade máxima e conformidade com cGMP para pesquisa básica e pré-clínica.

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Os autores gostariam de agradecer a equipe Biospherix por sua ajuda em aprender a usar o sistema de cultura celular Xvivo fechado, especialmente Matt Freeman; o pessoal do Miles &amp; Kelley Construction Company, Inc. para o seu trabalho na criação da infra-estrutura laboratorial, especialmente Russ Hughes; o pessoal do Hospital Infantil de departamento de Orange County de Instalações e Serviços de Suporte para o seu trabalho na coordenação da remodelação de laboratório, especialmente Adam Lukhard e Devin Hugie; o pessoal do Hospital Infantil de departamento de Orange County de Sistemas de Informação pela sua ajuda na criação da infra-estrutura de gerenciamento de dados e acesso remoto, especialmente Viet Tran; Hospital Infantil de Orange County Equipe de Gestão Executiva por seu apoio de longa data do projeto, especialmente Dr. Maria Minon e Brent Dethlefs. Este trabalho foi financiado pelo Hospital Infantil de Orange County e do California Institute for Regenerative Medicine através TR3-05476 subvenção para PHS. Todos os autores contribuíram igualmente para este trabalho.

<ol><li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children%27s+Hospital+of+Orange+County%3A+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.Med%22%5BJournal%5D)">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li>
<li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li>
<li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li>
<li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li>
<li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li>
<li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Rev.Neurother%22%5BJournal%5D)">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Stem+Cell+Res.Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li>
<li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.Res%22%5BJournal%5D)">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As células cultivadas dentro das CPF não vejo mudanças nas concentrações de oxigênio ou dióxido de carbono que se deslocam de incubadora para o processamento de câmara para microscópio de câmara e volta. É crítico que as condições em cada uma das câmaras são combinadas para a incubadora particular em que as células são mantidas antes que as células são removidas da incubadora. A atmosfera dentro do aparelho é continuamente HEPA-filtrado e é personalizável no que diz respeito às concentrações de oxigênio e dióxido de carbono. As células podem ser cultivadas em concentrações normais para unidades ou NSC, 5% e 9%, respectivamente; ou concentrações alternativos podem ser escolhidos para diferentes tipos de células ou para experiências específicas. Assim, o aparelho é fornecido com fontes de oxigénio constante de grau médico, dióxido de carbono e azoto (Figura 4). Todos os três destes gases são fornecidos por sistemas de colector de gás específico do que assegurar o abastecimento constante. O aparelho é também fornecido com uma mistura de gás de calibração consiste em10% (± 0,01%) de dióxido de carbono em oxigénio. Os sistemas de manifold estão alojados fora da unidade de produção de células e os gases são canalizados para a instalação através do teto. O gás de calibração está alojado no interior da instalação. O aparelho é fornecido adicionalmente com aspirador de casa, também através do teto. Usando um sistema de monitoramento eletrônico e sem fio unidades envio, as pressões de todos os colectores de saída são constantemente monitorados. No caso em que qualquer pressão cai fora do intervalo, os operadores das instalações de produção de células são automaticamente telefonou e notificada de tal forma que medidas apropriadas possam ser tomadas. Os requisitos de energia do aparelho são atendidas por seis dedicados 120 V circuitos que descem do teto e ligados a geradores de back-up do hospital para garantir um fornecimento constante. O funcionamento do aparelho é controlado via software em um computador baseado em PC alimentado através de uma fonte de alimentação ininterrupta. Estes arranjos de poder e de computadorassegurar que o sistema funciona continuamente, mesmo em caso de falha do sistema do poder público. O software que controla o aparelho tem uma interface gráfica amigável (Figura 1) que permite o controlo das concentrações de oxigênio e dióxido de carbono, bem como pressões de temperatura, umidade, e de câmara. Os valores de todos estes parâmetros são registadas continuamente para fornecer um registro de execução de todos os parâmetros do aparelho. Este dados são copiados para um servidor remoto a cada noite para proteger a sua integridade. O computador eo software pode ser acessado remotamente por usuários administrativos para avaliar e / ou alterar qualquer parâmetro. Além disso, o computador