Name: Combinado optogenética e Freeze-fratura Replica imunomarcação para examinar Arranjo específicos de entrada de glutamato receptores no mouse Amygdala (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprenda a combinar optogenética com imunomarcação de réplicas de fratura por congelamento para analisar a densidade de receptores de glutamato em sinapses da amígdala de camundongo. Este método permite a análise quantitativa da organização molecular de circuitos neurais específicos com alta resolução.

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O financiamento foi fornecido pelo Fundo Austríaco de Ciência FWF concessão nº P-22969-B11 para F. Ferraguti, e pela Charitable Hertie Foundation e pelo Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience e pelo DFG (CIN-Exc. 307) para I. Ehrlich.

<ol><li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-digested+freeze-fracture+replica+labeling+electron+microscopy+to+study+the+two-dimensional+distribution+of+integral+membrane+proteins+and+phospholipids+in+biomembranes%3A+practical+procedure%2C+interpretation+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application.</a> Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).</li>
<li>Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+quantitative+visualization+of+glutamate+and+GABA+receptors+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).</li>
<li>Rash, J. E., Yasumura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+immunogold+labeling+of+connexins+and+aquaporin-4+in+freeze-fracture+replicas+of+liver%2C+brain%2C+and+spinal+cord%3A+factors+limiting+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis.</a> Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).</li>
<li>Emes, R. D., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+synapse+complexity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of synapse complexity and diversity.</a> Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).</li>
<li>Matsuzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+geometry+is+critical+for+AMPA+receptor+expression+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).</li>
<li>Rollenhagen, A., Lübke, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+of+excitatory+central+synapses%3A+from+structure+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The morphology of excitatory central synapses: from structure to function.</a> Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).</li>
<li>Tarusawa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-specific+intrasynaptic+arrangements+of+ionotropic+glutamate+receptors+and+their+impact+on+postsynaptic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses.</a> J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).</li>
<li>Nusser, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).</li>
<li>Nyìri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+variability+in+synaptic+N-methyl-D-aspartate+receptor+density+on+interneurons+and+a+comparison+with+pyramidal-cell+spines+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus.</a> Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).</li>
<li>Nicholson, D. A., Geinisman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axospinous+synaptic+subtype-specific+differences+in+structure%2C+size%2C+ionotropic+receptor+expression%2C+and+connectivity+in+apical+dendritic+regions+of+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+cells+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li>
<li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li>
<li>Amano, T., Unal, C. T., Paré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+correlates+of+fear+extinction+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala.</a> Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).</li>
<li>Duvarci, S., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+microcircuits+controlling+learned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Amygdala microcircuits controlling learned fear.</a> Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).</li>
<li>Jüngling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+S-mediated+control+of+fear+expression+and+extinction%3A+role+of+intercalated+GABAergic+neurons+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala.</a> Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).</li>
<li>Asede, D., Bosch, D., Lüthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li>
<li>Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+Pavlovian+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of Pavlovian fear conditioning.</a> Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).</li>
<li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition%2C+expression%2C+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li>
<li>Sigurdsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+in+the+amygdala%3A+a+cellular+mechanism+of+fear+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li>
<li>Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex-vivo+optogenetic+dissection+of+fear+circuits+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (110), e53628(2016).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Bienvenu, T. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+intercalated+neurons+of+amygdala+relay+noxious+sensory+information%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information.</a> J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).</li>
<li>Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+aggregations+at+specialized+sites+in+freeze-etched+postsynaptic+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes.</a> Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).</li>
<li>Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Paré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+intercalated+neurons+are+required+for+expression+of+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction.</a> Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).</li>
<li>Fukazawa, Y., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-synapse-type+and+inter-synapse-type+relationships+between+synaptic+size+and+AMPAR+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).</li>
<li>Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+cytochemistry+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunogold cytochemistry in neuroscience.</a> Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).</li>
<li>Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R. SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFukazawa%2C+Y+%22Handbook+of+Cryo-Preparation+Methods+for+Electron+Microscopy%22">Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy</a>. Cavalier, A., et al. , CRC Press. Boca Raton. 567-586 (2007).</li>
<li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-fracture+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).</li>
<li>Tanaka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+density+of+AMPA+receptors+in+single+synapses+in+immature+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum.</a> J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).</li>
<li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+subsynaptic+localization+of+type+1+metabotropic+glutamate+receptors+at+glutamatergic+and+GABAergic+synapses+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex.</a> Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).</li>
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

