Name: Sequenciamento de parede planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilação) e físico (espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear) Técnicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Aprenda a caracterizar sequências glicosídicas de heteroxilanos em paredes celulares vegetais usando marcação com 2-aminobenzamida, hidrólise enzimática com endoxilanase e análise por espectrometria de massa e ressonância magnética nuclear.

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Este projeto foi apoiado por fundos do Programa de Pesquisa Colaborativa Flagship da Organização Científica e de Pesquisa da Commonwealth, fornecido ao Cluster de Grãos de Alta Fibra por meio do Food Futures Flagship. A AB também reconhece o apoio de uma doação do Conselho de Pesquisa da Austrália (ARC) ao Centro de Excelência em Paredes Celulares Vegetais (CE110001007).

1. A rotulagem do Fim Reduzir (RE) resíduo de açúcar de AXs W-sol com 2-aminobenzamida (2AB) <ol><li> Incubar AXs W-sol com 2AB (0,2 M) na presença de 1 M de NaBH3CN (cianoboro-hidreto de sódio) (pH 5,5) durante 2 h a 65 ° C para converter as extremidades redutoras das cadeias de polissacárido espinha dorsal de seus derivados fluorescentes. CUIDADO: O passo seguinte deve ser realizada na capela como NaBH3CN libera o gás venenoso cianureto quando está em contacto com a água. <ol><li> Pesar NaBH3CN (62,8 mg) e dissolver em ua (1 mL) num tubo de microcentrifugação (1,5 ml) para preparar uma solução 1 M de NaBH3CN. Dissolve-se o reagente 2AB (27,2 mg) numa solução 1 M de NaBH3CN (1 ml) por aquecimento a 65 &#160; ° C e ajustar o pH da mistura de reacção (0,2 M 2AB, 1 M de NaBH3CN) para pH 5,5 com ácido acético a 10%. </li><li> Adicionar 200 uL de mistura de reacção (0,2 M 2AB, 1 M de NaBH3CN) para W-assiml AXs (1 mg) em um tubo de vidro com uma tampa e misture utilizando um misturador de vórtice. Incubar durante 2 horas a 65 &#160; ° C em um exaustor. Arrefece-se a suspensão até à temperatura ambiente e adicionar 4 vols. de etanol absoluto. </li><li> Colocar a suspensão num armazenamento a frio (4 ° C) O / N para precipitar polissacarídeos. </li><li> Centrífuga (1500 xg, 10 min, RT) para remover o sobrenadante. Lava-se a pelete extensivamente com etanol absoluto (4x), acetona (1x) e metanol (1x), centrifugação entre cada lavagem. Secar sob vácuo a 40 ° CO / N. Nota: Ampla de lavar também remove 2AB residual. </li></ol></li></ol> 2. Geração de xilo-oligossacarídeos de 2 AB etiquetado W-sol AXs <ol><li> Dissolver 2AB marcado W-Sol AXs (1 mg) em 500 ul de tampão de acetato de sódio (100 mM, pH 5) num tubo de microcentrifugação (1,5 ml). Adicionar 4 unidades de endoxilanase de GH (11, [M1]) e incubar a 37 &#160; ° C durante 16 horas. </li><li> Destruir a actividade da enzima por aquecimento dos MIXT reaccionaisure durante 10 min num banho de água a ferver. Arrefece-se a suspensão até à temperatura ambiente e transferir para um tubo de vidro com tampa. Adicione 4 vols. de etanol absoluto e colocar a suspensão em um armazenamento a frio (4 ° C) O / N para precipitar os polissacáridos não digeridos. </li><li> Centrífuga (1500 xg, 10 min, RT) para separar polissacáridos não digeridos (grânulo) e endoxilanase gerado xilo-oligossacáridos (sobrenadante). Decantar o sobrenadante para um tubo de vidro limpo e colocá-lo em um banho de água quente (40 ° C). </li><li> Evapora-se o etanol sob uma corrente de gás de azoto para um volume de ponto final (~ 500 mL). Congela-se o sobrenadante a -80 ° C durante 4 h e o sobrenadante seco congelada num secador por congelação para se recuperar xilo-oligossacáridos. </li></ol> 3. Geração de xilo-oligossacarídeos de KOH-sol AXs e Rotulagem 2AB <ol><li> Tratar KOH-Sol AXs com endoxilanase (GH 11, [M1]) para gerar xilo-oligossacáridos como descrito acima (secções de 2,1-2,4). </li><li> Trate endoxylanase gerado xilo-oligossacáridos a partir de KOH-Sol AXs com mistura reaccional 2AB (0,2 