Name: Métodos para descobrir Uso Promotor Alternativa e regulação da transcrição de Murino Bcrp1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprenda métodos in silico para detectar uso alternativo de promotores no gene murino Bcrp1 (Abcg2) e avaliar sua funcionalidade com ensaios de luciferase. Esta abordagem auxilia pesquisadores em estudos de regulação gênica.

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Este trabalho foi apoiado por Mérito Revisão concessões para Douglas D. Ross e para Arif Hussain, do Departamento de Assuntos dos Veteranos.

1. predição in silico da alternativa de primeira exons do Bcrp1 Utilizando Análise BLAST of Mouse EST Banco de Dados Nota: Este protocolo descreve como procurar a tag rato sequência expressa (EST) do banco de dados de ESTs com similaridade de sequência com o exão 2 de Bcrp1 (que contém o local de início da tradução) e, em seguida, como alinhar as sequências EST correspondentes a sequências genômicas para determinar a sua Localização no gene relativa Bcrp1 rato com a extremidade 5 &#39;do exão 2 Bcrp1. <ol><li> Obter a sequência de rato Bcrp1 exão 2 introduzindo o mRNA ID sequência de referência (NM_011920.3) na janela de busca do navegador Ensembl Genome 17, clique em &quot;Go&quot;. Na próxima tela, selecione uma sequência de comprimento completo (contém 16 exons): <ol><li> Na próxima tela ( &quot;Display à base de transcrição&quot;), selecione &quot;16 exons.&quot; Isto irá exibir uma tela que contém a sequência de todos os exons de Bcrp1. Exon 2 de Bcrp1 vai ler &quot;59; -AAAGGC ... TATCAA-3 &#39; &quot;Os resultados obtidos serão semelhantes aos mostrados na referência 18.. </li><li> Clique na opção &quot;sequência Baixar&quot;. Na tela seguinte, escolha o formato FASTA, em seguida, clique em &quot;Preview&quot;. Na próxima tela, copie a sequência do exão 2 Pré-Visualização na área de transferência. </li></ol></li><li> Navegue até a página inicial BLAST 19 no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) website 20. <ol><li> Selecione genoma &quot;Mouse&quot;. Cole a sequência de exão 2 da área de transferência na caixa de consulta. </li><li> Selecione &quot;ESTs&quot; no menu suspenso banco de dados, otimizar para &quot;sequências altamente semelhantes&quot;, e em seguida, escolha &quot;BLAST&quot;. tempo de execução vai demorar alguns minutos. Quando o BLAST run for concluída, a página de &quot;Resultados&quot; irá aparecer. </li><li> Sob o subtítulo &quot;Descrições&quot; da página &quot;Resultados&quot;, selecione &quot;ALL&quot;, então &quot;Download&quot;, depois &quot;FASTA (completosequência) &quot;na lista suspensa, e depois escolher&quot; Continuar &quot;Um arquivo .txt irá aparecer;. aberta e copie o arquivo inteiro na área de transferência O ficheiro .txt contém as sequências de todos os ESTs com alta similaridade de sequência com o exon2 rato Bcrp1. mas não a sua posição em relação ao exão 2 no gene Bcrp1. Nota: Uma análise realizada em 15 de abril de 2015 identificou 14 ESTs murino que alinhado com Bcrp1 exão 2. Estes são listados na Tabela 1. </li></ol></li><li> Identificar a localização da sequência de EST que é 5 &#39;ao exão 2 no gene Bcrp1. O gene de rato está localizado Bcrp1 na NC_000072.6 contig cromossoma 6 (GI: 372099104). <ol><li> Na página inicial BLAST sob o subtítulo &quot;Explosão Specialized&quot;, selecione &quot;Alinhar dois (ou mais) sequências utilizando BLAST (bl2seq).&quot; </li><li> Cole o arquivo de texto da área de transferência na caixa de consulta e digite 372099104 na caixa de sequência assunto. Otimizar para &quot;sequências altamente semelhantes&quot; no âmbito do programaseleção e BLAST executado. </li><li> Uma vez que a janela de resultados aparece, ver os alinhamentos graficamente clicando em &quot;Graphics&quot; na janela &quot;alinhamentos&quot;. Use as setas direita e esquerda e zoom para focar Bcrp1 / ABCG2 e os alinhamentos de sequência. </li><li> Salvar os alinhamentos de sequências: selecione &quot;ALL&quot; na caixa &quot;Descrição&quot;, então sob o menu suspenso &quot;download&quot;, selecione &quot;Hit mesa (CSV)&quot; e, em seguida, clique em &quot;continuar&quot;. Este ficheiro contém o alinhamento da sequência de Bcrp1 exão 2 e o alinhamento de todas as sequências de EST com similaridade de sequência com Bcrp1 exon2 relativos à numeração dos nucleótidos na sequência contígua rato cromossoma 6. Cada sequência EST completa pode gerar múltiplos alinhamentos