microscopia eletrônica de fractura por congelação tem sido uma técnica importante na investigação ultra-estrutural há mais de 40 anos. No entanto, a falta de meios eficazes para estudar a composição molecular de membranas produzido um declínio significativo na sua utilização. Recentemente, tem havido um grande avivamento em microscopia electrónica de congelação-fractura, devido ao desenvolvimento de meios eficazes para revelar proteínas de membrana integrais por imunomarcação 1, 2, ou seja, a técnica de FRIL. A técnica FRIL possui várias vantagens sobre outros métodos de ultra-estruturais imunomarcação. Em primeiro lugar, as proteínas são facilmente acessíveis aos anticorpos que aumentam a sensibilidade. Em segundo lugar, a exposição de grande porção de especializações da membrana plasmática, tal como a membrana pós-sináptica, sobre a superfície bidimensional da réplica permite a inspecção da distribuição espacial e de contiguidade física de moléculas de interesse sem reconstrução laborioso e demorado de seriseções al ultrafinos. Em terceiro lugar, a disponibilidade de ambas as metades da membrana plasmática aumenta o número de proteínas que podem ser marcados para cada estrutura individual, anticorpos adequados fornecidos estão disponíveis. Após a fractura, a face hidrofóbica da membrana de separação é revestida com carbono-platina que entrenches domínios de proteína restantes na superfície fracturada. Isso impede o acesso dos anticorpos aos antigénios nestes domínios. Por exemplo no P-face de uma réplica apenas epitopos de frente para o espaço protoplásmica pode ser detectada por anticorpos, ao passo que na E-cara somente epítopos de frente para o espaço exoplasmic pode ser ligado por anticorpos (ver Figura 2). Por outro lado, a técnica FRIL também sofre de algumas limitações 2. Como as fraturas ocorrem aleatoriamente, pode ser difícil de atingir as células ou estruturas específicas. Isto pode também conduzir a um desequilíbrio da amostragem, por exemplo, na recolha de sinapse, tendo em conta a probabilidade de diferentes fracturing ao longo da membrana de estruturas com curvatura diferente (por exemplo, espinhas contra eixos). Além disso, a atribuição de proteínas de membrana a uma das duas faces é imprevisível. Por conseguinte, a distribuição de uma proteína com a P-face ou E-face, em particular para estudos quantitativos, devem ser cuidadosamente examinadas utilizando anticorpos reactivos com os domínios intracelulares e extracelulares. Finalmente, a identificação na réplica de certas estruturas, tais como terminais de axónios pré-sinápticos, pode ser difícil quando baseado apenas nas características morfológicas. No entanto, a utilização de anticorpos específicos para proteínas marcadoras ou a transdução de proteínas de membrana integrais etiquetadas ou canais que utilizam vectores virais oferece ferramentas adicionais para facilitar a identificação das membranas fracturados. Por exemplo, este estudo aproveitou a transdução de ChR2-YFP nos neurônios do tálamo para identificar seus eferentes axonal na amígdala ou a rotulagem para os receptores μ-opióides para revelar me pós-sinápticambranes de neurônios ITC. A fim de executar a técnica FRIL com sucesso, um cuidado especial deve ser tomado a respeito fixação do tecido. fixação do tecido forte (&gt; 2% paraformaldeído) pode resultar numa elevada taxa de fracturas transversais e uma diminuição na sensibilidade rotulagem. Por outro lado, as fixações fracos tornar o manuseamento e preparação do tecido (por exemplo, o corte de secções) difícil. Também é importante para controlar a espessura dos blocos aparadas corresponde à espessura da fita de dupla face. Se a espessura da amostra é menor do que a da fita, as superfícies do tecido não pode anexar à superfície dos dois transportadores de metal, consequentemente, a amostra congelada não se fracturou. Se o tecido é mais espesso, ele vai ser comprimido com distorções estruturais inevitáveis ​​quando a sanduíche dos dois suportes de cobre é feito. A temperatura à qual a amostra é fraturado (neste protocolo, -115 ° C) desempenha também um papel importantena estrutura da réplica. Temperaturas mais elevadas podem produzir um aumento da taxa de artefactos, tais como a condensação de vapor de água na superfície do tecido antes ou durante a evaporação. Temperaturas mais baixas (&lt;-125 ° C), podem aumentar o risco de cisão de material durante a fracturação. Este material pode cair sobre a superfície do espécime ou ficar ligado a ela. Estes flocos de material também são revestidos e contrastados produzindo manchas escuras na imagem. Fraturando a temperaturas mais baixas também pode afetar a frequência de cruzamento de fraturas especialmente para as pequenas estruturas finas como espinhas dendríticas. Um outro passo crucial na preparação das réplicas é a detergente-digestão. Se a digestão é incompleta, o tecido não digerido aparece como manchas escuras na réplica, confundindo a análise da estrutura ao MET. Além disso, o tecido não digerido pode anticorpos armadilha ou ligar não especificamente, aumentando a rotulagem de fundo. Por outro lado, o uso de detergentes para a digestão de tecido pode desnaturar as moléculas associadas à réplica de alterar as suas estruturas secundária e terciária. Portanto, para certos antigénios, pode ser necessário diluir gradualmente a concentração de SDS com passos de lavagem adicionais. Para imunomarcação, a disponibilidade de diferentes tamanhos de partículas de ouro conjugadas com anticorpos secundários permite detectar, ao mesmo tempo, mas apenas qualitativamente, proteínas múltiplas, mesmo em microdomínios específicos da membrana do plasma, tais como a especialização pós-sináptica. No entanto, devido a impedimento estereoquímico, estudos quantitativos são geralmente limitados para a detecção de apenas uma molécula. O tamanho da partícula de ouro, também pode afectar a eficácia de rotulagem. Para a interpretação da rotulagem em FRIL, deve-se ter em mente que a partícula imuno pode ser localizado em qualquer lugar dentro de um hemisfério com um raio de 20-25 nm do antigénio devido à forma complexa flexíveled pelo anticorpo primário e secundário 26. Para mais informações sobre a teoria e prática da FRIL e técnicas relacionadas, nós nos referimos o leitor também a outros artigos metodológicos 27, 28. A técnica FRIL foi recentemente usada para a alta resolução de análises quantitativas de localização do receptor de glutamato em diversas populações sinapse 29, 30. Além disso, a sensibilidade de detecção da técnica FRIL para AMPA-R foi estimada tão elevada como uma partícula imuno por uma AMPA funcional canal -R 29. Assim, esta abordagem é em geral muito útil para quantificar e analisar o padrão de expressão pós-sináptico de AMPA e NMDA-Rs-Rs em sinapses centrais. Aqui, nós demonstramos a sua aplicabilidade nas sinapses PIN / MGN-ITC, um local mais provável importante para veicular a US informações durante o condicionamento do medo. Usando um anticorpo produzido contra os resíduos de aminoácidos extracelulares altamente conservadas das subunidades do receptor de AMPA GluA1-GluA4, encontramos uma distribuição uniforme de partículas de ouro nos pólos de IMP correspondentes a especializações membrana pós-sináptica. A densidade de AMPA-Rs em espinhas ITC foi significativamente maior em comparação com sinapses eixo alvo de PIN / MGN aferentes tálamo. Em ambas as coluna e eixo sinapses, foi detectada uma correlação positiva entre a rotulagem de AMPA-Rs e área de pós-sináptico, uma característica comum a outras sinapses glutamatérgicas 25. A baixa variação na densidade de AMPA-Rs no sinapses PIN / MGN-ITC indica uma distribuição homogênea semelhante a outras sinapses formadas por eferentes tálamo 7, mas diferente de sinapses corticais 25. Por outro lado, a densidade de NMDA-R foi mais variável e não diferiu entre coluna e eixo sinapses sugerindo uma regulação diferente do que AMPA-Rs. No futuro, a elevada reprodutibilidade da técnica FRIL não só irá permitir a avaliação da composição molecular basal de sinapses centrais, mas pode facilitar a detecção de cHanges em número de receptores ionotrópicos de glutamato e distribuição subsináptica Depois de aprender o medo, complementando ex-vivo gravações de propriedades de pré e pós-sinápticos desses insumos. Em conclusão, esta abordagem poderia ser utilizado por outros investigadores para obter insights sobre relações estrutura-função de sinapses excitatórias específicos de entrada em muitos outros circuitos neurais em que desembaraçar a origem das entradas e da natureza e composição de elementos pós-sinápticos é fundamental, mas problemático .