M 2AB, 1 M de NaBH3CN) como descrito acima (secções 1.1.1-1.1.2). </li><li> Decantar o sobrenadante para um tubo de vidro limpo e colocá-lo em um banho de água quente (40 ° C). Evapora-se o etanol sob uma corrente de gás de azoto para um volume de ponto final (~ 500 mL). Congela-se o sobrenadante a -80 ° C durante 4 h e o sobrenadante seco congelada num secador por congelação para se recuperar xilo-oligossacáridos. </li></ol> 4. MALDI-TOF-MS encontrado <ol><li> Preparação de Solução de MALDI-matriz <ol><li> Adicionar uma pequena colher de 2, 5-ácido dihydroxbenzoic (DHB) a 50% de acetonitrilo (500 ml) contendo 0,1% de ácido fórmico em um tubo (solução-matriz MALDI). Misture usando um vortex, se dissolve rapidamente, adicione outra pequena colher de DHB. Nota: concentração ideal de solução de MALDI-matriz é 10 mg / mL -1. </li></ol></li><li> Preparação da placa alvo de MALDI- <ol><li> Depositar o aqueonos oligossacárido amostras (nativas) (5-10 ug) (W-Sol e / ou KOH-Sol) numa placa de MALDI-alvo. Adicionar solução de MALDI-matriz de 0,3 mL utilizando uma ponta separada e misture pipetando cima e para baixo. Permitir que a mistura se secar à temperatura ambiente. Observação: as amostras devidamente secas deve consistir de cristais em forma de agulha comprida apontando para o centro do local. Se o depósito não é pegajoso e / ou manchada na amostra podem ser quer demasiado concentrada ou consistem em sais, estes depósitos não são susceptíveis de produzir um bom espectro e a amostra deve ser ainda purificado. </li><li> Introduzir a placa-alvo para a fonte MS e operar em modo de ião positivo (+ ive). Ajustar a voltagem do acelerador de 19,0 kV na fonte iónica 1 e 16,3 kV na fonte iónica 2. Ajustar a potência do laser para mais do que 70%. Selecione o local da amostra na placa MALDI-alvo e clique em Iniciar para começar a disparos de laser. Nota: Todas as áreas do alvo não produzirá sinais. Um ponto particular só irá dar um sinal para alguns disparos de laser devidas quer adepleção da mistura amostra / matriz ou as características do cristal. <ol><li> Mova o laser para diferentes áreas do alvo durante a aquisição e média, cerca de 200 espectros aleatória para obter o sinal-ruído satisfatório. </li></ol></li></ol></li></ol> 5. ESI-MS-QTOF <ol><li> Analise oligossacáridos gerado-endoxilanase (nativo) usando nano-HPLC acoplado com uma ionização por electrospray (ESI) tempo de quadrupolo de voo do instrumento (QTOF) MS com separação cromatográfica em linha usando um RP coluna C-18 (75 um x 150 mm; 3,5 um grânulo tamanho). <ol><li> Transferir a mistura de oligossacáridos aquosas gerado-endoxilanase para um frasco e colocá-las no amostrador automático de HPLC. Programar o gradiente de eluição de 5-80% com as fases móveis 0,1% (v / v) de ácido fórmico em água e 0,1% (v / v) de ácido fórmico em acetonitrilo, respectivamente, durante 60 min. </li><li> Ajustar a taxa de fluxo de 0,2 mL / min. Ajuste o modo de ião positivo na faixa de varredurade 300-1,600 m / z e uma taxa de varredura de 0,5 varreduras / segundo, utilizando as condições da fonte de ESI da seguinte forma: Cortina de gás 10, GS1 4, temperatura da fonte de 100 ° C, tensão de pulverização de iões de 2.300 V, e de-agrupamento potencial de 50 V. Execute o programa LC cromatográfica e oligossacarídeos eluir. O cromatograma iónico total resultante (TIC) é salvo automaticamente pelo software. </li><li> Abra o TIC salva e selecione extrato cromatograma. Tipo as massas esperadas (por exemplo, 271, 403, 535, 667, 799 e 931 m / z) na linha de comando. cromatograma digitalização clicando Enter. Processar os varrimentos de iões seleccionados dos dados do cromatograma ESI-MS QTOF utilizando software de acordo com as instruções do fabricante 14. </li></ol></li></ol> 6. ESI-MS N <ol><li> Inserção de 1 a 2 ul de per-O-metilado oligosacárido (metilado como descrito por Pettolino et ai. 1) da amostra em 50% de acetonitrilo em uma ponta de nanospray, utilizando