eo software pode ser acessado remotamente, permitindo avaliação interativa de parâmetros de aparelhos e solução de problemas com os usuários locais. Uma unidade de envio de alarme adicional é ligado ao aparelho de tal modo que os operadores das instalações de produção de células são notificados de qualquer condição fora-de-gama do aparelho. O acesso remoto capabilities permitir o login e avaliação das especificidades da condição fora-de-gama. O aparelho é concebido como um sistema modular tanto em uma macro e micro um sentido. módulos de cultura de células individuais, tais como incubadoras e câmaras de processamento, podem ser personalizadas no que diz respeito às suas dimensões e os requisitos, bem como na sua disposição com respeito um ao outro. Além disso, a maior parte das funções de controlo dos módulos individuais são eles próprios modular de tal modo que os controladores de gás atmosféricos, por exemplo, pode ser facilmente substituído sem perturbação significativa para o sistema. câmaras de processamento especializado, tal como um para visualização microscópica e manipulação de culturas de células, podem ser facilmente adaptado ao sistema. Ambos de contraste de fase e microscópio de fluorescência estão dentro do sistema (Figura 6), de modo que as células podem ser coradas vivo, e as colónias podem ser dissecados nas mesmas condições atmosféricas dentro como tele incubadoras. Encaminhamento de cabos por meio de ilhós seladas nas paredes laterais da câmara de processamento permite que o equipamento, tal como fontes de alimentação e computadores para ser mantido no exterior do aparelho, geralmente sobre um carrinho (Figura 6). As câmaras de processamento na unidade de produção de células têm um padrão de fluxo de ar diferente do BSC convencionais. Em BSCs convencionais, o fluxo de ar flui para baixo a partir de um orifício de evacuação central e se divide em duas correntes separadas, que são então levados até por duas aberturas de entrada diferentes na parte da frente e para trás do piso do armário. Em contraste, a PCF tem uma única abertura na parte da frente do tecto. O ar flui para baixo e em direcção à parte de trás da câmara, onde é, em seguida, conduzido para cima, para uma entrada de ventilação. Embora o CPF é inerentemente muito limpos, este padrão de fluxo de ar única significa que os técnicos têm de ajustar ligeiramente a sua técnica para reduzir o risco de contaminação. Tal como acontece com um BSC convencional, um trabalhador s laboratórioevitar hould colocando suas mãos a montante de placas de cultura de células abertas e garrafas de mídia. No entanto, o sentido a montante é que tenha sido modificado no CPF O laboratório instalação de produção de células em si é bastante padrão e vem equipado com um C congelador -20 °, a -80 ° C freezer, a 4 ° C geladeira, uma centrífuga, e um banho de água. O laboratório também tem uma pia com pedais para operação conveniente mãos livres. Para que este laboratório para se tornar uma unidade de produção de células clínica funcional, no entanto, devem ainda ser feitas várias modificações adicionais. Em primeiro lugar, o aparelho em si tem de ser actualizado para ter a capacidade de monitorar compostos voláteis orgânicos, partículas, e das concentrações de dióxido de cloro que é utilizado para descontaminação. Em segundo lugar, uma câmara de processamento que contém uma máquina de FACS podem ser alojados e ligado ao resto do aparelho através de um módulo de memória intermédia. Isto irá permitir a separação de células e purificação de trpopulações de células ansplantable nas condições ambientais adequadas. Por fim, todo o aparelho deve ser instalado dentro de uma parede macia sala limpa. Isso fornece uma International Organization for Standardization (ISO) Classe 8 ambiente para o aparelho 5. A alta esterilidade e natureza controlado por computador do CPF faz com que seja um sistema ideal para aplicações futuras com a terapia à base de células e os processos de fabrico boas. O risco de contaminação é bastante atenuados, mas o mais importante, as condições de expansão celular são registados automaticamente e arquivados pelo sistema de computador. Desvios em concentrações de gases, temperatura, umidade e todos os eventos de acesso ao sistema são rigorosamente documentadas. Isso pode ajudar muito na investigação de problemas de qualidade do produto. No entanto, ainda há limitações. O uso de qualquer e todos os reagentes e materiais (por exemplo, componentes de mídia, pipetas, placas) deve ser documentada separadamente. Adicionaritionally, há uma infinidade de problemas potenciais (incluindo muitas formas de erro humano) que podem surgir que são completamente alheios às variáveis ​​documentados pelo sistema de monitoramento do CPF. Assim, a necessidade de pessoal altamente treinado e documentação manual detalhado de tarefas permanece no lugar.