A definição da arquitectura funcional das biomembranas à escala nanométrica foi contestada nos últimos anos com o desenvolvimento de um número de técnicas de imunomarcação adequados para microscopia electrónica de transmissão. No entanto, estas técnicas, por exemplo, pré e imuno-incorporação de pós, têm um certo número de limitações importantes, que incluem pobre detecção de antigénios e / ou avaliação quantitativa limitado de proteínas ligadas à membrana. Estas limitações tornam-se particularmente crítico na investigação da estrutura fina do sistema nervoso, que é caracterizada por um elevado grau de diversidade e heterogeneidade celular sinapse. Esta heterogeneidade resultados de diversidade estrutural e funcional ditada pelos elementos pré- e pós-sinápticos e pela expressão diferencial, enriquecimento, ou a interacção de proteínas de sinalização, tais como receptores, transportadores, e moléculas efectoras. Uma nova abordagem para immunolabe diretaling de proteínas de membrana integrais ou reticuladas em réplicas de fractura por congelação de detergente solubilizado (FRIL) foi originalmente introduzido pela Fujimoto há duas décadas 1. Este método original tinha, no entanto, várias limitações, ou seja, a fragmentação grave de réplicas, o que dificultava correlações significativas de moléculas marcadas com células mapeadas individualmente em tecidos complexos como o cérebro. Cerca de 10 anos atrás, Shigemoto e Fukazawa melhorou progressivamente a técnica 2. Esta foi acompanhada por esforços de outro grupo de cientistas dos laboratórios de Boulder da Universidade Estadual do Colorado, que também melhorou significativamente a técnica, em particular para o estudo das junções comunicantes 3. A melhoria em protocolos de congelação-fractura e máquinas, bem como a introdução de congelação rápida (sob alta pressão), permite agora que os investigadores para produzir réplicas ininterrupta de espécimes de tamanho relativamente grande e oiimagens de qualidade gh da maioria dos componentes celulares sem as limitações e artefatos produzidos por fortes fixações químicas. A técnica FRIL oferece a grande vantagem de uma altamente quantitativa na identificação in situ de um ou mais proteínas (simultaneamente) em histologicamente mapeadas e identificadas células citologicamente dentro dos tecidos complexos, tais como o cérebro, com a vantagem adicional de uma vista plana de pré- e pós-sináptico elementos em uma única réplica. Portanto, a técnica FRIL, apesar das suas muitas dificuldades técnicas, mantém a promessa de uma série de avanços científicos muito significativos, particularmente para a correlação de propriedades estruturais e funcionais de sinapses individuais. Durante as últimas décadas, uma grande quantidade de informações foi obtida sobre a estrutura, fazer molecular, e função fisiológica das sinapses; ainda sinapses são morfologicamente e molecularmente muito diverso, dependendo do pa pré e pós-sinápticaaluguer neurônios 4. Apenas por um punhado de tipos de sinapses eram estudos de estrutura-função feito até agora 5-7. Este foi principalmente devido a condicionalismos técnicos que impediram uma identificação precisa da natureza dos elementos pré e pós-sinápticos. A análise ultra forneceu insights críticos sobre a variabilidade das especializações membrana pós-sináptica através de contatos sinápticos distintas, tanto em termos de tamanho sináptica e conteúdo em receptores de neurotransmissores 6, que tem um grande impacto sobre a força e a plasticidade da transmissão sináptica. Além disso, um grande corpo de pesquisa indica que o número de receptores de glutamato ionotrópicos expressos em diferentes tipos de sinapse é regulado de forma afferent- e meta-dependentes 7-10. Aqui, um método é descrito que permite a análise da composição e estrutura do receptor da membrana pós-sináptica com especializações definirelementos pré-sinápticos d e função. Esta abordagem toma vantagem da expressão de pré-sináptica de proteínas sensíveis à luz recentemente desenvolvidos de algas, tais como Channelrhodopsin2 (ChR2), e da técnica FRIL para analisar o padrão de expressão pós-sináptico de α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico ácido (AMPA-R) e N-metil-D-aspartato (NMDA-R) de receptores de glutamato. Isto é demonstrado nas sinapses formadas por axônios provenientes dos posteriores núcleos geniculados tálamo-mediais (PIN / MGN) em neurônios das massas de células intercaladas do amígdala (ITC). Neurónios ITC são células GABAérgicos espinhosas pequenas organizadas em aglomerados em torno do complexo amigdalóide basolateral (BLA) 11, 12. Neurónios ITC são conhecidos para receber entradas excitatórios de BLA principais neurónios e para atingir o núcleo central (CEA), funcionando, assim, como um portão inibidora para o fluxo de informações entre o BLA e CeA 12-15. Recentemente, foi demonstrado que TINeurônios C localizados no cluster medio-dorsal entre BLA e CeA também recebem inputs excitatórios diretos e convergente de regiões corticais do tálamo e temporais sensoriais, que são modificados no medo aprendizado durante pavloviano auditivo medo condicionado 16. O condicionamento do medo é uma das formas mais bem compreendidos de aprendizagem associativa em termos de mecanismos cerebrais. Com medo condicionado, um estímulo condicionado inicialmente neutro (CS, por exemplo, um tom) está emparelhado com um estímulo aversivo incondicionado (US, por exemplo, um choque pé leve), resultando em uma associação CS-US e resposta de medo 17, 18 condicionado. Excitatórios entradas a partir de ambas as áreas do tálamo e neocorticais, que transportam informação que representa o CS e dos Estados Unidos, respectivamente, eram conhecidos por convergem para neurónios piramidais do núcleo lateral da amígdala (LA) e se submeter a plasticidade 19. Nosso trabalho anterior revelou que a informação entrada sensorial é também em paralelo retransmitida para os neurônios ITC <s-se&gt; 16. Como um primeiro passo para uma análise molecular mecanicista da entrada sensorial indivíduo sinapses em neurônios ITC, foi utilizado um vírus adeno-associado (AAV) para expressar ChR2 marcada com a proteína fluorescente amarela (YFP). O AAV foi injectado no PIN / MGN e os terminais de axónios foram identificados pela sua expressão de ChR2-YFP. Usamos ambas as faces geradas pela técnica FRIL para avaliar a densidade de pós-sinápticos AMPA-Rs e NMDA-R nas sinapses formados com ITC neurônios por terminais do axônio PIN / MGN.

