Combinado optogenética e Freeze-fratura Replica imunomarcação para examinar Arranjo específicos de entrada de glutamato receptores no mouse Amygdala

O objetivo deste procedimento, que combina optogenética com a técnica de imunomarcação de réplica de fratura por congelamento, é analisar a densidade de receptores ionotrópicos de glutamato em sinapses na amígdala de camundongo com elementos pré e pós-sinápticos identificados. A alta reprodutibilidade e versatilidade dessa técnica de imunomarcação de réplica de fratura por congelamento, quando combinada com a optogenética, oferece uma abordagem muito poderosa para a análise correlacionada das propriedades estruturais e funcionais das sinapses. As principais vantagens deste procedimento são: a visão planar dos elementos pré e pós-sinápticos e a análise quantitativa de proteínas nesses microdomínios especializados.

Diferentes técnicas podem ser adaptadas a uma variedade de tecidos diferentes para estudar a distribuição e organização de proteínas integrais da membrana. Geralmente, essa abordagem optogenética combinada de FRIL é um desafio para iniciantes devido à grande variedade de diferentes aparelhos e máquinas necessários. Iniciar a modulação com um método diferente é fundamental, pois algumas outras etapas são difíceis de aprender.

Como fraturar e replicar amostras congeladas Para iniciar este procedimento, cole um bloco coronal de cérebro de camundongo no suporte do vibro-slicer. Oriente o bloco de tecido de forma que o neocórtex fique voltado para a lâmina vibratória. Em seguida, corte as seções coronais contendo a amígdala com uma espessura de 140 micrômetros em zero vírgula um molar, PB gelado. E colete-os em um prato de seis poços no mesmo buffer.

Sob um microscópio estereoscópico, corte a região de interesse das fatias, em uma placa de Petri revestida com elastômero de silicone e preenchida com PB molar de zero vírgula um. Em seguida, transfira o bloco aparado para a solução de crioproteção e mantenha durante a noite a seis graus Celsius. Nesta etapa, prepare os suportes de cobre para uso nas etapas sucessivas do procedimento FRIL, polindo-os com uma folha de pele falsa como removedor de manchas. Sob o microscópio, prenda um anel de fita dupla-face ao suporte de cobre, que servirá como poço de retenção para o bloco aparado.

Em seguida, coloque o bloco aparado no orifício da fita dupla-face usando um laço de fio de platina. Remova o excesso de solução crioprotetora usando um papel de filtro ou um pincel. Depois, cubra o transportador com outro transportador.

Para que o bloco de tecido seja imprensado entre os dois transportadores. Para congelar a amostra, insira o sanduíche transportador no suporte da amostra. Em seguida, insira o suporte da amostra na unidade de congelamento de alta pressão.

Inicie o ciclo de congelamento pressionando o botão jet-auto, remova o suporte da amostra imediatamente e mergulhe a ponta em uma caixa isolada com nitrogênio líquido. Em seguida, remova cuidadosamente o sanduíche transportador do suporte de amostra e coloque-o em um criovial pré-resfriado. Armazene os criotubos contendo os transportadores em um tanque criogênico até a replicação.

Antes de inserir a pistola de feixe de elétrons, remova a blindagem com a placa defletora. Coloque o medidor de ajuste, para centralizar o filamento, no mandril da pinça através da tampa do cátodo inferior. Em seguida, deslize o novo filamento sobre o medidor, até que as lâminas de pressão prendam as extremidades do filamento.

Em seguida, remova o medidor de configuração e insira a haste de carbono. Fixe-o, apertando o mandril da pinça do suporte da haste do evaporador. Garantir que a altura da extremidade da haste esteja no meio da segunda bobina a partir da parte inferior.

Depois disso, recoloque a placa defletora e insira a pistola de feixe de elétrons na unidade de fratura por congelamento. Neste procedimento, ajuste a corrente e a tensão para evaporação. Em seguida, insira o sanduíche transportador congelado na mesa de réplica dupla em nitrogênio líquido.

Em seguida, transfira a mesa de réplica dupla para o vaso Dewar e fixe-a no receptor do estágio de amostra em um ângulo de 45 graus. Pegue a tabela de réplica dupla com um manipulador de tabela. Insira-o na unidade de fratura por congelamento no estágio frio e aguarde aproximadamente 20 minutos para permitir que a temperatura da mesa de réplica dupla se ajuste para 115 graus Celsius negativos.

Depois, frature o tecido girando a roda no sentido anti-horário manualmente, que está conectada à cobertura acima da mesa de réplica dupla. Quando a mortalha gira, ela força a mesa de réplica dupla a se abrir, o que resulta na fratura do tecido. Uma camada de carbono de um ângulo de 90 graus é aplicada às faces fraturadas.

Em seguida, remova os espécimes replicados da mesa de réplica dupla e transfira-os para uma placa de cerâmica de 12 poços preenchida com TBS. Usando uma haste de fio de platina, remova o tecido replicado do transportador de amostras. Para a digestão SDS, transfira uma réplica para um frasco de vidro de quatro mililitros cheio de um mililitro de tampão de digestão SDS.

Deixe digerir por 18 horas a 80 graus Celsius com agitação. Para imunomarcação, lave a réplica por 10 minutos em tampão de digestão SDS fresco. Em seguida, incube-o com anticorpos primários e secundários, diluídos em 2%BSA-TBS, em uma câmara úmida a 15 graus Celsius por 24 a 72 horas.

Depois disso, monte a réplica em uma grade de barra paralela de 100 linhas revestida com forma distante. Imagine a réplica com um microscópio eletrônico de transmissão a 80 ou 100 quilovolts. Em seguida, adquira as imagens digitais através de uma câmera CCD.

Quando estiver offline, localize as regiões correspondentes na imagem da réplica, usando pontos de referência diferentes. Quatro semanas após a injeção de AAV, para expressar a Channelrodopsina-2 no grupo nuclear talâmico posterior, a Channelrodopsina-2 é efetivamente transportada anterógrada ao longo dos axônios talâmicos para atingir as massas celulares intercaladas da amígdala. A especialização pós-sináptica das sinapses glutamatérgicas pode ser reconhecida em uma réplica como um aglomerado de partículas intramembranares na face E da membrana plasmática e é frequentemente acompanhada pela face P de seu elemento pré-sináptico.

Aqui, os receptores de canalrodopsina-2 e glutamato foram visualizados usando partículas de ouro de diferentes tamanhos conjugadas aos anticorpos secundários. Devido à falta de ferramentas estruturais ou moleculares para detectar na mesma réplica se a membrana pós-sináptica pertencia aos neurônios intercalados. A réplica correspondente foi marcada para receptores opióides mu, um marcador para esses neurônios.

Como exemplo da análise quantitativa da densidade do receptor de glutamato nessas sinapses, aqui estão os gráficos de dispersão do número de partículas de ouro para receptores ampa versus a área sináptica em espinhos e dendritos. Que revelam uma correlação positiva em ambas as estruturas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as etapas individuais são altamente interdependentes.

Portanto, um erro em uma das etapas pode comprometer todo o procedimento. A visualização de grande parte das especializações da membrana plasmática em uma superfície bidimensional da réplica permite a inspeção da distribuição espacial e da continuidade física das moléculas de interesse sem a reconstrução trabalhosa e demorada de seções seriais de artrofina. Essa abordagem pode ser usada por outros pesquisadores para obter insights sobre as relações estrutura-função de sinapses específicas em circuitos neurais.

Onde está desembaraçando a origem das entradas e a natureza dos elementos pós-sinápticos. É crucial, mas problemático.