uma seringa. aparara ponta nano-pulverização usando um cortador de vidro para se ajustar dentro do suporte de nano-pulverização a discreto ligado à MS. </li><li> Definir a massa de acordo com o intervalo esperado de massa (200-1,500 m / z) e gás de cortina para 10, a tensão ionspray a 1.900 V e polaridade para positiva. </li><li> Pressione o botão AQUISIÇÃO para abrir a janela relevante, digite o nome do arquivo de dados para obter uma varredura total de iões (ESI-MS 1). Em seguida, pressione o botão STOP. </li><li> Alterar o tipo de digitalização a partir de íons produto para fragmentar um pico de interesse. Indicar a massa de interesse (por exemplo, 885 m / z) para fragmentar e ajustar a faixa de massa (200-900 m / z). Pressione o botão de adquirir e ajustar a energia de colisão (para cima e / ou para baixo na guia composto) para atingir toda a fragmentação do ião pai (885 m / z) e adquirir uma varredura fragmento ion (ESI-MS 2). </li><li> Indicar a massa de iões de fragmento de interesse (por exemplo, 711 m / z) e ajustar a faixa de massa (200-720 m / z). Pressione o botão de adquirir umd ajustar a energia de colisão para alcançar toda a fragmentação do ião precursor (711 m / z) e adquirir um fragmento de verificação de iões (ESI-MS 3). </li></ol> 7. H 1 RMN Espectroscopia <ol><li> Dissolve-se endoxilanase gerado mistura de oligossacáridos (KOH-Sol, forma nativa) (~ 500 mg) em D 2 O (1,0 mL, 99,9%) num tubo de ensaio de plástico (15 ml). Congelar a suspensão a -80 ° C durante 4 h e seca-se a suspensão congelada num secador por congelação para se recuperar xilo-oligossacáridos. </li><li> Repita duas vezes 7.1 a fim de trocar completamente a H2O com D 2 O. </li><li> Dissolver oligossacáridos secas em D 2 O (0,6 mL, 99,9%) e adicionar 0,5 mL de acetona (5% em D 2 O) como um padrão interno. Transferir os oligossacáridos deuterados para o tubo de amostra de RMN. </li><li> Segure o tubo contendo a amostra NMR por cima e inserir o tubo de amostra em um spinner de plástico. Coloque o botão rotativo no medidor de profundidade amostra. Push ou puxar o tubo de amostra para ajustar a profundidade da amostra para assegurar que a linha de centro da parte superior da amostra e indicadores de profundidade inferior são iguais. </li><li> Remover o medidor de profundidade e inserir a amostra para o amostrador automático acoplado a um espectrómetro de RMN de 600 MHz equipado com uma crio-sonda. </li><li> Login e software de controle espectrômetro aberto. Digite o nome do arquivo de amostra. Abrir um conjunto de dados existente e, em seguida, use o comando &quot;EDC&quot; para salvá-lo com um novo nome. Digite o número da posição da amostra no amostrador automático e pressione &quot;Enter&quot;. Nota: Pressionar o botão &quot;ENTER&quot; vai cair o tubo de amostra suavemente para o magneto onde será posicionado na parte superior da sonda. </li><li> Definir a temperatura da amostra desejado, digitando &quot;edte&quot; na linha de comando. Espera para a temperatura da amostra até atingir o valor desejado antes de prosseguir para o próximo passo. Enter &quot;bloquear&quot; na linha de comando e selecione solvente apropriado (D 2 O). Espere pelo &amp;#34; bloquear mensagem acabada &quot;para aparecer na parte inferior da janela. </li><li> Digite &quot;ATMM&quot; na linha de comando e clique em &quot;otimizar&quot; no topo da barra de menu ATMM. Escolha Iniciar para o ajuste e combinação da sonda para o canal selecionado (1 H, neste caso). </li><li> Digite &quot;topshim&quot; na linha de comando para o processo de calços em que pequenos ajustes são feitos para o campo magnético até campo magnético uniforme é conseguido em torno do sample.Acquire o sinal, digitando &quot;zg&quot; na linha de comando e digite. </li><li> Analisar os espectros utilizando o software 15 de acordo com as instruções do fabricante, com um desvio químico H referenciado a um padrão interno de acetona a 2.225 ppm. </li></ol>