<table><tbody><tr><td>Surgery</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxi frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>pode ser substituído por outro quadro estereotáxico para camundongos</td></tr><tr><td>Adaptador de mouse de quadro estereotáxico</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Máscara de anestesia a gás para camundongos</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>não está mais disponível, substituído pelo item nº 51609M</td></tr><tr><td>Dispositivo de injeção de pressão, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, EUA</td><td>T25-2-900</td><td>outros dispositivos de injeção de pressão (por exemplo, Picospritzer) podem ser usados</td></tr><tr><td>Kwik Fill capilares de vidro</td><td>World Precision Instruments, Alemanha</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Alemanha</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura DC e almofada de aquecimento</td><td>FHC, EUA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta horizontal Modelo P-1000</td><td>Sutter Instruments, EUA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de ferramentas cirúrgicas, Esterilizador 75</td><td>Melag, Alemanha</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (sorotipo 2/9)</td><td>Penn Vector Core, EUA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Alemanha</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Anestésico Isoflurano, Isofurano CP (1 ml/ml)</td><td>CP Pharma, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-séptico, Betadine (iodo-providona)</td><td>Purdure Products, EUA</td><td>BSOL32</td><td>pode ser substituído por outros desinfetantes</td></tr><tr><td>Analgésico, Metacam Solução (5 mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Alemanha</td><td></td><td>pode ser substituído por outros analgésicos</td></tr><tr><td>Pomada para os olhos Bepanthen</td><td>Bayer, Alemanha</td><td>0191</td><td>pode ser substituído por outras pomadas para os olhos</td></tr><tr><td>Broca NM3000 (SNKG1341 e SNIH1681)</td><td>Nouvag, Suíça</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Suture Needle Fine</td><td>Science Tools, Alemanha</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de seda trançada</td><td>Fine Science Tools, Alemanha</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Preparação de tecidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído EM grau</td><td>Agar Scientific Ltd., Reino Unido</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>Solução saturada de ácido pícrico</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H20</td><td>Merck Millipore, Alemanha</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-2H2O&nbsp;</td><td>Merck Millipore, Alemanha</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, Alemanha</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, Alemanha</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental</td><td>Sandoz, Áustria</td><td>5.133</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de água ultrapura GenPure</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td></td><td></td>50131235</tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>ISMATEC, Alemanha</td><td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td>Papel</td><td>de filtro MACHEREY-NAGEL, Alemanha</td><td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer, VT1000S</td><td>Leica Microsystems, Áustria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturi oftálmico</td><td>Alcon Laboratories, EUA</td><td></td><td>pode ser substituído por outros bisturis oftálmicos</td></tr><tr><td>Cânula de perfusão</td><td>Vieweg, Alemanha</td><td>F560088-1</td><td>pode ser substituído por itens semelhantes de outras empresas</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>High-pressure&nbsp; Congelamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transportadores de cobre Escritório de</td><td>Engenharia M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol Polish</td><td>Henkel, Alemanha</td><td></td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Pele de camurça</td><td>Loja</td><td></td><td></td>de artigos domésticos</tr><tr><td>Perfurador, 1,5mm</td><td>Stubai, Áustria</td><td></td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Etanol desnaturado</td><td>Donauchem, Áustria</td><td></td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Roth, Alemanha</td><td>9372.5</td><td>ATENÇÃO!</td></tr><tr><td>Máquina de congelamento de alta pressão HPM 010</td><td>BalTec, CH; agora Leica Microsystems</td><td>HPM010</td><td>não é mais produzido, substituído por LeicaEM HPM100</td></tr><tr><td>Stereo-microscópio</td><td>Olympus, Japão</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio</td><td></td><td></td> líquido <td>CUIDADO!</td></tr><tr><td>Frascos criogênicos</td><td>Roth, Alemanha</td><td>E309.1</td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>CryoCane</td><td>Nalge Nunc International, EUA</td><td>5015-0001</td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International, EUA</td><td>5016-0001</td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido</td><td>Cryopal, França</td><td>GT38</td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Detergente não iônico (Lavocid)</td><td>Werner & Mertz Professional, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Congelamento-fratura e Replicação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten & Kettenbaum, Alemanha</td><td>SANDURET 2-K</td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Siliciumcarbid SIC 360, tamanho de grão 25 - 21&micro;</td><td>PIADA: Joisten & Kettenbaum, Alemanha</td><td>955932</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de fratura por congelamento BAF 060</td><td>BalTec, CH; agora Leica Microsystems</td><td>BAF060</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cerâmica de 12 poços</td><td>Gr&ouml; pel, Áustria</td><td>14511</td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA, EUA</td><td>T1503</td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Cloridrato de Trizma</td><td>SIGMA, EUA</td><td>T3253</td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Merck, Alemanha</td><td>1,064,041,000</td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>SDS, Lauril sulfato de sódio</td><td>Roth, Alemanha</td><td>5136.1</td><td>CUIDADO! ; &nbsp; pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck, Alemanha</td><td>1,076,871,000</td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Alemanha</td><td>5429.3</td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Pasta de Forno de Hibridização Universal</td><td>, Alemanha</td><td>7001-0050</td><td>pode ser substituída pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Immunolabelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA, USA</td><td>A9647</td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Sondas moleculares</td><td>de anticorpos anti-GFP</td>, EUA <td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-pan-AMPAR</td><td>Frontier Institute, Japão</td><td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NMDAR1 Anticorpo, clone 54.1</td><td>Merck Millipore, Alemanha</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Opioid Receptor-Mu (MOR)</td><td>ImmunoStar, EUA</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>EM cabra anti-cobaia, 5 nm; anticorpo secundário</td><td>BBInternational, Reino Unido</td><td>EM. GAG5</td><td></td></tr><tr><td>EM anti-coelho de cabra, 15 nm; anticorpo secundário</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM. GAR15</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-coelho, 10nm, anticorpo secundário</td><td>AURION, Holanda</td><td>DAR 10nm</td><td></td></tr><tr><td>Grades de cobre, 100 Barras paralelas</td><td>&nbsp; Agar scientific, UK</td><td>G2012C</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Major Science, USA</td><td>MO-RC</td><td>pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Pioloform Powder</td><td>&nbsp; Agar scientific, Reino Unido</td><td>R1275</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Roth, Alemanha</td><td>3313.1</td><td>CUIDADO! ; &nbsp; pode ser substituído pelo mesmo item de outras empresas</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>EM analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM120 TEM</td><td>Philips/FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morada CCD camera</td><td>Soft Imaging Systems, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTEM Ver. 5.2, software de imagem</td><td>Soft Imaging Systems, Alemanha</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combinado optogenética e freeze-fratura replica imunomarcação para examinar arranjo específicos de entrada de glutamato receptores no mouse amygdala