de regiões 5 &#39;e 3&#39; que abrangem ao exão 2, que inclui as sequências que se sobrepõem com Bcrp1 exão 2. </li><li> À medida que a posição da extremidade 5 &#39;do exão 2 corresponderá ao nucleótido 58655638 no contig cromossoma 6, designar este como1, e, em seguida, calcular a posição das sequências parciais de cada EST 5 &#39;a 58.655.638. Os resultados para os 14 ESTs são dadas na Tabela 1. Nota: Tenha cuidado para analisar sequências de EST que são 5 &#39;para +1 (ou seja, ter um valor de nucleotídeos negativo) como potenciais primeiros exons. Por exemplo, em duas das ESTs alinhadas com que Bcrp1 exão 2 mostrados na Tabela 1 (AI647825 e AI664571) a sequência restante era 3 &#39;ao exão 2. </li></ol></li></ol> Função 2. Avaliação da Bcrp1 Alternativa Promoter <ol><li> Projeto de repórter constrói para Bcrp1 E1U, E1A, E1B e promotores E1C <ol><li> Usando a sequência de E1U obtido a partir de pesquisar a base EST, designar o primeiro nucleótido de 5 E1U como um. </li><li> Obter um cromossomo artificial bacteriano (BAC) clone do cromossoma do rato 6 que contém a sequência do gene Bcrp1 / ABCG2 e a sequência de pelo menos 100 kb a montante doBcrp1 / gene ABCG2 (veja Lista de Materiais e Equipamentos). <ol><li> Identificar um vector repórter adequado, tal como a luciferase do plasmídeo repórter pGL3-Basic. </li><li> Determinar os múltiplos locais de clonagem no vector repórter. Kpnl, Saci, Mlu1, NheI, Smal, Xhol, BglII e HindIII são os sítios de endonucleases de restrição no local de clonagem múltipla do vector pGL3-Basic, na direcção 5 &#39;para 3&#39;. Nota: A sequência dos locais de digestão está disponível a partir de catálogos de produtos de empresas que produzem as enzimas de restrição. </li><li> Identificar todos os sítios de digestão do exão E1U e região 2 kb 5 &#39;do E1U usando programas de software, tais como DNA5. Identificar, pelo menos, dois sítios de digestão no local de clonagem múltipla pGL3-Basic que não são encontrados em E1U ou 2 kb a montante da região. Nota: certifique-se de escolher um local de restrição local de clonagem múltiplo para o iniciador directo que está a montante do escolhido para o iniciador inverso para garantir que o inserto Will estar na orientação apropriada. </li></ol></li><li> Prepare para a frente e primers para PCR que contenham sequências para os sites múltiplos endonuclease local de clonagem de restrição pGL3-basic selecionados usando os serviços de síntese de gene / primer comerciais ou software de seleção de primer (veja Lista de Materiais e Equipamentos) reversa. Seleccionar um iniciador para a frente localizado ~ 2 kb a montante da sequência E1U e um iniciador inverso dentro da sequência E1U. Os iniciadores utilizados nas autores trabalho anterior incorporou um local de Saci no iniciador para a frente, e um local de Nhel no primer reverso, e amplificado da região genómica de aproximadamente -1.906-64 com o primeiro 5 &#39;de nucleótidos de E1U como especificado + 1 (ver o passo 2.1.1, supra), e são fornecidos na referência 16. <ol><li> PCR amplificar a região genómica E1U utilizando estes iniciadores, 0,01 a 1 pg do BAC, e PCR master mix contendo polimerases Taq de alta fidelidade (ver lista de materiais e equipamentos), com desnaturação a95 ° C durante 30 seg, depois 35 a 40 ciclos de PCR, com extensão a 72 ° C (2 min), e de recozimento e temperaturas de fusão, com base nas características de fusão dos iniciadores utilizados. Nota: A utilização de polimerases Taq de alta fidelidade é essencial para regiões promotoras sequenciamento que têm alto teor de GC. Ao utilizar grandes fragmentos de DNA genómico, como um BAC como molde, a estrutura secundária do ADN genómico pode tornar-se difícil para os iniciadores de PCR para se ligarem. Se este problema surge, os melhores resultados de PCR podem ser obtidos se o tempo molde de ADN genómico é cortado suavemente por ultra-sons antes da reacção de PCR. </li><li> Verificar o comprimento do produto de PCR amplificado por comparação contra uma escada de DNA de 1 kb utilizando 0,8% de agarose TAE de electroforese em gel. </li></ol></li><li> Digerir o produto de PCR obtido e o vector pGL3-Basic, utilizando as endonucleases de restrição específicas para os locais de digestão de restrição introduzidos na iniciadores directos e inversos de acordo com instruções fornecidas com as enzimas da digestão de restrição. <ol><li> Purificar as reacções de digestão usando gel SV comercial e kit