<ol><li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).</li>
<li>Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reducing+end+sequence+of+wheat+endosperm+cell+wall+arabinoxylans%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans.</a> Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).</li>
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<li>Pena, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+irregular+xylem8+and+irregular+xylem9%3A+Implicationsfor+the+Complexity+of+Glucuronoxylan+Biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis.</a> Plant Cell. 19, 549-563 (2007).</li>
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</ol>

Não temos nada a divulgar.

A maioria dos polissacáridos da parede celular fase de matriz têm aparentemente de forma aleatória espinhas dorsais substituído (com ambos glicosilo e resíduos de não-glicosilo) que são altamente variáveis ​​dependendo da espécie de planta, fase de desenvolvimento e tipo de tecido 3. Desde polissacarídeos são produtos de genes secundários sua sequência não é modelo de derivados e não há, portanto, nenhuma abordagem analítica única, como existe para os ácidos nucléicos e proteínas, por sua sequenciação. A disp...

Heteroxilanos são uma família de polissacarídeos que são predominantes os polissacáridos não celulósicas das paredes primárias de gramíneas e as paredes secundárias de todas as angiospérmicas 3-6. Os backbones xylan diferem em seus tipos e padrões de substituição com glicosil (ácido glucurónico (GlcA), arabinose (Araf)) e de resíduos, dependendo do tipo de tecido, estágio de desenvolvimento e de espécies não-7 glicosilo (O-acetil, ácido ferúlico). Paredes de trigo (Triticum aestivum L.) endosperma são compostos principalmente de arabinoxilanos (AXs) (70%) e (1 → 3) (1 → 4) glucanos -β-D-(20%) com quantidades menores de celulose e heteromannans (2% cada) 8. A espinha dorsal xilano pode ser variadamente não-substituído e predominantemente mono-substituído (principalmente O-2 posição e, em menor extensão O na posição 3) e (O-2 e O-3 posições) com α-L-Ara di-substituído F 9 resíduos. A extremidade redutora (RE) de heteroxilanas de dicotiledóneas (por exemplo, de Arabidopsis thaliana 10) e gimnospermas (por exemplo, abeto vermelho (Picea abies) 11) contém uma sequência de tetrassacárido glicosilo característicos; -β-D-Xil P - (1 → 3) -α-L-Rha P - (1 → 2) -α-D-Gal P A- (1 → 4) -D-Xil p. Para compreender a biossíntese e função (biológica e industrial) heteroxylan, é importante para sequenciar completamente a espinha dorsal xilano de compreender os tipos e os padrões de substituição, bem como a sequência da extremidade redutora (RE). As técnicas específicas utilizadas para a caracterização estrutural de redução final (RE) e sequência glicosil região interna (s) de heteroxilanos são descritos neste manuscrito. As técnicas dependem de fluoróforo marcação (com 2 aminobenzamida (2AB)) na extremidade redutora (RE) da cadeia heteroxylan antes enzimática (endoxilanase) hidrólise. Esta abordagem, em particular para a sequenciação RE, estavaprimeiro reportados pelo laboratório Iorque 10,12-13 mas agora é alargado para incluir a sequência e a região interna é uma combinação de técnicas estabelecidas que é igualmente adaptável a todos os heteroxilanos, independentemente da sua fonte de isolamento. Esta abordagem também pode ser aplicada a outras classes de polissacáridos usando (quando disponíveis), os endo-hidrolases adequadas. No presente estudo, as paredes celulares do endosperma do trigo engomado-de foram isolados como um resíduo de álcool insolúvel (AR) e sequencialmente extraída com água (W-Sol Pe) e KOH 1M contendo 1% de NaBH 4 (KOH-Sol Fr) como descrito em Ratnayake et al. (2014) 2. Os oligossacidos libertados de ambos W- e Pes de KOH-SOL são então metilado e a análise estrutural detalhada dos oligossacidos nativos e metilados é realizada usando uma combinação de MALDI-TOF-MS, ESI-MS-QTOF-acoplado com HPLC, com a separação cromatográfica utilizando uma linha de RP C-18 de colunae n ESI-MS. Endoxilanase digerido KOH-Sol AXs também foi caracterizado por ressonância magnética nuclear (RMN).