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

microscopia eletrônica de fractura por congelação tem sido uma técnica importante na investigação ultra-estrutural há mais de 40 anos. No entanto, a falta de meios eficazes para estudar a composição molecular de membranas produzido um declínio significativo na sua utilização. Recentemente, tem havido um grande avivamento em freeze-fratura de microscopia electrónica graças ao desenvolvimento de formas eficazes para revelar proteínas de membrana integrais através de uma rotulagem immunogold. Um destes métodos é conhecido como detergente solubilizado de fractura por congelação de réplica de imunomarcação (FRIL). A combinação da técnica FRIL com Optogenetics permite uma análise correlacionada dos propriedades estruturais e funcionais de sinapses centrais. Usando esta abordagem, é possível identificar e caracterizar os neurónios tanto pré e pós-sinápticos, por sua respectiva expressão de um channelrodopsina marcados e marcadores moleculares específicos. A aparência distinta da especialização membrana pós-sináptica da Glutamatérgicos sinapses ainda permite que, mediante a rotulagem dos receptores de glutamato ionotrópicos, quantificar e analisar a distribuição intrasynaptic desses receptores. Aqui, damos uma descrição passo-a-passo dos procedimentos necessários para preparar réplicas emparelhados e como immunolabel eles. Também vamos discutir as advertências e limitações da técnica FRIL, em particular aqueles associados com potenciais vieses de amostragem. A elevada reprodutibilidade e versatilidade da técnica FRIL, quando combinado com Optogenetics, oferece uma abordagem poderosa para a caracterização de diferentes aspectos da transmissão sináptica no microcircuitos identificados neuronais no cérebro. Aqui, nós fornecemos um exemplo de como esta abordagem foi utilizada para obter insights sobre relações estrutura-função de sinapses excitatórias em neurônios das massas de células intercaladas do amygdala mouse. Em particular, foi investigada a expressão de receptores de glutamato ionotrópicos nas entradas ou identificadosiginated do intralaminar posterior do tálamo e núcleos geniculados mediais. Essas sinapses foram mostrados para retransmitir a informação sensorial relevante para a aprendizagem medo e se submeter a mudanças plásticas no medo condicionado.