PCR Clean-Up Sistemas (veja Lista de Materiais e Equipamentos), seguindo o protocolo do kit 21. <ol><li> Verifique a digestão e linearização do vector, comparando-a contra o vector não cortado utilizando electroforese em gel de agarose, depois cortado e purifica-se a banda de ADN do vector digerido. Medir a concentração do produto de PCR purificado e o vector purificado usando espectrometria de UV (ver Lista de Materiais e Equipamento). </li></ol></li></ol></li><li> Preparar a construção repórter E1U ligando o purificada, enzima de restrição digerida produto de PCR e vaga-lume vector repórter luciferase pGL3-Basic (contido no kit de ensaio de repórter; veja Lista de Materiais e Equipamentos) a inserir: índices vetoriais de 11, 21 e 31, utilizando o &quot;kit de ADN-ligase de T4 de ligação rápida&quot; de acordo com as instruções do kit 22, produzindo desse modo o r E1Uconstructo eporter, chamado pGL3-E1U. <ol><li> Use o plasmídeo pGL3-E1U para transformar bactérias para expandir clonalmente seguintes instruções pGL3-E1U no kit de clonagem TA (veja Lista de Materiais e Equipamentos). </li><li> Confirmar a orientação e fidelidade da inserção por análise de sequência. </li></ol></li><li> Prepare repórter constrói para E1A, E1B e E1C utilizando uma metodologia semelhante como para E1U. Confirmar a fidelidade das inserções por sequenciação como na secção 2.1.5.2. Nota: As inserções de promotor para E1A, E1B e E1C deve ser aproximadamente -1875 / + 10, -1847 / + 60, e -1904 / + 83 relativamente ao primeiro nucleótido 5 (designado como um) de E1A, E1B, ou E1C, respectivamente. </li></ol></li><li> Métodos de ensaio de repórter Nota: Estratégia geral de ensaios de repórter de: o promotor putativo (região 5 &#39;a montante) de um gene é inserido no local de clonagem múltipla de um vector vazio &quot;repórter&quot; que contém um &quot;reportegene R &quot;(por exemplo, luciferase de pirilampo), a jusante do local de clonagem múltipla. O vector é então transfectado para as células eucarióticas que expressam o gene de interesse. Os factores que actuam em trans que promovem a expressão do gene de interesse nestas células devem activar o promotor no vector repórter transfectadas, fazendo com que a expressão de luciferase do pirilampo, o que pode ser facilmente quantificada com um ensaio de luminescência. <ol><li> Marque a linha celular apropriada a ser usada para o ensaio de repórter. Nota: Para avaliar a actividade da construção do repórter promotor alternativo E1U, é necessário transfectar que construir em células que expressam Bcrp1 sob o controlo do promotor E1U. A linha de células de Sertoli murino TM4 (veja Lista de Materiais e Equipamentos) expressa a proteína Bcrp1 e Bcrp1 mRNA contendo E1U, bem como E1A, E1B e E1C 5. Como um controlo negativo, considerar o uso de uma linha celular que não expressa a proteína Bcrp1 ou ARNm. </li><li> Cultura do ce TM4lls em placas de 24 poços a uma densidade inicial de 200000 células / cavidade em uma mistura 1: 1 de meio F12 de Ham e meio de Eagle modificado por Dulbecco com 1,2 g / L de bicarbonato de sódio, 15 mM de HEPES suplementado com soro de cavalo a 5%, 2,5% soro fetal bovino, penicilina (100 UI / ml) e estreptomicina (100 ug / ml), a 37 ° C, 5% de CO 2, como descrito anteriormente 5. </li><li> Seis horas após a colocação das células em cultura, transfectar as células com 0,2 ug de vector vazio pGL3-basic ou com 0,2 ug de vector pGL3 contendo o E1U -1906 / + 64 ou -1875 / + 10 E1A ou -1847 / + 60 E1B ou -1904 / + 83 E1C Bcrp 1 deleção construir junto com 4 ng da pRL-TK (a Renilla-expressando luciferase vector) como controle interno, utilizando um kit de DNA transfecção comercial e protocolo do fabricante 23 (ver Lista de Materiais e Equipamentos) . </li><li> 30 horas após a transfecção, remova o meio de crescimento da culturEd células transfectadas. Lave as células uma vez com 200 mL de PBS, em seguida, remover a solução de lavagem. <ol><li> Medir a actividade da luciferase do pirilampo e da Renilla usando um kit comercial de acordo com os protocolos do fabricante 24. </li></ol></li><li> Expressar a actividade de cada tubo como a razão entre a actividade de luciferase de pirilampo dividido pelo (luciferase da Renilla) de controlo interno; resultados globais são geralmente expressas como a actividade de cada repórter construir em relação à das células transfectadas com o vector básico pGL3 vazio, o que é dado um valor de 1. </li></ol></li></ol>