<table><tbody><tr><td>2 aminobenzamida (2AB)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>A89804</td><td></td></tr><tr><td>borohidreto de sódio (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>247677</td><td>Perigoso, manuseie com cuidado</td></tr><tr><td>o cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>156159</td><td>Perigoso, manuseie com cuidado</td></tr><tr><td>endo-1,4-&beta;-Xylanase M1 (de Trichoderma viride) (120101a)</td><td>Megazyme (www.megazyme.com)</td><td>E-XYTR1</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deutério (D2O)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 Zorbax eclipse plus coluna&nbsp;</td><td>A Agilent&nbsp;</td><td></td><td>(2.1&times; 100 mm; 1,8 &micro; m tamanho da conta)&nbsp;</td></tr><tr><td>MicroFlex MALDI-TOF MS&nbsp; &nbsp; (Modelo - MicroFlex LR)</td><td>(Bruker Daltonics, Alemanha)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(ESI) - (QTOF) MS &nbsp; &nbsp; (Modelo # 6520)</td><td>(Agilent, Palo Alto, CA )</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSn &nbsp;- armadilha de íons&nbsp; (Modelo # 1100 HCT)</td><td>(Agilent, Palo Alto, CA).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 600 MHz -NMR</td><td>Bruker Daltonics, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topspin (versão 3.0)-Biospin- software&nbsp;</td><td>Bruker&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC-MS (Modelo # 7890B)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sequenciamento de parede planta heteroxilanos usando enzimática, química (metilação) e físico (espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear) técnicas

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Este protocolo descreve as técnicas específicas utilizadas para a caracterização de reduzir extremidade (RE) e a sequência de glicosilo região interna (s) de heteroxilanos. As paredes celulares do endosperma do trigo de-engomados foram isolados como um resíduo de álcool insolúvel (AR) 1 e sequencialmente extraída com água (W-Sol Pe) e 1 M de KOH contendo 1% NaBH4 (KOH-Sol Fr) como descrito por Ratnayake et al. (2014) 2. Duas abordagens diferentes (ver o resumo na Figura 1) são adotados. No primeiro, AXs W-Sol intactas são tratados com 2AB para marcar o RE espinha dorsal resíduo de açúcar cadeia original e, em seguida, tratada com uma endoxilanase para gerar uma mistura de RE marcado com 2AB região interna e reduzindo oligossacidos, respectivamente. Numa segunda abordagem, o FR-Sol KOH é hidrolisado com endoxilanase a primeira geração de uma mistura de oligossacáridos, que são, subsequentemente, rotulados com 2AB. Os enzimaticamente liberados ((ONU) tag) oligossacarídeos de ambosW- e Pes de KOH-SOL são então metilado e a análise estrutural detalhada de ambos os oligossacáridos nativos e metilados é realizada usando uma combinação de MALDI-TOF-MS, de RP-HPLC-ESI-MS e QTOF-ESI-MS n. Endoxilanase digerido KOH-Sol AXs são também caracterizados por ressonância magnética nuclear (RMN) que também fornece informações sobre a configuração anomérica. Estas técnicas podem ser aplicadas a outras classes de polissacáridos, utilizando os endo-hidrolases adequadas.

Digestão da endoxilanase de 2AB marcado W-Sol AXs gera uma mistura de oligossacáridos RE marcado com 2AB e uma série de oligossacáridos (sem rótulo 2AB) marcado com un derivadas das regiões internas da cadeia de xilano (Figura 1; a partir Ratnayake et ai. 2). Uma série de abordagens cromatográficos é então utilizado para fraccionar a mistura complexa de isómeros. Finalmente, técnicas de MS são utilizados para identificar as estruturas isoméricas que s...

Este protocolo descreve as técnicas específicas usadas para a caracterização estrutural da(s) sequência(s) glicosila(s) final(is) e da região interna redutora(s) de heteroxilanas, marcando o ER com 2 aminobenzamida antes da hidrólise enzimática (endoxilanase) e, em seguida, análise dos oligossacarídeos resultantes usando espectrometria de massa (MS) e ressonância magnética nuclear (RMN).