A técnica FRIL, quando combinado com a expressão de actuadores optogenetic de origem microbiana 21, isto é, canais integrados na membrana do plasma e eficazmente transportadas anterogradamente ao longo dos axónios, permite analisar quantitativamente a expressão pós-sináptico de AMPA-R e NMDA-R em um subgrupo definido de sinapses. Isso é mostrado aqui para axônios provenientes de núcleos do tálamo distintas (por exemplo, PIN / MGN) em neurônios ITC na amígdala. Esta abordagem permite uma análise molecular das sinapses de entrada sensoriais individuais em neurônios ITC, um grupo de células que tenham sido refratários a uma caracterização anatômica e molecular detalhada até agora. Quatro semanas após a injeção estereotáxica do rAAV-ChR2-YFP para o PIN / MGN, os axônios ChR2-YFP positivas densamente inervados do LA, área de transição amygdalostriatal (Astria) eo paracapsular medial I<html> Aglomerado TC na amígdala, um padrão totalmente coerente com o rastreamento de estudos anteriores 16, 22. Nós também detectou ouro intensa imunomarcação para o ChR2-YFP na P-face de axônios e terminais em réplica de fractura por congelação de rAAV-ChR2-YFP- ratinhos injectados (Figura 5A), mas não em réplicas a partir de ratinhos não injectados. A especialização da membrana pós-sináptica das sinapses glutamatérgicas na uma réplica pode ser observado como um aglomerado de partículas intramembranar (PIM) na E-face da membrana de plasma 2, 23, e é muitas vezes acompanhada pela P-face da sua membrana plasmática pré-sináptica 7 (Figura 5B-C). Esses recursos permitiram identificar a especialização pós-sináptico das sinapses glutamatérgicas formadas por terminais do axônio PIN / MGN (Figura 5 e 6). Nós marcado AMPA-R com um anticorpo que reconhece todas as quatro subunidades (GluA1-4), enquanto NMDA-R foram detectadas utilizando um anticorpo contra a subunidade NR1 essencial. ntent &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Por causa da falta de ferramentas para detectar na mesma réplica se essas sinapses foram feitas com espinhas dendríticas ou veios de neurônios ITC, que classificou o rosto réplica correspondente para μ -opiáceos, como os neurónios pós-sinapticamente ITC expressam altos níveis desses receptores 24. Isto exigiu a identificação dos mesmos perfis de pós-sinápticos nas duas réplicas (Figura 5C-F e Figura 6A-D), usando uma estratégia que utiliza pontos de referência (Figura 4E) . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> Figura 5. Detecção de ChR2-YFP e glutamato ionotrópicos receptores na réplica por imuno partículas. (A) Um terminal axonal transversal fracturado (azul-claro) e pequenas porções de P sua face marcado com partículas de ouro de 15 nm de detecção ChR2-YFP. Dentro do terminal, a membrana óf numerosas vesículas sinápticas pode ser observado (SV). Note-se a especificidade da imunomarcação em grande parte restrita para a membrana plasmática. Rotulagem para ChR2 identifica o terminal como originários do PIN / MGN. O terminal forma uma sinapse assimétrica com uma espinha. A especialização membrana pós-sináptica (PSD) no E-face mostra um conjunto característico de partículas intramembranar e é marcado com partículas de 5 nm de ouro revelando AMPA-Rs. (B) O P-face de um axónio ChR2-expressando (marcado com partículas de ouro de 15 nm) é mostrado na fronteira com dois dendritos, uma delas possuindo duas PSDs marcados com partículas de 5 nm de ouro revelando NMDA-R. (CD) faces opostas das membranas pré e pós-sinápticos de uma sinapse PIN / MGN-ITC. (C) O P-face do terminal expressa ChR2 (marcado com partículas de ouro de 15 nm) e estende-se sobre o E-face de dois veios dendríticas, um deles contendo dois PSDs rotulados para AMPA-R (5 partículas nm de ouro). ( <strong&gt; D) O correspondente P-face das duas dendrites é rotulada para receptores μ de opiáceos (10 nm de partículas de ouro). (EF) vistas ampliadas das áreas delineadas pelas linhas tracejadas. Barras de escala:. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Imunopartulas para AMPA-Rs nas sinapses PIN / MGN-ITC foram encontrados em todo o cluster IMP, sugerindo uma distribuição homogênea dentro da especialização pós-sináptica (Figura 5E). Um significativamente maior (teste t não emparelhado p &lt;0,018), foi observado densidade de marcação AMPA-R em PIN / MGN sinapses sobre as espinhas ITC (715 ± 38 partículas de ouro / uM 2, n = 32) comparado com sinapses Onto dendritos ITC (590 ± 44 partículas de ouro / uM 2, n = 32). Em geral, a densidade de AMPA-R no pino sinapses / MGN-ITC demonstrou uma relativamente baixavariância (coeficiente de variação, CV = 0,37) de acordo com uma distribuição homogénea. Imunopartulas para NMDA-R nas sinapses PIN / MGN-ITC foram frequentemente observados desigualmente distribuídos nos pólos de IMP pós-sinápticos (Figura 5B). A densidade de rotulagem NMDA-R foi semelhante (teste t não pareado p = 0,39) entre PIN / MGN sinapses em espinhas ITC (1070 ± 153 partículas de ouro / ^ m 2, n = 8) e dendritos ITC (812 ± 183 partículas de ouro / 2 uM, n = 9). Ao contrário do que foi observado para AMPA-Rs, a densidade de NMDA-R no pino sinapses / MGN-ITC foi altamente variável (CV = 0,54). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> Figura 6. AMPA-Rs e NMDA-Rs imunomarcação em Identificados sinapses PIN / MGN-ITC. (AB) faces opostas das membranas pré e pós-sinápticos de um pino / MGN-ITCsinapse feita em uma espinha dendrítica em que o P-face do terminal expressa ChR2 (rotulado com 15 partículas de ouro nm) e do PSD para uma espinha dendrítica é rotulado de AMPA-Rs (5 partículas nm de ouro). (CD) vistas ampliadas das áreas descritas pela linha tracejada. Estas áreas foram rodados cerca de 45 ° esquerda para permitir uma melhor visualização do PSD. (E) Scatterplots do número de partículas de AMPA-R em comparação com a área de sináptica nas espinhas e dendritos ITC. Em ambas as estruturas, uma correlação positiva foi observada. (F) Scatterplots do número de partículas de NMDA-R contra a área sináptica nas espinhas e dendritos ITC. Uma correlação positiva significativa foi detectada apenas em espinhas dendríticas. Barras de escala:. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Porqueo P-face da membrana plasmática pré-sináptica muitas vezes sobrepostos em parte do cluster IMP pós-sináptica, que se poderia calcular a área sináptica de apenas 30% das sinapses (espinhas: área média de 0,032 ^ M 2, gama: 0,007-0,063? M 2, n = 8; dendritos: 0,047? M 2, gama: 0,024 a 0,166 uM 2, n = 11). Estes foram em uma escala similar como anteriormente analisados ​​glutamatérgica telencefálico sinapses 25. Em ambas as espinhas e dendritos, o número de imunopartulas de ouro para AMPA-R em sinapses individuais foi positivamente correlacionada com a área sináptica (Spearman, espinhas: r = 0,88, dendritos: r = 0,60, p &lt;0,0001) (Figura 6E). Por outro lado, o número de imunopartulas ouro para NMDA-R foi encontrada uma correlação com a área sináptica nas espinhas (Spearman, espinhas: r = 0,90, p &lt;0,002), mas não em dendritos (r = 0,21, p = 0,29) (Figura 6F ).