As técnicas padrão de cultura de células-tronco sofrem de várias restrições ambientais que colocam tensões indevidas nas células e expõem as células a riscos inaceitáveis de contaminação. Entre os estresses que as células podem suportar sob condições padrão de cultura de células estão mudanças precipitadas nos níveis de dióxido de carbono e concentrações de oxigênio3,4. Isso ocorre quando as células são movidas da incubadora para o gabinete de biossegurança e/ou microscópio, o que pode não ser ideal para as células. Estudos anteriores confirmaram as vantagens da cultura de células-tronco pluripotentes e neurais em condições hipóxicas4,11 e, para obter melhores resultados, essas condições precisam ser contínuas. Além disso, os riscos de contaminação celular são maiores, pois o ambiente de laboratório e o pessoal colidem com as células em quase todas as etapas de sua cultura e manipulação. As salas limpas tradicionais compreendem um método eficaz para diminuir muito os riscos de contaminação, mas são caras, ocupam muito espaço e não abordam os estressores relacionados às concentrações de dióxido de carbono e oxigênio. 
Uma instalação de produção de células que pode lidar com riscos de contaminação e concentrações de gases e que pode ser qualificada para atender aos critérios cGMP9 fornece células de alta qualidade para pesquisa científica básica, bem como aplicações clínicas1,6,7. Essa instalação de produção de células consiste, no mínimo, nos seguintes componentes: uma câmara de processo, que atua como um espaço de trabalho aquecido para a alimentação e manipulação de culturas de células; uma capela de fluxo laminar, para a esterilização inicial de reagentes, tubos e ferramentas; duas câmaras de câmara de ar de amortecimento entre o exaustor e a câmara de processo; duas incubadoras de cultura de células acessíveis a partir da câmara de processo; uma câmara de microscópio adjacente à câmara de processo; e, finalmente, software de computador para definir e monitorar as condições dentro desses módulos. Usando essa infraestrutura básica, uma ampla variedade de tarefas pode ser executada, como alimentação padrão e passagem de células-tronco pluripotentes e células-tronco neurais multipotentes, bem como métodos mais especializados, como reprogramação baseada em vírus Sendai, estudos de migração in vitro e diferenciação de células-tronco neurais para caracterização eletrofisiológica.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvivo System</td><td>Biospherix</td><td>feito sob medida</td><td></td></tr><tr><td>Xvivo Software</td><td>Biospherix</td><td>versão i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O2 Manifold</td><td></td><td>Amico P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Manifold Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N2 Western</td><td>Innovator</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio com câmera DP21 e fluorescência</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número do Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Suplemento</td> StemPro hESC <td>da Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento de Fibroblastos Hyclone 9236</td><td></td><td></td><td></td>Fosfato Tampolado com Fosfato</tr><tr><td></td><td>R& D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Protide</td><td>de dimetilsulfóxido</td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>Hank's baseado em dissociação celular Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico</td><td>R & D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 Suplemento de soro</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa </td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Consumable Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Pipeta serológica</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipeta serológica</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta serológica</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 25 ml</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 50 ml</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>T25 frasco</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T-75 TPP</td><td></td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; l pontas de pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l ponteiras de pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1.000 ponteiras de pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura pluripotentes humanas e células-tronco neurais em um sistema de cultura celular fechado de pesquisa básica e pré-clínica

