Name: A Tissue Combinada 3D Engineered In Vitro / In Silico Modelo de tumor de pulmão para prever a eficácia da droga em fundos específicos de mutação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Explore um modelo 3D de câncer de pulmão combinando abordagens in vitro e in silico para prever a eficácia de terapias direcionadas em NSCLC. Esta técnica integra previsões computacionais com dados experimentais para otimizar testes pré-clínicos de drogas.

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Esta pesquisa foi patrocinada pelo Centro Interdisciplinar de Investigação Clínica (IZKF, BD247 concessão) do Hospital Universitário de Wuerzburg eo programa Bayern Fit (concedido a Heike Walles).

1. bidimensional (2D) Cultura celular <ol><li> Comercialmente obter linha de células de tumor HCC827 (DSMZ). Cultura da linha celular de adenocarcinoma de pulmão HCC827 (EGFR mutante, KRAS do tipo selvagem) em meio RPMI-1640 suplementado com 20% de FCS. Alterar médio a cada 2 - 3 dias. Dividir as células duas vezes por semana. As células são usadas até que a passagem 20 seja atingido. </li><li> Comercialmente obter tumor linha de células A549 (DSMZ). Cultura da linha celular de carcinoma do pulmão A549 (EGFR de tipo selvagem, KRAS mutado) em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FCS. Realizar a cultura tal como indicado acima. As células são usadas até que a passagem 20 seja atingido. </li><li> Testar as células regularmente (de 4 - 6 semanas) por contaminações, tais como a contaminação por micoplasma. </li><li> A cultura de células A549 ou em lamelas de vidro HCC827 <ol><li> Coloque uma lamela de vidro esterilizada em cada poço de uma placa de 24 poços usando uma pinça. </li><li> Semente 50.000 células tumorais de ambas as linhas celulares em um volume de 500 ul nos poços comas lamelas de vidro, respectivamente. </li><li> Cultivar as células até atingirem uma confluência de 70% sob condições de cultura padrão (37 ° C; 5% de CO 2). Durante este tempo, Aspirar o meio de idade, utilizando uma pipeta Pasteur e adicionar 500 mL de meio fresco a cada 2 - 3 dias de cultura. </li></ol></li></ol> 2. Geração de Sistemas de Teste Tumor em um Biológica colágeno andaime <ol><li> Condições de cultura estática <ol><li> Gerar o decelularizado do intestino delgado-submucosa + mucosa (SISmuc) e corrigi-lo entre dois anéis de metal, os chamados coroas celulares, conforme descrito na publicação anterior 25. </li><li> Semear as células de ambos os 100.000 células A549 HCC827 ou em um volume total de 500 ul para o lado dos antigos lúmen do intestino fixo em coroas de células. </li><li> Permitir que as células tumorais a aderir durante 2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Adicionar 1 ml de meio no interior da coroa de células e 1 ml de fora. </li><li> Cultura do tumormodelo sob condições estáticas, a 37 ° C, 5% de CO 2 na incubadora durante 14 dias. Alterar meio de cultura a cada 2 - 3 dias. Portanto, Aspirar o meio com uma pipeta de Pasteur e pipeta de 1 ml fresco RPMI com a quantidade apropriada de FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) no interior da coroa de células e 1,5 ml do mesmo meio exterior. </li></ol></li><li> Condições cultura dinâmica <ol><li> Configure o sistema de teste de tumor com a matriz decelularizado dentro das coroas celulares e semeadura de células como descrito na subseção 2.1.1 a 2.1.3. </li><li> Cultura o modelo de tumor, em condições estáticas 37 ° C, 5% de CO 2 na incubadora durante 3 dias. </li><li> Monte o biorreator autoclavado e inserir o SISmuc semeado conforme publicado anteriormente 25. </li><li> Pipetar 45 ml de RPMI com a quantidade apropriada de FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) para o balão e o dispositivo de amostragem se conectam sem agulha