Este artigo ilustra como a expressão de receptores de neurotransmissores pode ser quantificada e o padrão analisado em sinapses com elementos pré e pós-sinápticos identificados usando uma combinação de transdução viral de ferramentas optogenéticas e a técnica de imunomarcação de réplica de fratura por congelamento.

Combinado optogenética e Freeze-fratura Replica imunomarcação para examinar Arranjo específicos de entrada de glutamato receptores no mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

O objetivo deste procedimento, que combina optogenética com a técnica de imunomarcação em réplicas de fratura congelada, é analisar a densidade de receptores ionotrópicos de glutamato em sinapses na amígdala de camundongo, com elementos pré e pós-sinápticos identificados. A alta reprodutibilidade e versatilidade dessa técnica de imunomarcação em réplicas de fratura congelada, quando combinada com optogenética, oferece uma abordagem muito poderosa para a análise correlacionada das propriedades estruturais e funcionais das sinapses. As principais vantagens deste procedimento são: a visão planar dos elementos pré e pós-sinápticos e a análise quantitativa de proteínas nesses microdomínios especializados.Pode-se adaptar diferentes técnicas a uma variedade de tecidos distintos para estudar a distribuição e a organização de proteínas integrais de membrana. Geralmente, essa abordagem combinada de FRIL optogenético é desafiadora para iniciantes devido à grande variedade de aparelhos e máquinas necessários. Iniciar a modulação com um método diferente é essencial, pois alguns outros passos são difíceis de aprender.Como fraturamento e replicação de espécimes congelados. Para iniciar este procedimento, cole um bloco coronal do cérebro de camundongo no suporte do microtomador vibratório. Oriente o bloco de tecido de modo que o neocórtex fique voltado para a lâmina vibratória. Em seguida, corte as secções coronais contendo a amígdala com espessura de 140 micrômetros em PB gelado 0,1 molar. E colete-as em uma placa de seis poços contendo o mesmo tampão.Sob um microscópio estereoscópico, recorte a região de interesse dos cortes em uma placa de Petri revestida com elastômero de silicone e preenchida com PB 0,1 molar. Em seguida, transfira o bloco recortado para a solução de crioproteção e mantenha-o durante a noite a seis graus Celsius. Nesta etapa, prepare os portadores de cobre para uso nas etapas subsequentes do procedimento FRIL, polindo-os com um pedaço de camurça como removedor de oxidação. Sob o microscópio, fixe um anel de fita dupla face ao portador de cobre, que servirá como poço de retenção para o bloco recortado.Em seguida, coloque o bloco aparado no orifício da fita dupla face usando uma alça de platina. Remova a solução de crioprotetor em excesso utilizando papel filtro ou um pincel. Posteriormente, cubra o suporte de fixação com outro suporte.De modo que o bloco de tecido fique sanduichado entre os dois suportes. Para congelar a amostra, insira o sanduíche de suportes no porta-amostras. Posteriormente, insira o porta-amostras na unidade de congelamento por alta pressão.Inicie o ciclo de congelamento pressionando o botão jet-auto, remova imediatamente o suporte do espécime e submerja a ponta em uma caixa isolada com nitrogênio líquido. Em seguida, remova cuidadosamente o "sanduíche" do portador do suporte do espécime e coloque-o em um criotubo previamente resfriado. Armazene os criotubos contendo os portadores em um criotanque até a replicação.Antes de inserir a pistola de feixe de elétrons, remova o escudo com a placa defletora. Coloque o calibrador de ajuste, para centralizar o filamento, na mandíbula do porta-mandril através da tampa inferior do cátodo. Em seguida, deslize o novo filamento sobre o calibrador, até que as lâminas de pressão fixem as extremidades do filamento.Em seguida, remova o calibrador de ajuste e insira a haste de carbono. Fixe-a apertando o mandril do suporte da haste do evaporador, garantindo que a altura da extremidade da haste esteja no centro da segunda bobina a partir da base.Em seguida, substitua a placa defletora e insira a pistola de feixe de elétrons na unidade de fratura por congelamento. Neste procedimento, ajuste a corrente e a tensão para a evaporação. Em seguida, insira o sanduíche congelado do portador na mesa de réplica dupla em nitrogênio líquido.Em seguida, transfira a mesa de dupla réplica para o vaso de Dewar e fixe-a ao receptor da platina do espécime em um ângulo de 45 graus. Pegue a mesa de dupla réplica com um manipulador de mesa. Insira-a na unidade de fratura por congelamento sobre a platina fria e aguarde aproximadamente 20 minutos para permitir que a temperatura da mesa de dupla réplica se ajuste a menos 115 graus Celsius.Em seguida, frature o tecido girando a roda manualmente no sentido anti-horário, que está conectada à cobertura acima da mesa de dupla réplica. Quando a cobertura gira, ela força a abertura da mesa de dupla réplica, resultando na fratura do tecido. Uma camada de carbono é aplicada nas faces fraturadas a um ângulo de 90 graus.Posteriormente, remova os espécimes replicados da mesa de dupla réplica e transfira-os para uma placa cerâmica de 12 poços preenchida com TBS. Usando uma haste de fio de platina, remova o tecido replicado do porta-espécimes. Para a digestão com SDS, transfira uma réplica para um frasco de vidro de quatro mililitros contendo um mililitro de tampão de digestão com SDS.Deixe digerir por 18 horas a 80 graus Celsius com agitação. Para imunomarcação, lave a réplica por 10 minutos em tampão de digestão SDS fresco. Em seguida, incube-a com anticorpos primários e secundários, diluídos em TBS com 2% de BSA, em câmara úmida a 15 graus Celsius por 24 a 72 horas.Em seguida, monte a réplica em uma grade paralela de 100 linhas revestida com filme de Parafilm. Obtenha a imagem da réplica com um microscópio eletrônico de transmissão a 80 ou 100 quilovolts. Depois, adquira as imagens digitais por meio de uma câmera CCD.Quando estiver offline, localize as regiões correspondentes na imagem a partir da réplica, utilizando diferentes marcos referenciais. Quatro semanas após a injeção de AAV, para expressar a Channelrhodopsina-2 no grupo nuclear tálamico posterior, a Channelrhodopsina-2 é efetivamente transportada anterogradamente ao longo dos axônios talâmicos até alcançar as massas celulares intercaladas da amígdala. A especialização pós-sináptica das sinapses glutamatérgicas pode ser reconhecida em uma réplica como um aglomerado de partículas intramembranares na face E da membrana plasmática, e frequentemente é acompanhada pela face P do seu elemento pré-sináptico.Aqui, a canalrodpopsina-2 e os receptores de glutamato foram visualizados usando partículas de ouro de diferentes tamanhos conjugadas aos anticorpos secundários. Devido à falta de ferramentas estruturais ou moleculares para detectar na mesma réplica se a membrana pós-sináptica pertencia aos neurônios intercalados, a réplica correspondente foi marcada para receptores de opiáceos mu, um marcador para esses neurônios.Como exemplo da análise quantitativa da densidade de receptores de glutamato nessas sinapses, aqui estão os gráficos de dispersão do número de partículas de ouro para receptores AMPA em relação à área sináptica em espinhas e dendritos, que revelam uma correlação positiva em ambas as estruturas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os passos individuais são altamente interdependentes.Portanto, um erro em uma das etapas pode comprometer todo o procedimento. A visualização de uma grande porção das especializações da membrana plasmática sobre a superfície bidimensional da réplica permite a inspeção da distribuição espacial e da continuidade física das moléculas de interesse, sem a necessidade de reconstrução trabalhosa e demorada de cortes seriados de artrofina. Essa abordagem pode ser utilizada por outros pesquisadores para obter insights sobre as relações estrutura-função de sinapses específicas em circuitos neurais.Onde desembaraçar a origem das entradas e a natureza dos elementos pós-sinápticos é crucial, mas problemático.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um procedimento para analisar a conectividade sináptica entre o córtex pré-frontal medial (mPFC) e os neurônios da amígdala usando fatias agudas de cérebro de amígdala de camundongos. Os neurônios mPFC nesses camundongos expressam a canalrodopsina fundida a uma proteína fluorescente. As channelrodopsinas facilitam o influxo de íons e a geração de potencial de ação nos neurônios mPFC após a ativação da luz. Consequentemente, os neurônios mPFC liberam neurotransmissores que...