Sequenciamento de parede planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilação) e físico (espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear) Técnicas

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

O objetivo geral é caracterizar as sequências glicosídicas das extremidades redutoras e das regiões internas de heteroxilanos, marcando o resíduo de açúcar da extremidade redutora original dos heteroxilanos solúveis em água e tratando-os com uma endoxilanase para gerar uma mistura de sacarídeos marcados. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da glicômica, como alterações na estrutura fina de oligossacarídeos ou polissacarídeos em resposta ao desenvolvimento programado da planta, bem como a estressores abióticos e bióticos. A principal vantagem deste método é que ele descreve uma abordagem integrada para o sequenciamento da sequência da extremidade redutora, bem como da sequência interna de qualquer glicano ou polissacarídeo.Prepare uma solução um molar de cianoborohidreto de sódio em um mililitro de água. Em seguida, dissolva 27,2 miligramas do reagente 2AB na solução de cianoborohidreto de sódio aquecendo a 65 graus Celsius e ajustando o pH da mistura reacional para pH 5,5 com ácido acético a 10%. Adicione 200 microlitros da mistura reacional a um miligrama de arabinoxilanas solúveis em água em um tubo de vidro com tampa e homogeneíze utilizando um misturador de vórtice.Incube a amostra por duas horas a 65 graus Celsius em uma capela. Após a incubação, resfrie a suspensão até a temperatura ambiente e adicione quatro volumes de etanol absoluto. Coloque a suspensão em refrigeração durante a noite para precipitar os polissacarídeos.Em seguida, centrifugue a amostra e remova o sobrenadante. Lave extensivamente o pellet com etanol absoluto, acetona e metanol, centrifugando entre cada lavagem. Seque o pellet a vácuo a 40 graus Celsius durante a noite.Dissolva um miligrama dos arabinoxilanos solúveis em água marcados com 2AB em 500 microlitros de tampão de acetato de sódio em um tubo de microcentrífuga. Adicione quatro unidades de endoxilanase e incube a 37 graus Celsius por 16 horas. Inative a atividade da enzima aquecendo a mistura de reação por 10 minutos em banho-maria fervente.Resfrie a suspensão até a temperatura ambiente e transfira para um tubo de vidro com tampa. Após adicionar quatro volumes de etanol absoluto, coloque a suspensão em refrigeração durante a noite para precipitar quaisquer polissacarídeos não digeridos. Centrifugue para formar um pellet dos polissacarídeos não digeridos, separando-os dos oligossacarídeos gerados pela endoxilanase.Em seguida, decante o sobrenadante para um tubo plástico limpo e coloque-o em um banho-maria aquecido. Evapore o etanol sob fluxo de gás nitrogênio até atingir o volume final desejado. Congele o sobrenadante a menos 80 graus Celsius por quatro horas antes de secar o sobrenadante congelado em um liofilizador para recuperar os xilooligossacarídeos.Para gerar os xilooligossacarídeos a partir de arabinoxilanas solúveis KO8 e marcação com 2AB, consulte o protocolo no texto. Para preparar a solução da matriz MALDI, adicione uma pequena quantidade de DHB a 500 mililitros de acetonitrila a 50 por cento contendo ácido fórmico a 0,1 por cento em um tubo. Misture utilizando um vórtex.Se dissolver rapidamente, adicione outra pequena porção de DHB. Deposite as amostras aquosas nativas de oligossacarídeos em uma placa alvo para MALDI. Adicione 0,3 microlitros da solução de matriz MALDI utilizando uma ponteira separada e misture pipetando para cima e para baixo.Deixe a mistura secar à temperatura ambiente. Introduza a placa alvo na fonte de espectrometria de massas (MS) e opere no modo de íons positivos. Ajuste a tensão do acelerador para 19 quilovolts na fonte de íons um e para 16,3 quilovolts na fonte de íons dois.Ajuste a potência do laser para mais de 70 por cento. Selecione o ponto da amostra na placa alvo de MALDI e clique em iniciar para começar os disparos a laser. Analise os oligossacarídeos gerados por endoxilanase nativa utilizando nano HPLC acoplado a um instrumento de espectrometria de massas com ionização por eletrosspray, quadrupolo e tempo de voo, com separação cromatográfica online usando uma coluna C18 de fase reversa.Transfira a mistura aquosa de oligossacarídeos gerada pela endoxilanase para um vial e coloque no amostrador automático da HCLC. Programe o gradiente de eluição de cinco a 80 por cento com as fases móveis 0,1 por cento de ácido fórmico em água e 0,1 por cento de ácido fórmico em acetonitrila, respectivamente, ao longo de 60 minutos. Execute o programa de cromatografia líquida e elua os oligossacarídeos.Pressione adicionar amostra, digite o nome da amostra e pressione o botão ok. Selecione o arquivo do método de espectrometria de massas e pressione o botão enviar. Em seguida, inicie a amostra.O cromatograma de íons totais resultante, ou CIT, é salvo automaticamente pelo software. Abra o CIT salvo e selecione extrair cromatograma. Digite as massas esperadas na linha de comando.Analise o cromatograma clicando em enter antes de processar as varreduras de íons