para o sistema de tubagem entre o biorreactor e abalão médio. </li><li> Colocar o biorreactor na incubadora, ligá-lo à bomba e o modelo de tumor de cultura durante mais 14 dias, com uma constante de fluxo médio (3 ml / min) a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Mudar o meio de cultura após 7 dias. Para isso, mover o bioreactor do incubador sob uma câmara de fluxo laminar. Aspirar o meio no frasco de suporte, utilizando uma pipeta de Pasteur. Levante o biorreator, enquanto a aspiração de se livrar do meio no sistema de tubulação. Pipetar 45 ml de meio fresco para o balão. Coloque o biorreator de volta para a incubadora e ligá-lo à bomba. </li></ol></li></ol> 3. Tratamento do Modelo de tumor estáticas com gefitinib <ol><li> Cultura o modelo de tumor, como descrito na secção 2.1. </li><li> No dia 11 de cultura, preparar RPMI / FCS com 1 gefitinib? M (2,5 ml para cada coroa celular). Aspirar a idade média dos poços usando uma pipeta de Pasteur e adicionar 1 ml de meio RPMI preparado / FCS / gefitinib dentro tele coroa de células e 1,5 ml do mesmo meio exterior. NOTA: A solução de estoque descongelado gefitinib pode ser armazenado a 4 ° C durante uma semana. </li><li> Alterar o meio no dia 13 como descrito na subsecção 3.2. </li></ol> 4. Estimulação do Modelo de tumor estáticas com FTC-beta-1 para indução de EMT <ol><li> Cultura o modelo de tumor, como descrito na secção 2.1. </li><li> Pelo dia 3 de cultura, preparar RPMI / FCS com 2 ng / ml de TGF-beta 1 com o transportador (2,5 ml para cada coroa de células). Aspirar a idade média dos poços usando uma pipeta de Pasteur e adicionar 1 ml de meio RPMI preparado / FCS / FTC-beta-1 no interior da coroa de células e 1,5 ml do mesmo meio exterior. Mudança de meio suplementado com FTC-beta-1 a cada 2 - 3 dias até 14 dias, conforme descrito em 4.2. </li></ol> 5. Leia-outs <ol><li> Recolha de amostras para medições de ELISA <ol><li> Recolher amostras dos sobrenadantes de estática (seção 2.1) e cultura dinâmica (ponto 2.2) duranteo tratamento com gefitinib (secção 3) nos dias 11-14 da cultura, tal como indicado na Figura 2. Para além disso, tomar uma amostra antes do tratamento (T0). </li><li> Sob condições de cultura estática, tomar amostra de 100 ul a partir do interior da célula coroa. Sob condições de cultura dinâmica, o parafuso de seringa no dispositivo de amostragem e levar 1 ml de meio para fora do sistema de biorreactor. Armazenar todos os sobrenadantes recolhidos a -80 ° C até o ensaio ELISA é realizado. </li></ol></li><li> M30-ELISA para a Quantificação de Apoptose <ol><li> Para quantificar a apoptose nos sobrenadantes de realizar o ensaio de morte celular de acordo com as instruções do fabricante. Todos os reagentes para atingir a TA antes de realizar o ensaio. </li><li> Vortex todos os reagentes. Dissolva o comprimido de lavagem em água deionizada fresco 500 ml. Dilui-se conjugado de HRP com 9,2 ml de tampão de diluição de conjugado e misturar. Pipetar 25 ul de padrão ou de amostra por poço. </li><li> Adicionar 75 ml da HRP Conju diluídasolução portão por poço. Cobrir a placa e incubar-lo num agitador durante 4 h à TA. Lava-se a placa manualmente, 5 vezes com 250 ul de solução de lavagem preparada. </li><li> Adicionar 200 ul de 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço. Incubar no escuro a temperatura ambiente durante 20 min. Adicionar 50 ul de solução de paragem a cada poço. Agitar a microplaca durante 10 segundos e deixar a microplaca durante 5 min antes de ler a absorvância. Determinar a absorvância a 450 nm num leitor de microplacas. Calcula-se a curva padrão e as concentrações nas amostras utilizando um programa adequado para lidar com dados do tipo de ELISA tais como a origem. </li></ol></li><li> coloração amostra <ol><li> Fixação, parafina-incorporação