Visualização e mapeamento de vias neuronais em uma fatia de cérebro de amígdala

Fonte: Schönherr, S., et. al. Imunomarcação Combinada de Réplica Optogenética e de Fratura por Congelamento para Examinar o Arranjo Específico de Entrada de Receptores de Glutamato na Amígdala de Camundongo. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a imunomarcação de réplicas fraturadas por congelamento de tecido cerebral de camundongo para microscopia eletrônica. As réplicas fraturadas e revestidas são digeridas para expor os receptores. Anticorpos primários e secundários marcados com ouro são...

Imunomarcação de proteínas da membrana neuronal em uma amostra fraturada por congelamento de tecido cerebral de camundongo

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados. J. Vis. Exp.Exp..  (2022) Este vídeo mostra um procedimento de microscopia de dois fótons para imagem da atividade neuronal e da dinâmica microglial em um camundongo acordado durante a estimulação visual, destacando transientes de cálcio e interações celulares.

Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em um camundongo acordado

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

abordagens optogenética são amplamente utilizados para manipular a atividade neural e avaliar as consequências para o funcionamento do cérebro. Aqui, uma técnica que é descrita por expressão in vivo do activador channelrodopsina óptico, permite a análise ex vivo de propriedades sinápticos de longo alcance específico e conexões neurais locais em circuitos relacionados com o medo.

Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho sobre como combinar artificial microRNA mediada por RNA interferência com optogenetics para estimular especificamente pré-sináptica boutons com reduzida expressão de genes seletiva dentro de circuitos neuronais intactos.

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

Este trabalho apresenta um método para executar uma optogenetic unidade única gravação confiável de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida.

Identificação de Optogenetics de um tipo Neuronal com um Optrode de vidro em ratos acordados

Apresentamos um protocolo para avaliar o equilíbrio entre liberação de glutamato e liberação em sinapses glutamatergicas corticostriatais únicas em fatias agudas de camundongos adultos. Este protocolo usa o sensor fluorescente iGluu para detecção de glutamato, uma câmera sCMOS para aquisição de sinal e um dispositivo para iluminação a laser focal.

Indicadores únicos de sinapse de liberação de glutamato e absorção em fatias cerebrais agudas de ratos normais e huntington

Com a manipulação optogenética de populações neuronais específicas ou regiões cerebrais, o comportamento pode ser modificado com alta resolução temporal e espacial em animais em movimento livre. Usando diferentes ferramentas optogenéticas em combinação com fibras ópticas cronicamente implantadas, uma variedade de modulações neuronais e testes comportamentais podem ser realizados.

Manipulação optogenética da atividade neuronal para modular o comportamento em camundongos em movimento livre

A imagem microendoscópica de cálcio in vivo é uma ferramenta inestimável que permite o monitoramento em tempo real das atividades neuronais em animais de comportamento livre. No entanto, aplicar essa técnica à amígdala tem sido difícil. Este protocolo visa fornecer uma diretriz útil para atingir com sucesso células de amígdala com um microscópio miniaturizado em camundongos.

Imagem de cálcio in vivo bem sucedida com um microscópio miniaturizado de head-mount na Amígdala do Rato Livremente Comportado

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

Aprenda a combinar optogenética com imunomarcação de réplicas de fratura por congelamento para analisar a densidade de receptores de glutamato em sinapses da amígdala de camundongo. Este método permite a análise quantitativa da organização molecular de circuitos neurais específicos com alta resolução.

Combinado optogenética e Freeze-fratura Replica imunomarcação para examinar Arranjo específicos de entrada de glutamato receptores no mouse Amygdala (Vídeo) | JoVE Journal

Combinado optogenética e Freeze-fratura Replica imunomarcação para examinar Arranjo específicos de entrada de glutamato receptores no mouse Amygdala

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