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<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Bulun, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aromatase+expression+in+breast+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue.</a> Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).</li>
</ol>

Douglas D. Ross e da Universidade de Maryland, Baltimore titular de direitos de patente para BCRP humano.

A maioria dos métodos e os resultados representativos apresentados encontram-se descritos em trabalhos anteriores, intitulado &quot;B transcrição crp1 no testículo do rato é controlada por um promotor a montante de um novo primeiro exão (E1U) regulado por factor 1 de esteroidogênica&quot;, que foi publicada em 2013 5 . para além dos resultados representativos descritos aqui, o trabalho anterior proporcionou estimativas de utilização exão primeira alternativa utilizando 5&#39;-RACE PCR e RT-PCR metodo...

Mais de metade dos genes humanos são regulados por promotores alternativos 1. Cada promotor alternativa pode conter elementos reguladores que podem ser diferentes das de outros promotores alternativos. O promotor (es) utilizado num tecido podem ser diferentes daquelas usadas num outro tecido. Por exemplo, é possível que a activação de uma determinada via de sinalização pode desencadear o promotor alternativo para um gene utilizado em um tecido, mas não têm efeito sobre ou reprimir um promotor separado alternativa para o mesmo gene que é utilizado noutro tecido. A expressão do gene é regulada pelo Bcrp1 promotores alternativos. Bcrp1 é o ortólogo de murídeo do gene humano da mama cancro da Resistência Proteína (BCRP). BCRP é um transportador de cassete de ligação a ATP (ABC), ABCG2 2, 3 designado formalmente. Como uma proteína da membrana plasmática apical, funções / Bcrp1 BCRP efluxo de uma grande variedade de substratos naturais e xenobióticos <sup&gt; 3, 4. Em humanos e ratos, BCRP / Bcrp1 é altamente expresso em órgãos farmacologicamente relevantes, tais como o fígado (canalículos biliares), intestino e rins, bem como órgãos com barreiras sangue-tecido, como placenta, cérebro e testículos 2, 5 - 12. Expressão da BCRP / Bcrp1 em hematopoiético e outras células estaminais, incluindo cancro de células estaminais, pode conferir resistência dessas células a xenobióticos e fármacos quimioterapêuticos de cancro 3. Em trabalho inicial de compreender a regulação da expressão BCRP em células normais e neoplásicas, 5 &#39;amplificação rápida de extremidades de ADNc (5&#39;-RACE) análise de ARNm BCRP foi realizado para determinar o seu local de início da transcrição exacta 13. Não só foram vários locais de início da transcrição encontrados; Também foram encontradas três formas alternativas do primeiro exão, o qual é em BCRP não traduzida. Estes primeiros exons alternativos - designadas E1a, E1b, E1C - foram expressos de forma diferente em uma variedade de tecidos humanos. Duas primeiras variantes de exão adicionais foram descobertos em uma pesquisa BLAST da base de dados EST humana usando o segundo exão do BCRP 13. Quatro partidas revelou um primeiro exão&gt; 70 kb a montante do exão 2, que foram designados E1u; outras quatro partidas revelou mRNA BCRP que faltava um primeiro exão inteiramente, que foram designados E1 13. A presença de exões alternativos líder é considerado ser uma manifestação da utilização promotor alternativa 14. Em ratinhos, quatro primeiros exões alternativos de Bcrp1 são descritos que podem corresponder aos promotores alternativos que governam a transcrição Bcrp 1 em diferentes tecidos de ratinho; estes exons / promotores são designados E1U, E1A, E1B e E1C, e estão localizados cerca de 70, 58, 15 e 5 kb a montante de Bcrp1 exão 2 5, 15. A isoforma de ARNm de E1A foi encontrado para ser predominante em Murine células-tronco hematopoiéticas, coração, pulmão, baço e cérebro, ao passo que a isoforma E1B foi expressa no intestino do rato, células de fígado fetal, e as células precursoras eritróides na medula óssea de 5, 15. O promotor a montante de E1B foi demonstrado que é o principal promotor alternativo que rege Bcrp1 transcrição no intestino do rato, regulada, pelo menos em parte, por fosfo-AMP-cíclico proteína elemento de resposta de ligação (p-CREB) e um elemento de resposta de CREB única para esse alternativa promotor Bcrp1 16. A isoforma ARNm E1C é predominantemente expresso no fígado de murino adulto e o rim 5. A isoforma E1U não é detectável na maioria dos tecidos testados excepto para testículo de murino, em que é a isoforma predominante expressa 5. Bcrp1 expressa em testículos de ratos é encontrado em ambos os somáticas (junções endoteliais apertadas, células mióides peritubulares e células de Sertoli) e células germinativas (no endotélio seminífero, onde ele pode proteger em estágio final spermatids 4). a rega montante do ião E1U contém um elemento de resposta funcional para esteroidogênica factor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 ARNm e proteína são marcadamente reduzida nos testículos dos ratinhos knockout de Sertoli específicos de células SF-1, sugerindo que a expressão em células de Sertoli Bcrp1 murino é controlado por SF-1 5. Os protocolos apresentados métodos para detectar detalhe primeiros exões alternativos de Bcrp1 in silico, e para estabelecer ensaios de repórter de luciferase baseados em promotores putativos para a montante dos primeiros exões alternativos identificados.