e Seção Preparação do modelo 3D <ol><li> Fixar o SISmuc semeado com 2,5 ml de paraformaldeído a 4% (PFA) por coroa celular para 2 horas e incorporá-lo em parafina </li><li> Preparar 3 uM secções de tecido para a coloração, tal como publicado anteriormente25. </li></ol></li><li> Fixação de células cultivadas em 2D Condições Cultura <ol><li> Quando 70% de confluência é atingido, lavar as células cultivadas sobre lamelas de vidro em placas de 24 poços uma vez com PBS e corrigi-los com 500 ul de 4% PFA / poço, durante 10 min. </li><li> Remover PFA e armazenar as lamelas de vidro para o bem-placa coberta com PBS a 4 ° C até a coloração é realizada. </li></ol></li><li> H &amp; E coloração <ol><li> Corar as secções re-hidratadas com Hematoxilina / Eosina como uma coloração visão geral de acordo com protocolos padrão. </li></ol></li><li> Coloração de imunofluorescência do modelo 3D <ol><li> Para coloração por imunofluorescência, realizar uma recuperação de antigénios, colocando as lâminas desparafinizadas e re-hidratadas numa panela a vapor pré-aquecido com tampão citrato (pH 6,0) durante 20 min. NOTA: Consulte a tabela de materiais e equipamentos de para a preparação de tampão citrato. </li><li> Transferir as lâminaspara o tampão de lavagem (tampão PBS, 0,5 M + Tween a 0,5%), as secções do círculo com uma caneta PAP para minimizar o volume necessário para as soluções de coloração e coloque as lâminas numa câmara de humidade. </li><li> Bloquear as secções de tecido com 5% de soro a partir das espécies de hospedeiros dos anticorpos secundários utilizados na alínea 5.3.4.6 durante 20 min à TA. </li><li> Remover o soro de bloqueio agitando ligeiramente as lâminas com um lenço de papel e aplicar o anticorpo primário às secções cercados numa diluição, de acordo com as instruções do fabricante (coelho anti Ki67 1: 100, de coelho anti vimentina 1: 100, de ratinho anti pan-citoqueratina 1 : 100). Incubar O / N a 4 ° C. Para double-coloração, devem ser utilizados anticorpos primários de diferentes espécies hospedeiras. </li><li> Lavar cuidadosamente off anticorpo não ligado com tampão de lavagem três vezes por 5 min. </li><li> Para a detecção de ligações específicas de antigénio-anticorpo, anticorpos secundários aplicar na diluição de 1: 400 para as secções e incubar à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Lavar UnBanticorpo ound com tampão de lavagem três vezes durante 5 min. </li><li> Montar as lâminas com um meio aquoso contendo DAPI para contracoloração núcleos e deixe-os secar O / N. </li></ol></li><li> Coloração por imunofluorescência de células cultivadas 2D <ol><li> Remover PBS e cobrir as lamelas de vidro semeada com 0,2% de Triton-X100 em PBS durante 5 min para a permeabilização. Lavam-se as lamelas de vidro com tampão de lavagem (tampão PBS, 0,5 M + Tween a 0,5%) durante 5 min. </li><li> Execute as etapas de 5.3.4.3 a 5.3.4.7. Executar todos os passos do bem-placa sobre uma plataforma oscilante e remover os reagentes invertendo a placa. </li><li> Para a montagem, detectar uma gota de meio aquoso contendo DAPI para contracoloração núcleos em uma lâmina de vidro revestido e não transferir a lamela a ele com as células de frente para o meio de montagem usando uma pinça. Deixe secar antes de imagem. </li></ol></li></ol></li><li> Determinação do índice de proliferação <ol><li> execute imunofluorescênciamanchando contra Ki67 de acordo com a seção 5.3.4. ou 5,3 5. </li><li> Tome imagens fluorescentes das secções de tecidos ou células cultivadas em 2D com um microscópio invertido. Use diferentes filtros para tirar imagens de colorações DAPI e de colorações Ki67. Para a quantificação, usar 10 imagens de secções 3D ou 5 imagens das culturas 2D (20x) de cada condição de partes não sobrepostas da amostra. </li><li> Determinar