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Este artigo descreve como usar um sistema de cultura de células fechadas fabricado sob medida e comercialmente disponível para pesquisa básica e pré-clínica. Gabinetes de biossegurança (BSCs) e incubadoras têm sido o padrão para cultura e expansão de linhagens celulares para pesquisa básica e pré-clínica. No entanto, como o foco de muitos laboratórios de células-tronco muda da pesquisa básica para a tradução clínica, são necessários requisitos adicionais do sistema de cultura celular. Todos os processos devem ser bem documentados e ter requisitos excepcionais de esterilidade e reprodutibilidade. Nas incubadoras tradicionais, as concentrações de gás e as temperaturas flutuam amplamente sempre que as células são removidas para alimentação, passagem ou outras manipulações. Tais interrupções contribuem para um ambiente que não é o padrão para as diretrizes cGMP e GLP. Essas interrupções devem ser minimizadas, especialmente quando as células são utilizadas para fins terapêuticos. A motivação para passar do BSC padrão e do sistema de incubadora para um sistema fechado é que essas interrupções podem ser insignificantes. Os sistemas fechados fornecem um espaço de trabalho para alimentar e manipular culturas de células e mantê-las em um ambiente controlado, onde a temperatura e as concentrações de gases são consistentes. Dessa forma, as células-tronco pluripotentes e multipotentes podem ser mantidas em ótima saúde desde o momento de sua derivação até seu eventual uso na terapia.

Este manuscrito descreve com algum detalhe uma instalação de produção de células, e os aspectos únicos da cultura de células dentro de um sistema fechado. A maior parte das instalações de produção de células compreende um aparelho de cultura celular feito por encomenda, fechado, que tem uma pegada pequena e pode ser facilmente instalado dentro de um 6 x 7,5 m 2 quarto (Figura 2). Em nenhum momento são as células dentro do aparelho exposto ao pessoal de laboratório ou ambiente. O aparelho é constituído por vários módulos: uma câmara de processo, uma câmara de fluxo laminar, 2 câmaras de tamponamento Airlock entre o capuz e a câmara de processo, duas incubadoras de cultura de células, e um microscópio de câmara adjacente à câmara de processo (Figura 3). O sistema é controlado por software que permite variáveis ​​ambientais a serem controladas e monitoradas (Figura 1). O computador que executa o software está em uma fonte de alimentação ininterrupta. Os gases são alimentados em the sistema por um conjunto de colectores de oxigénio, azoto e dióxido de carbono (Figura 4). Gases para o dispositivo são fornecidos por sistemas múltiplos que têm dois conjuntos de tanques cada - um conjunto ativo e um conjunto de reserva. Quando o conjunto ativo é desenhada para baixo, o colector muda automaticamente para os tanques de substituição ordem reserva constituídos e de pessoal. O poder está em um sistema gerador de backup. Pluripotentes e células estaminais neurais podem ser cultivadas em condições de hipóxia nesta instalação utilizando protocolos previamente desenvolvidos 9, com as complicações adicionais inerentes ao equipamento novo. As células estaminais pluripotentes podem ser derivados utilizando vírus Sendai, utilizando anticorpos específicos de pluripotência para identificar colónias totalmente transfectadas, as quais são então isoladas e expandidas. (Figura 5A e B), A partir destes iPSCs, células estaminais neuronais e neurónios podem ser derivados usando SMAD inibição dupla, e o seu fenótipo verificado USI<html> Os anticorpos específicos para NSC ng (Figura 5C e D). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Figura 1. Interface Gráfica para o Mecanismo de célula de produção. (A) A representação gráfica do CPF é a tela padrão e combina o desenho CAD mostrado na Figura 3. Um clique do mouse sobre o buffer Módulo 1 (2F na Figura 1) abre seu ecrã de controlo (B), onde os valores de o 2 são definidas para coincidir com a câmara de processamento (3 na Figura 3). Da mesma forma, clicando sobre o Processo da Câmara ou Incubadora 1 traz suas respectivas telas de controle (C e D, respectivamente), onde os valores podem ser alterados ou monitorados, conforme apropriado.<html> rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Figura 2. O dispositivo de célula de produção. (A) O sistema como visto de uma vista frontal direita. Observe as conexões de alimentação e de gás no tecto e o carro com os acessórios de microscópio e computador para a direita. (B) A câmara de fluxo laminar com as portas de acesso aos módulos de tampão visto no lado direito. (C) A câmara de processo com as incubadoras duas portas (preto) visto na parte traseira. (D) Uma vista através do lado direito do sistema que mostra o microscópio e monitor com as portas para as câmaras de amortecimento visto à distância. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> t &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Figura 3. Um desenho de CAD do mecanismo de célula de produção. Todos os artigos que entram no dispositivo são primeiramente limpo com álcool e seco ao ar na câmara de fluxo laminar (1). Os artigos são, em seguida, transferida para o ambiente apropriado no módulo de tampão dianteira (2F) antes de serem passados ​​para o módulo de UCPC, ou processo de câmara (3). As células são cultivadas nas duas incubadoras (4, 5). Coloração de células vivas, colônia colheita, a avaliação da morfologia celular geral e análise de migração ocorre no módulo UPC, ou Microscópio Câmara (6). Finalmente, resíduos sai do sistema através do módulo tampão traseiro (2R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Figura 4. Fontes de Gases e poder. (A) O colector de CO 2 é uma configuração de 4 x 4, uma vez que fornece todos os incubadoras de laboratório. (B) O colector de O 2 é uma configuração única e suprimentos a instalação de produção de células de 2 x 2. Azoto para o sistema é gerado num vaporizador (C, apenas o sinal de saída abaixo) ligado a um colector de azoto líquido (à direita) que também enche automaticamente cryofreezers (inferior esquerdo). O colector é uma configuração 2 x 2 sendo fornecida por dois pares de tanques de 160 L de azoto líquido. CO 2, O 2, N 2 e são fornecidos através do teto shutoffs (D). câmara de vácuo é também fornecida neste local. Visto apenas atrás das shutoffs gás de alimentação são um par de cabos de energia que fornecem energia ao sistema.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Figura 5. As células pluripotentes estaminais derivadas em hipóxia com o vírus Sendai. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (nomenclatura encontrados em Stover et al. 9), contraste de fase 10x. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs live-coradas com Tra-1-60 AF-594-rotulados, diluição 1: 100 na mídia. Todos os iPSCs foram transduzidas na instalação de produção de células em 5% de O 2 com o vírus de Sendai. (C) O contraste de fase de NSC-SC68.1 UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC-derivados, crescido em 5% de O 2 em lâminas de câmara. As células foram então fixadas em paraformaldeído a 4% e coradas com o anticorpo primário anti-nestina humana, e o anticorpo secundário Alex-488. Todas as barras de escala são a 1001;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui está um protocolo para cultivar células-tronco pluripotentes (PSC) e células-tronco neurais (NSC) em um sistema de cultura de células fechado que permite máxima esterilidade e reprodutibilidade, substituindo o tradicional gabinete de biossegurança e incubadora. Este equipamento atende às diretrizes de boas práticas clínicas de fabricação (cGMP) e boas práticas clínicas de laboratório (cGLP).