<table><tbody><tr><td colspan="4">COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS:</td></tr><tr><td>First Choice RLM-RACE kit</td><td>Ambion Inc., Austin, TX, atualmente disponível através do kit de</td> PCR <td>Life Technologies AM1700</td><td>5'-RACE</td></tr><tr><td>Kit de clonagem TOPO TA Life</td><td>Technologies</td><td>K450001</td><td>Este kit contém as bactérias TOP10 quimicamente competentes E. coli.</td></tr><tr><td>Kit de ligação rápida de DNA ligase T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>Faststart Taq- DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>Sigma-Aldrich/Roche</td><td>3553400001/RMB-4738284001&nbsp;</td><td>Contém uma mistura de enzimas Taq polimerase de alta fidelidade</td></tr><tr><td>Reagente de transfecção de DNA XtremeGENE HP</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio repórter de luciferase dupla</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>Inclui o vetor repórter vazio pGL3-básico (luciferase de vaga-lume), vetor de expressão de luciferase de renilla pRLTK e outros vetores de controle.</td></tr><tr><td>QIAprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Para miniprep de plasmídeo - isolamento e purificação de DNA de plasmídeo de colônias bacterianas</td></tr><tr><td>pCR2.1 parte</td><td>do vetor do kit</td><td></td><td></td>de clonagem TOPO TA</tr><tr><td>pGL3-basic luciferase contendo vetor</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td></td></tr><tr><td>pRL-TK Renilla luciferase expressando vetor</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>Cromossomo artificial bacteriano</td><td>Centro de Recursos BACPAC, Crianças s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA</td><td>RP23-285A12 e RP24-314E24</td><td>http://bacpac.chori.org/clones.htm</td></tr><tr><td colspan="4">REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; Sistema de Limpeza SV Gel e PCR&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Útil para purificar produtos de PCR após digestão com endonucleases de restrição</td></tr><tr><td>CRIÓVIAIS</td><td>Denville Scientific</td><td>V9012</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SOFTWARE:</td></tr><tr><td>Ensembl software</td><td>Projeto Ensembl</td><td>http://Ensembl.org&nbsp;</td><td>O projeto Ensembl produz bancos de dados de genoma para vertebrados e outras espécies eucarióticas e disponibiliza essas informações gratuitamente online.</td></tr><tr><td>Software de jateamento</td><td>NCBI</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web& PAGE_TYPE=Software BlastHome</td><td></td></tr><tr><td>Primer 3</td><td>Simgene</td><td>http://simgene.com/Primer3</td><td>Útil para projetar primers para 5'-RACE PCR</td></tr><tr><td>NCBI Banco de dados de nucleotídeos</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">CELL LINES:</td></tr><tr><td>TM4 células murinas de Sertoli</td><td>ATCC, Manassas, Virginia</td><td>CRL-1715&trade;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">INSTRUMENTS:</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Turner Biosystems</td><td>TD-20/20</td><td>Este é um luminômetro relativamente barato, operado manualmente. Sistemas automatizados também estão disponíveis no mesmo fabricante que utilizam placas de 96 poços.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetros NanoDrop</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td>O espectrofotômetro <td>NanoDrop 2000</td><td>pode usar quantidades muito pequenas de</td></tr><tr><td>espectrofotômetro UV/VIS DU 800 de amostra e software de análise de ácido nucleico II</td><td>BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA</td><td>DU 800</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para descobrir uso promotor alternativa e regulação da transcrição de murino bcrp1