o número de núcleos e o número de núcleos positivos para Ki67 em 2D <ol><li> Contagem Ki67 núcleos positivos manualmente usando o contador de células plug-in do software Fiji 26. Portanto, abra a imagem e clique em &quot;Plugins&quot; → &quot;Analisar&quot; → &quot;Cell Contador&quot;. Pressione o botão &quot;Iniciar&quot; e selecione um tipo de contador. Clique em cada núcleo Ki67 positivo. O número de cliques é mostrado ao lado do tipo de contador selecionado. </li><li> Para contagem de células automático do número total de núcleos criar uma macro usando Fiji 27,28. AdjUst a macro para cada linha de coloração e celular. A seguir, veja um exemplo de como criar uma macro. <ol><li> Comece gravador de macro. Abra uma imagem de DAPI e convertê-lo para o formato de 8 bits, clicando em &quot;Imagem&quot; → &quot;Tipo&quot; → &quot;8-bit&quot;. Clique em &quot;Melhore o contraste&quot;, definir &quot;saturada&quot; como &quot;1&quot; e &quot;normalizar&quot;. </li><li> Defina &quot;máscara de nitidez&quot; a nitidez da imagem. Usar um &quot;raio&quot; de &quot;1&quot; e uma &quot;máscara&quot; de &quot;0,60&quot;. Clique em &quot;limiar de auto&quot;, escolher o método de &quot;RenyiEntropy&quot; com &quot;objetos brancos sobre fundo preto&quot; para binarise a imagem. </li><li> Clique em &quot;Plugins&quot; → &quot;BioVoxxel&quot; → &quot;características irregulares divisor de águas&quot; com um raio erosão do &quot;5&quot; para separar as células. Clique em &quot;Analisar&quot; → &quot;Analisar Particles&quot; e definir o &quot;tamanho&quot; para &quot;0,02-Infinito&quot;. NOTA: O número de partículas / células émostrados na tabela de resumo como contagens. </li><li> Clique em &quot;Criar&quot; para salvar macro para a análise de novas imagens. </li></ol></li></ol></li><li> Determinar o número de núcleos e número de núcleos positivos para Ki67 em 3D manualmente, conforme descrito no subitem 5.4.3.1. </li><li> Calcula-se a média índice de proliferação (PI), de acordo com a seguinte fórmula: <img alt="equação1" src="/files/ftp_upload/53885/53885equation1.jpg" /> n = número de imagens (3D: 10, 2D: 5) </li></ol></li></ol> 6. In Silico Geração Tumor Modelo e Simulação de terapia anti-EGFR em células HCC827 <ol><li> Generation Network usando um software de análise de rede <ol><li> Use diferentes bases de dados conhecidos para gerar a rede de tumor com base nos parâmetros experimentais importantes de leitura e do fundo mutacional da linha de células HCC827. </li><li> Abra o software de análise de rede 21 para visualizar arede. <ol><li> Clique → &quot;Novo&quot; → tipo &#39;modelos&#39; JoVE_tumor &quot;File&quot; → clique em &quot;OK&quot; para gerar uma nova rede. Clique em &quot;Praça do close up do Norte&quot; → &quot;OK&quot; para visualizar o receptor em uma membrana dupla. Clique em &quot;Protein genérico&quot; para visualizar os nós (= proteínas) como retângulos → tipo &#39;EGFR &quot;→ clique em&quot; OK &quot;; repetir este procedimento para cada nó na rede. </li><li> Rotular os nós na rede: clique com o botão direito → &quot;Shape Change Color &amp; ...&quot; → selecionar para nós EGFR e (EGF-EGFR) código de cor &quot;255,0,0&quot; (cor vermelha); Para nós de c-MET e (c-MET) código de cor &quot;0,255,0&quot; (cor verde); para código de cor gefitinib &quot;255,255,0&quot; (cor amarela); para código de cor PI3K-INH &quot;204204204&quot; (cor cinza claro); para código de cor MEK-INH &quot;102102102&quot; (cor cinza escuro); para todos os outros nós no seleto código de cor rede4; 255,255,255 &quot;(cor branca). </li><li> Clique em &quot;Fenótipo&quot; para visualizar parâmetros ler-out como hexágonos → tipo &#39;proliferação &quot;→ clique em&quot; OK &quot;→ clique com o botão direito → → selecione o código de cor&quot; 255204204 &quot;(salmão cor)&quot; mudar de forma ... Cor &amp; &quot;; repetir este para o parâmetro apoptose → selecione a cor do código &quot;255,51,204&quot; (cor violeta). </li><li> Visualize Edges (= interações): Clique em &quot;Estado de Transição&quot; para ativações (setas), clique em &quot;inibição&quot; de inibições (flechas embotadas); repetir este procedimento para cada interacção na rede. </li></ol></li><li> Clique em &quot;Arquivo&quot; → &quot;Salvar como ...