selecionados usando o software de acordo com as instruções do fabricante. Insira um a dois microlitros da amostra de oligossacarídeo per-O-metilado em 50 por cento de acetonitrila em uma ponta de nanospray usando uma seringa. Apare a nanospray com um cortador de vidro para ajustá-la ao suporte de nanospray específico acoplado ao espectrômetro de massas. Ajuste a massa de acordo com a faixa de massa esperada, o gás cortina para 10, a tensão de pulverização iônica para 1900 volts e a polaridade para positiva.Pressione o botão adquirir para abrir a janela relevante. Em seguida, insira o nome do arquivo de dados para obter um espectro de íons totais antes de pressionar o botão parar. Altere o tipo de varredura de íon produto para fragmentar uma parte de interesse.Insira a massa de interesse para fragmentação e ajuste a faixa de massa. Pressione o botão de aquisição e ajuste a energia de colisão para obter a fragmentação completa do íon pai e adquira um espectro de íons fragmentados. Dissolva a mistura de oligossacarídeos gerada pela endoxilanase em um mililitro de óxido de deutério em um tubo de ensaio plástico de dez mililitros.Congele a suspensão a menos 80 graus Celsius por quatro horas antes de secar a suspensão congelada em um liofilizador para recuperar os xilooligossacarídeos. Em seguida, dissolva os oligossacarídeos secos em 0,6 mililitros de óxido de deutério e adicione 0,5 microlitros de acetona a cinco por cento em óxido de deutério como padrão interno. Transfira os oligossacarídeos deuteriados para o tubo de amostra de RMN.Segure o tubo de RMN contendo a amostra pela extremidade superior e insira o tubo de amostra em um rotor de plástico. Coloque o rotor no medidor de profundidade da amostra. Empurre ou puxe o tubo de amostra para ajustar a profundidade da amostra, garantindo que a linha central dos medidores de profundidade superior e inferior da amostra sejam iguais.Remova o medidor de profundidade e insira a amostra no amostrador automático acoplado a um espectrômetro de RMN de 600 megahertz equipado com uma sonda criogênica. Prossiga para realizar o experimento de RMN e analisar os espectros resultantes conforme descrito no protocolo textual. Os sinais no espectro de MS de oligossacarídeos derivados de arabinoxilanas solúveis em água nativas marcadas com 2AB, obtido por MALDI-TOF, incluem uma série de oligossacarídeos neutros e ácidos da região interna não marcados, bem como oligossacarídeos originalmente marcados com 2AB em suas extremidades redutoras.Mostram-se aqui as varreduras de íons selecionados das cromatografias MS com corte de ESI de oligossacarídeos nativos derivados de oligossacarídeos da região interna gerados pelo tratamento com endoxilanase de arabinoxilanas solúveis em água marcadas com 2AB. Também são apresentadas varreduras de oligossacarídeos nativos derivados de oligossacarídeos da extremidade redutora com marcação 2AB e de oligossacarídeos ácidos da região gerados da mesma forma. Grupos hidroxila não metilados gerados durante a fragmentação em fase gasosa de oligossacarídeos per-O metilados em espectrometria de massas fornecem uma marca de diferença de massa de 14 Dalton utilizada para identificar o padrão de ramificação e as sequências glicosídicas.Cada cicatriz gerada pelo evento de fragmentação é marcada como uma linha contínua, já que várias estruturas isoméricas são possíveis para uma massa definida. Os íons Y são rotulados em vermelho e os íons B são rotulados em preto. A análise dos espectros de MS em tandem por ionização por eletrospray de glicosais alditóis redutores e neutros per-O-metilados, constituídos por quatro resíduos de açúcar pentose e xilitol, na razão massa/carga 885, indica que a sequência do glicosil redutor consiste na cadeia lateral de arabinose ligada ao resíduo de xilitol na extremidade redutora e/ou tanto ao xilitol na extremidade redutora quanto ao resíduo de xilosila penúltimo.Após este procedimento, outros métodos como perfilagem por cromopriorossomicro e eletropulsos podem ser realizados para responder perguntas como a especificidade de epítopos de anticorpos e triagem rápida de alterações na estrutura fina. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de glicômica explorarem as características estruturais de glicanos, incluindo o tipo e padrão de substituições com resíduos glicanos ou não glicanos em diferentes tipos de tecidos, estágios de desenvolvimento e espécies. Esta abordagem pode ser aplicada a outras classes de polissacarídeos mediante o uso de endrohidrolases apropriadas.Não se esqueça de que trabalhar com alila de metal e cianoborohidreto de sódio pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de luvas apropriadas e o trabalho em capela devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Biomassa vegetal é um recurso de carbono neutro principais renováveis, que poderiam ser usados ​​para a produção de biocombustíveis. Biomassa vegetal consiste principalmente das paredes das células, um material estruturalmente complexo composto chamado lignocelulose. Aqui nós descrevemos um protocolo para uma análise abrangente do conteúdo e composição da lignina polifenólicos.

Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte I: A lignina

Biomassa vegetal é um recurso de carbono neutro principais renováveis, que poderiam ser usados ​​para a produção de biocombustíveis. Biomassa vegetal consiste principalmente das paredes das células, um material estruturalmente complexo composto chamado lignocelulose. Aqui nós descrevemos um protocolo para uma análise abrangente do conteúdo e composição dos carboidratos da parede derivadas.

Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte II: Os hidratos de carbono

Uma maneira rápida é descrito para obter insights sobre a estrutura de polissacarídeos em uma matriz extracelular. O método aproveita a especificidade do glycosylhydrolases ea sensibilidade da espectrometria de massa permitindo que pequenas quantidades de materiais a serem analisados. Esta técnica é adaptável para ser usada diretamente sobre o tecido em si.

Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares

Profiling glicana de Polímeros da planta da parede celular usando Microarrays

Este protocolo visa apresentar um método geral para visualizar lignina, celulose e hemicelulose em paredes celulares de plantas usando imagem de Raman e análise multivariada.

Combinando imagem Raman e análise multivariada para visualizar Lignina, celulose e hemicelulose no muro celular da planta

Um protocolo para a análise estrutural de polissacarídeos por eletroforese em gel (PACE), usando Medeiros como um exemplo, é descrito.

Caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular Medeiros em plantas usando a ritmo

Um protocolo para a preparação de 13C,15amostras de fungos e plantas N-etiquetados para investigações de polarização nuclear dinâmica (DNP) e espectroscopia NMR Solid-State multidimensional é apresentado.

Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State

Microarray polymer profiling (MAPP) é uma técnica de alto rendimento para análise composicional de glicanos em amostras biológicas.

Perfil de polímero de microarray (MAPP) para análise de glicanos de alto rendimento

O presente protocolo descreve procedimentos utilizados para estudar e caracterizar enzimas relacionadas à parede celular, principalmente β-1,3-glucanase e peroxidase, em plantas de trigo. Seus níveis de atividade aumentam durante a interação trigo-RWA e estão envolvidos na resposta de defesa da planta por meio do reforço da parede celular, o que impede a alimentação de pulgões.

Elucidando # 946; -1,3-glucanase e propriedades físico-químicas da peroxidase do mecanismo de defesa da parede celular do trigo contra a infestação por Diuraphis noxia

Conformação da proteína e dinâmicas são a chave para a compreensão da relação entre estrutura e função de proteínas. Troca de hidrogênio acoplada a espectrometria de massa de alta resolução é um método versátil para estudar a dinâmica de conformação das proteínas, bem como a caracterização da proteína-ligante e interações proteína-proteína, incluindo interfaces de contato e efeitos alostéricos.

Analisando Dynamics proteína utilizando hidrogênio câmbio Espectrometria de Massa

Aprenda a caracterizar sequências glicosídicas de heteroxilanos em paredes celulares vegetais usando marcação com 2-aminobenzamida, hidrólise enzimática com endoxilanase e análise por espectrometria de massa e ressonância magnética nuclear.

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Sequenciamento de parede planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilação) e físico (espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear) Técnicas

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