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

a expressão do gene em diferentes tecidos é frequentemente controlada por promotores alternativos que resultam na síntese de ARNm com exclusivos - normalmente não traduzidas - primeiros exões. Bcrp1 (ABCG2), o ortólogo de murídeo da mama ABC transporter Resistência cancro Proteína (BCRP, ABCG2), tem pelo menos quatro promotores alternativos que são designadas pelos quatro primeiros exões alternativos correspondentes produzidos: E1U, E1A, E1B, E1C e. Nisto, in silico protocolos são apresentados para predizer o uso alternativo promotor para Bcrp1. Além disso, os métodos de ensaio de repórter são descritos para produzir construções repórter para promotores alternativos e para determinar a funcionalidade de promotores putativos a montante do primeiro exões alternativos que são identificados.

Identificação de Bcrp utilização promotor 1 alternativo no testículo do rato através da análise de exons líder Quando o banco de dados de EST no NCBI foi sondada (Abril de 2015) utilizando os passos descritos no Protocolo 1, os ESTs encontrados que foram contígua com a extremidade 5 &#39;do exão 2 no Bcrp 1 ARNm estão apresentados na ...

Com o transportador ABC de murino Bcrp1 (ABCG2) como um exemplo, in silico protocolos são apresentados para detectar alternativos de utilização do promotor nos genes expressos em tecidos de ratinho, e para avaliar a funcionalidade dos promotores alternativos identificados utilizando ensaios de repórter.

Métodos para descobrir Uso Promotor Alternativa e regulação da transcrição de Murino Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