Cultura pluripotentes humanas e células-tronco neurais em um sistema de cultura celular fechado de Pesquisa Básica e pré-clínica

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

O objetivo geral do uso deste equipamento é cultivar células-tronco em condições atmosféricas definidas com máxima esterilidade. O que vamos demonstrar hoje é o uso de uma instalação fechada para cultura celular que permite um controle excelente sobre os parâmetros de cultura celular. Em nosso laboratório, estamos utilizando esta instalação para o cultivo de células-tronco multipotentes e células-tronco pluripotentes.A principal vantagem deste método é que as células são expostas a um ambiente constante independentemente de sua localização durante o processamento. Seja durante a manipulação das células, na incubadora ou no microscópio, sua exposição ao oxigênio, CO2 e temperaturas permanece constante ao longo de todo o ciclo. O procedimento será demonstrado por Alexander Stover, cientista colaborador do meu laboratório.Para iniciar este procedimento, clique em um módulo para ajustar a concentração de gás. Na nova janela que exibe as configurações atuais, clique no valor existente de ponto de oxigênio abaixo de Setpoint e insira a concentração de oxigênio necessária para este módulo. Em seguida, clique na marca de seleção verde para confirmar o ponto de ajuste.Repita esse procedimento para o dióxido de carbono e insira um valor de referência de 5% de dióxido de carbono em todos os módulos, exceto nas câmaras de buffer, que são ajustáveis apenas para oxigênio. Em seguida, monitore as concentrações atuais de gases, identificadas como Valores de Processo, para garantir que atinjam os novos valores de referência. Depois disso, ajuste os valores de referência de gás em todos os módulos para os valores apropriados.Iguale os níveis de dióxido de carbono e oxigênio das câmaras que serão expostas uma à outra. Por exemplo, ajuste a câmara de processo para 5% de oxigênio antes de abrir uma incubadora que cultiva células em 5% de oxigênio. Ajuste também a câmara de buffer, utilizada para adicionar itens à câmara de processo, para 5% de oxigênio.Posteriormente, defina a temperatura da câmara de processo para 37 graus celsius utilizando a mesma tela para ajustes de gás. Em seguida, defina a temperatura do piso da câmara de processo para 37 graus celsius. Clique nos bancos do módulo de incubação localizados abaixo de cada incubadora e ajuste a temperatura dos bancos para 37 graus celsius.No capuz laminar, pulverize todos os materiais que entrarão no sistema com etanol 70% e deixe-os secar. Limpe suavemente frascos ou placas de células com uma gaze estéril saturada com etanol 70%. Em seguida, certifique-se de que as portas externa e interna da câmara de contenção estão firmemente fechadas, abra a porta externa, coloque os itens no interior e feche-a.Usando o software, selecione o módulo de tampão e clique na aba Fator de Diluição. Insira um na caixa Fator Logarítmico e, em seguida, clique em iniciar. Assim que a interface gráfica parar de piscar Fator de Diluição, abra a porta interna da câmara de tampão e transfira os materiais para a câmara de processo.Para remover itens da câmara de processo, primeiro certifique-se de que a câmara de buffer tenha passado por um Fator de Diluição. Em seguida, abra a porta interna, coloque os itens a serem removidos no interior e feche-a. Depois disso, abra a porta externa e remova os itens.Coloque três placas de Petri na bandeja de água na base de cada incubadora. Encha essas placas com água estéril e mantenha o nível da água nessas placas, pois elas são essenciais para manter o ponto de ajuste de umidade relativa na incubadora. Na interface gráfica, clique na incubadora.Posteriormente, clique no valor existente de umidade relativa no ponto de ajuste e insira 85%. Em seguida, clique na marca verde de confirmação para aceitar esse valor. Ajuste, então, as câmaras de buffer, a câmara de processo e um incubador aos pontos de ajuste de gás necessários para o tipo de células que serão introduzidas. Limpe a superfície da câmara de processo com gaze estéril e um desinfetante não inflamável, como um produto à base de cloreto de benzalcônio.Em seguida, limpe as luvas e as superfícies frequentemente tocadas, como maçanetas. Posteriormente, limpe a superfície da Câmara de Fluxo Laminar e da câmara de contenção com etanol a 70% e deixe secar. Depois disso, coloque o frasco ou placa de células na câmara e passe rapidamente sobre sua superfície externa uma esponja de gaze estéril saturada com etanol.Em seguida, coloque o frasco ou placa na câmara de buffer e realize um Fator de Diluição. Após a conclusão, transfira imediatamente o frasco ou placa para o incubador apropriado. Como o incubador está na parte traseira da câmara de processo, puxe uma prateleira para fora da câmara de processo para acomodar as células e evite abrir as portas do incubador desnecessariamente por períodos prolongados.Nesta etapa, prepare o meio de cultura celular. Deixe o meio equilibrar com os níveis de dióxido de carbono e oxigênio presentes no sistema, deixando o recipiente do meio levemente destampado por 20 minutos. Em seguida, remova o meio antigo das cavidades.Para células-tronco pluripotentes, remova quase todo o meio antigo, mantendo uma pequena quantidade do meio antigo para prevenir a dessecação durante o processo de alimentação. Para células-tronco neurais, remova metade do meio antigo. Em seguida, adicione meio fresco às placas de cultura celular e devolva as placas ao incubador designado.É exibida aqui uma imagem das iPSCs. Abaixo, as iPSCs estão vivas e coradas com Trial 160 marcada com AF594, com uma diluição de um para 100 no meio. Todas as iPSCs foram transduzidas na instalação de produção celular em oxigênio a 5%, utilizando vírus Sendai.E aqui está a imagem de contraste de fase de células-tronco neurais derivadas de iPSC que foram cultivadas em 5% de oxigênio em lâminas especiais. As células foram então fixadas em paraformaldeído a 4% e coradas com anticorpo primário Anti-Humano Nestina e anticorpo secundário Alexa Fluor 488. Uma vez dominado, este conjunto de técnicas pode ser realizado em duas horas, se for executado corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ajustar corretamente as concentrações de gás antes de iniciá-lo. Após o procedimento, outros métodos, como reprogramação e diferenciação, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o efeito da hipóxia sobre a pluripotência ou multipotência. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia de células-tronco explorarem a produção clínica de células para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos pediátricos.