O objetivo geral deste conjunto de protocolos é detectar éxons iniciais alternativos no mRNA de um gene, como o Bcrp1, e estabelecer ensaios de repórter baseados em luciferase para os promotores putativos localizados a montante dos éxons iniciais alternativos identificados. Os métodos in-silico utilizados podem ajudar a responder perguntas fundamentais na área de transcrição e regulação, como a forma como a expressão de mRNA é controlada em diferentes tecidos. A principal vantagem desta técnica é que utiliza dados genéticos de acesso público para identificar éxons iniciais alternativos no mRNA do gene de interesse, o que implica o uso de promotores alternativos.Este método que prepara construtos repórter e realiza ensaios repórter pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de regulação gênica, como a atividade funcional de promotores alternativos putativos. Para iniciar este procedimento, obtenha a sequência do éxon 2 do Bcrp1 de camundongo inserindo o ID da sequência de referência do mRNA na janela de busca do navegador do genoma Ensembl e clique em Ir. Em seguida, selecione uma sequência completa que contenha 16 éxons. Clique na opção Baixar sequência.Em seguida, escolha o formato FASTA e clique em Visualizar. Na tela seguinte, copie a sequência de visualização do éxon 2 para a área de transferência. Acesse a página inicial do blast no site do NCBI.Selecione o genoma do camundongo. Cole a sequência do éxon 2 da área de transferência na caixa de consulta. Em seguida, selecione ESTs no menu suspenso do banco de dados.Otimize-o para sequências altamente semelhantes e, em seguida, escolha BLAST. Quando a execução do BLAST for concluída, a página de resultados será exibida. No subitem Descrições da página de resultados, selecione Todos, depois Baixar, seguido de FASTA no menu suspenso, e então escolha Continuar.Um arquivo txt aparecerá. Abra e copie todo o conteúdo do arquivo para a área de transferência. Para identificar a localização da sequência EST que está na extremidade cinco prima do éxon 2 no gene Bcrp1, na página inicial do BLAST, embaixo do subtítulo BLAST Especializado, selecione Alinhar duas sequências usando o BLAST.Cole o arquivo de texto da área de transferência na caixa de consulta e insira 372099104 na caixa Sequência do Assunto. Otimize para sequências altamente semelhantes na Seleção de Programa e execute o BLAST. Quando a janela de resultados aparecer, visualize os alinhamentos graficamente clicando em Gráficos na janela de Alinhamentos.Use as setas direita e esquerda e o zoom para focar em Bcrp1/ABCG2 e nos alinhamentos de sequência. Em seguida, salve os alinhamentos de sequência selecionando Todos na caixa Descrições. No menu suspenso Baixar, selecione Tabela de Resultados e clique em Continuar.Como a posição da extremidade cinco prima do éxon 2 corresponde ao nucleotídeo 58.655.638 no contig do cromossomo seis, designe esta como mais um e, em seguida, calcule a posição das sequências parciais de cada extremidade cinco prima de EST em relação a 58.655.638. Uma etapa crítica neste procedimento é a predição de múltiplos éxons iniciais. Os promotores alternativos são, portanto, identificados aqui.Usando a sequência de E1U obtida do banco de dados EST, designe o primeiro nucleotídeo no extremo cinco prima de E1U como mais um. Obtenha um clone reverso do cromossomo seis de camundongo que contenha a sequência do gene Bcrp1/ABCG2 e a sequência de pelo menos 100 quilobases a montante do gene Bcrp1/ABCG2. Em seguida, identifique um vetor repórter apropriado, como o plasmídeo repórter de luciferase pGL3-Basic.Determine os sítios de clonagem múltipla no vetor repórter. KpnI, SacI, MluI, NheI, SmaI, XhoI, BglII e HindIII são os sítios de restrição de endonucleases no sítio de clonagem múltipla do vetor pGL3-Basic na orientação de cinco primas para três primas. Em seguida, selecione a região de dois quilobases a montante do éxon E1U e cole a sequência no DNA5 antes de executar o programa.Os detalhes dos sítios de digestão simples e múltipla serão exibidos. Em seguida, compare a lista de sítios de digestão na região E1U com o MCS no vetor pGL3-Basic em uma planilha do Excel. Posteriormente, prepare os primers direto e reverso para PCR que contenham sítios de restrição endonuclease utilizando serviços comerciais de síntese de primers ou software de seleção de primers.Selecione uma ponta direta localizada cerca de dois quilobases a montante da sequência E1U e uma ponta reversa dentro da sequência E1U. Em seguida, amplifique a região genômica E1U utilizando essas pontas com 0,01 a um micrograma de Bak e PCR Master Mix contendo polimerase taq de alta fidelidade. Posteriormente, verifique o comprimento do produto PCR amplificado comparando-o com uma escada de DNA de um quilobase utilizando eletroforese em gel de agarose TAE 0,8%.Em seguida, digira o produto de PCR obtido e o vetor pGL3-Basic utilizando endonucleases de restrição específicas para os sítios de digestão por restrição introduzidos nos iniciadores direto e reverso. Então, verifique a digestão do produto de PCR por meio de eletroforese em gel de agarose. Corte o DNA do vetor digerido e a banda de PCR de dois quilobases do gel de agarose.Em seguida, extraia o DNA do vetor digerido e a banda de PCR de dois quilobases dos fragmentos de gel usando um kit comercial de purificação de gel e PCR. Meça a concentração do produto de PCR purificado e do vetor purificado utilizando espectrometria UV. Posteriormente, prepare o construto repórter E1U ligando o produto de PCR digerido com enzima de restrição purificado e o vetor repórter de luciferase de vaga-lume pGL3-Basic usando o kit de ligação rápida com ligase T4 de DNA, gerando assim o construto repórter E1U denominado pGL3 E1U.Nesta etapa, cultive as células TM4 em placas de 24 poços com uma densidade inicial de 200.000 células por poço. Seis horas após colocar as células em cultura, transfecte-as com 0,2 microgramas do vetor MP pGL3-Basic ou com 0,2 microgramas do vetor pGL3, juntamente com quatro nanogramas de pRL-TK como controle interno. Trinta horas após a transfeção, remova o meio de crescimento das células transfectadas.Lave as células com PBS, depois remova a solução de lavagem. Em seguida, meça a atividade da luciferase de firefly e Renilla utilizando um kit comercial. Expresse a atividade de cada tubo como a razão entre a atividade da luciferase de firefly dividida pelo controle interno.Esta etapa confirma a atividade funcional do promotor específico do testículo. Aqui está o ensaio de repórter para os promotores E1U, E1A, E1B e E1C do Bcrp1 em lâmpadas, que são células TM4 totalmente derivadas de células. Os dados são expressos como a luminiscência da luciferase de vaga-lume normalizada em relação à da luciferase de Renilla.O asterisco indica uma diferença significativa em relação ao controle do vetor MP pGL3. Este gráfico mostra os efeitos da mutação do elemento de resposta ao SF-1 na construção do vetor repórter Bcrp1 E1U sobre a atividade da luciferase. Construções repórter do Bcrp1 com uma região putativa de ligação ao SF-1 foram transfectadas em células TM4 com e sem a expressão forçada do SF-1.Na figura, a indica uma diferença significativa em relação ao vetor vazio controle pGL3; b indica uma diferença estatisticamente significativa em comparação com o construto do promotor E1U nas células transfectadas com o vetor. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de selecionar uma linhagem celular apropriada para o ensaio de repórter. A linhagem celular deve expressar o gene de interesse sob o controle do promotor presente no construto repórter.Após este procedimento, outros métodos, como a RT-PCR quantitativa, podem ser realizados para facilitar a avaliação do uso de promotores alternativos em múltiplas amostras de tecidos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como prever o uso de promotores alternativos para um gene de interesse e como determinar a funcionalidade desse promotor.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui estamos apresentando uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) procedimento para análise do genoma localização das isoformas de proteínas que diferem em um domínio de ligação de histonas. Estamos aplicando-a-CHIP Seq análise para identificar os alvos da demetilase KDM5A/JARID1A/RBP2 histonas.

Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

O ensaio genético repórter é uma ferramenta bem estabelecida e poderosa para dissecar a relação entre as sequências de DNA e suas atividades reguladoras de genes. O acoplamento de elementos reguladores candidatos a genes repórteres que carregam etiquetas de sequência de identificação permite a paralelização massiva desses ensaios.

Ensaios Repórter Massively Parallel em células de mamíferos cultivadas

O método descrito aqui é usado para induzir a cascata de sinalização apoptótica em etapas definidas, a fim de dissecar a atividade de uma proteína efetora bacteriana antiapoptótica. Este método também pode ser usado para expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicas, ou para dissecar interferência com outras vias de sinalização.

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

Elementos reguladores de DNA, como potenciadores, controlam a expressão gênica fisicamente contactando promotores de genes alvo, muitas vezes através de interações cromossômicas de longo alcance, abrangendo grandes distâncias genômicas. Promotor de capturar Hi-C (PCHi-C) identifica interações significativas entre promotores e regiões distais, permitindo a atribuição de potenciais sequências reguladoras de seus genes-alvo.

Promotor captura Oi-c: Alta resolução, todo o genoma caracterização das interações do promotor

Aqui nós apresentamos um protocolo para desenvolver um sistema inducible negativo dominante, em que qualquer proteína pode ser condicionalmente inativada pela superexpressão reversivelmente uma versão mutante dominante negativo dele.

Inibição de proteína inducible e reversível dominante-negativo (DN)

Aqui descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação eficiente de cromatina (ChIP) seguido por sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) do tecido adiposo marrom (BAT) isolado de um rato. Este protocolo é apropriado para o mapeamento de modificações do histone e investigando a localização de todo o genoma de proteínas não-histonas de interesse em vivo.

Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino

Este protocolo descreve as etapas necessárias para gerar um modelo de sistema em que a transcrição de um gene endógeno de interesse pode ser condicionalmente controlada em animais vivos ou células usando reforçada ALC repressor e/ou sistemas de ativador de tet .

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

A entrega direta de complexos de ribonucleoproteína de RNA de Cas9/guia pré-montados é um meio rápido e eficiente para a edição de genoma em células hematopoiéticas. Aqui, nós utilizamos esta aproximação para suprimir de um silenciador intronic RUNX1 e para examinar as respostas transcricional em pilhas leucêmicas OCI-AML3.

Investigação do papel transcricional de um silenciador intrônico RUNX1 por crispr/Cas9 Ribonucleoproteína em células de leucemia mielóide aguda

Aqui descrevemos um método de superexpressão retroviral e transferência adotiva de células murine B-1a para examinar a migração e localização celular in vivo B-1a. Este protocolo pode ser estendido para diversos ensaios funcionais a jusante, incluindo quantificação da localização celular do doador B-1a ou análise de fatores secretos derivados de células doadoras pós-transferência adotiva.

Superexpressão retroviral de CXCR4 em células Murine B-1a e transferência adotiva para migração de células B-1a direcionadas para a produção de medula óssea e igM

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Um fluxo de trabalho integrado para estudar a arquitetura do genoma espaço-temporal centrada no promotor em populações celulares escassas

Aprenda métodos in silico para detectar uso alternativo de promotores no gene murino Bcrp1 (Abcg2) e avaliar sua funcionalidade com ensaios de luciferase. Esta abordagem auxilia pesquisadores em estudos de regulação gênica.

Métodos para descobrir Uso Promotor Alternativa e regulação da transcrição de Murino Bcrp1

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