culturing-human-pluripotent-neural-stem-cells-an-enclosed-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro permite investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos e para explorar o desenvolvimento neural humano. Este protocolo apresenta um método de cultivo e hNSPCs passaging na esperança de reprodutibilidade crescente de pesquisas sobre células estaminais humanas.

Passaging células-tronco neurais

Um método simples e confiável sobre o isolamento e cultura de células-tronco neurais de tecido fetal humano descartado cortical é descrito. Derivados de culturas humanas conhecidas doenças neurológicas podem ser usados ​​para a caracterização de processos patológicos celular e molecular, bem como fornecer uma plataforma para avaliar a eficácia farmacológica.

Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

O vídeo descreve o procedimento para manter um ambiente controlado em uma estação de trabalho de cultura de células para o crescimento e manutenção de células-tronco neuronais. Esses procedimentos envolvem o estabelecimento de condições de câmara, protocolos de limpeza e preparação de meios, mantendo assim a máxima esterilidade e reprodutibilidade e substituindo os métodos tradicionais.

Manuseio de culturas de células-tronco neuronais em uma instalação de produção de células

Aqui, apresentamos protocolos de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC), com base no crescimento de monocamada do tipo não colônia (NCM) de células individuais dissociadas. Este novo método, utilizando inibidores de quinase associados a Rho ou a isoforma de laminina 521 (LN-521), é adequado para produzir grandes quantidades de hPSCs homogêneos, manipulação genética e descoberta de medicamentos.

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente de propagar células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando apenas meios condicionados derivados da placenta humana em um prato revestido de gelatina sem suplementação exógena adicional ou substratos sintéticos específicos para hPSC.

A Cultura Modelo Novel para pluripotentes estaminais humanas Propagação celular em gelatina no Media Placenta condicionado

Neste protocolo, nosso objetivo é descrever um método reprodutível para os neurônios de células-tronco derivadas de pluripotentes humanas combinando dissociado e astrócitos juntos em 3D sphere cocultures, mantendo estas esferas em condições de flutuação livre e, posteriormente medindo a atividade sináptica circuito das esferas com immunoanalysis e gravações de matriz multielectrode.

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Mostramos a automação das culturas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) e diferenciações neuronais compatíveis com imagens e análises automatizadas.

Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas

Este artigo descreve um protocolo para a geração de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em um biorreator de suspensão 3D de bancada.

Produção de neurônios humanos induzíveis por neurogenina 2 em biorreator de suspensão tridimensional

Este protocolo apresenta uma maneira única de gerar culturas de células do sistema nervoso central a partir de cérebros embrionários de camundongos do dia 17 para pesquisa em neuro(imuno)logia. Este modelo pode ser analisado usando várias técnicas experimentais, incluindo RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria de fluxo.

Estabelecendo culturas mistas de células neuronais e gliais de cérebros embrionários de camundongos para estudar infecção e imunidade inata

Aqui, apresentamos um protocolo para um sistema automatizado de cultura de células. Este sistema de cultura automatizado reduz o trabalho e beneficia os usuários, incluindo pesquisadores não familiarizados com o manuseio de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), desde a manutenção de células iPS até a diferenciação em vários tipos de células.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Manutenção e Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Aprenda a cultivar células-tronco pluripotentes e neurais humanas em sistema fechado com controle de gases e temperatura. Este método garante esterilidade máxima e conformidade com cGMP para pesquisa básica e pré-clínica.

Cultura pluripotentes humanas e células-tronco neurais em um sistema de cultura celular fechado de Pesquisa Básica e pré-clínica (Vídeo) | JoVE Journal

Cultura pluripotentes humanas e células-tronco neurais em um sistema de cultura celular fechado de Pesquisa Básica e pré-clínica

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