&quot; → tipo &#39;JoVE_tumor models.xml &quot;→ clique em&quot; Save &quot;para salvar a rede de sinalização gerada como XML formato. </li></ol></li><li> In Silico Simulação usando SQUAD NOTA: SQUAD representa the topologia da rede como um sistema discreto lógico Booleano (AND, OR, NOT) e executa uma análise de estado estacionário. A análise estado estável reflete o equilíbrio do sistema e a responsabilidade sobre estímulos de sinalização (por exemplo., A aplicação de drogas ou mutação). <ol><li> Abrir software SQUAD 17, clique em &quot;Network Load&quot; → de upload &#39;JoVE_tumor models.xml&#39; arquivo. Clique em &quot;análise Run&quot;: NOTA: Em seguida, aplica-se SQUAD função exponencial para interpolar a conectividade de rede booleana, que permite a simulação dinâmica do comportamento da rede ao longo do tempo (coloridas curvas de atividade sigmóide). </li><li> Clique em &quot;Avançado&quot; → &quot;Perturbator&quot; para escrever um protocolo de simulação. Simular a resistência anti-EGFR: Clique em &quot;Editar Protocolo&quot; <ol><li> Clique em &quot;perturbação&quot; → usar padrão &quot;initialState = SS-4&quot; (estado estacionário 4) → Clique em &quot;Adicionar&quot; para adicionar &quot;novo pulso Constant → Select parâmetro &quot;estado&quot; → &quot;FLIP&quot; Selecionar destino → Select tempo &quot;0&quot; → Select valor &quot;0,4&quot; → Clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Repita isso: Clique em &quot;Adicionar&quot; → Seleccionar o parâmetro &quot;estado&quot; → Selecionar destino &quot;c-MET&quot; → Select tempo &quot;0&quot; → Select valor &quot;0,4&quot; → Clique em &quot;OK&quot;; Clique em &quot;Adicionar&quot; → Seleccionar o parâmetro &quot;estado&quot; → &quot;gefitinib&quot; Selecionar destino → Select tempo &quot;0&quot; → Select valor &quot;1&quot; → Clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Defina um valor de estado de nó ativo (EGF-EGFR): Clique em &quot;activenode&quot; → Clique em &quot;Editar&quot; → Selecione o estado &quot;0.8&quot; → Clique em &quot;OK&quot;; para todos os outros nós: Clique em &quot;Editar&quot; → Selecione estado &quot;0&quot; → Clique em &quot;OK&quot;. Clique em &quot;OK&quot; para salvar o protocolo. </li><li> Exibir curvas específicas: Vá para o painel &quot;Opções&quot; → Escolha &quot;(EGF-EGFR)&quot;, &quot;* (EGF-EGFR)&quot;, &quot;* MEK&quot;, &quot;caspases&quot;, &quot;(c-MET)&quot;, &quot;PI3K&quot;, &quot;gefitinib&quot;, &quot;apoptose&quot;, &quot;proliferação&quot;, &quot;MEK-INH&quot; e &quot;PI3K-INH&quot; para a representação gráfica. Clique em &quot;Iniciar&quot; → &quot;Executar&quot; para iniciar uma simulação completa de resposta do sistema. Clique em &quot;Reset&quot; para iniciar uma nova simulação. </li></ol></li><li> Simular PI3K combinada e tratamento inibidor MEK: Clique em &quot;Editar Protocolo&quot; <ol><li> Usar o mesmo parâmetro de nó, conforme descrito em 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Clique em &quot;perturbação&quot; → Clique em &quot;Adicionar&quot; para adicionar &quot;novo pulso Constant → Seleccionar o parâmetro&quot; estado &quot;→ Select target&quot; PI3K-INH &quot;→ Select tempo&quot; 0 &quot;→ Select valor&quot; 1 &quot;→ Clique em&quot; OK &quot;; Clique em &quot;Adicionar&quot;para adicionar &quot;novo pulso Constant → Seleccionar o parâmetro&quot; estado &quot;→ Select target&quot; MEK-INH &quot;→ Select tempo&quot; 0 &quot;→ Select valor&quot; 1 &quot;→ Clique em&quot; OK &quot;. </li><li> Clique em &quot;OK&quot; para salvar o protocolo. Vá para o painel &quot;Opções&quot;: Use mesmos nós de representação gráfica conforme descrito em 6.2.2.4. Clique em &quot;Iniciar&quot; → &quot;Executar&quot; para iniciar uma simulação completa de resposta do sistema. Clique em &quot;Reset&quot; para terminar a simulação. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Gill, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+matrix+with+independently+tunable+biochemistry+and+mechanical+properties+to+study+epithelial+morphogenesis+and+EMT+in+a+lung+adenocarcinoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model.</a> Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nós estabelecemos um combinado in vitro / in sistema de teste tumor silico para previsões de tratamento guiado por biomarcadores. O modelo in vitro avalia diferentes aspectos importantes de acções compostos, tais como mudanças de proliferação de células tumorais e a apoptose em um fundo mutacional específico, que também pode ser simulada in silico 17. Aqui, apresentamos o protocolo padronizado para 3D geração de modelo de tumor e teste composto incluindo a quantificação da ...

A indústria farmacêutica está de frente para altas taxas de desgaste de até 95% no domínio do tratamento do cancro em fase clínica provocando enormes custos 1-5. Uma razão para este défice é o facto de, actualmente eficácia de potenciais novos compostos é avaliada em rastreios de grande escala em culturas de células em 2D de linhas de células de cancro ou em modelos animais. Os modelos animais têm uma complexidade maior, mas existem diferenças cruciais entre ratos e homens 6,7. Na última década, modelos de cancro em 3D usando diferentes abordagens têm sido gerados para preencher a lacuna entre a cultura 2D de linhas celulares de cancro e um complexo de 6,8,9 tumor vivo. O impacto do ambiente 3D na diferenciação celular e também na sinalização tem sido demonstrado em vários estudos anos atrás (por ex., Por Mina Bissell) 10,11. Hoje em dia, muitos modelos de cultura de células estão disponíveis em 3D, tais como culturas de esferóides, hidrogéis ou chips de microfluidos 12-16. Mesmo que Tse modelos aumentarão a complexidade em relação aos sistemas convencionais de cultura 2D, que principalmente carecem de um microambiente tecido que é conhecido por ter efeitos apoiando-tumorais e também impactos eficácia da droga. Para abordar esta questão, geramos um modelo de tumor 3D baseado em um andaime biológico chamado SISmuc (do intestino delgado-submucosa + mucosa), que é derivado de um jejuno porcinos descelularizados. Deste modo, a arquitectura do tecido e os componentes importantes da ECM, tais como diferentes colagénios, bem como a estrutura da membrana basal são preservados 17. Esta característica única é crucial para a geração modelo de tumor de carcinomas que surgem a partir do epitélio e compreendem cerca de 80% de tumores sólidos. Além disso, a taxa de proliferação no nosso modelo de tumor da engenharia de tecidos é reduzida em comparação com as elevadas taxas artificialmente alcançados na cultura 2D. Como a proliferação é um parâmetro importante para avaliar a eficácia dos medicamentos, testes de drogas está habilitado no nosso modelo em mais semelhantecondições para in vivo tumores 17. A fim de avaliar o potencial do nosso modelo para prever a eficácia do fármaco-dependentes biomarcador corretamente, os dados aqui presentes para duas linhas de células de câncer de pulmão diferentes que diferem em seu estado EGFR -biomarker. Este estado mutacional começou a ser determinado rotineiramente em pacientes com NSCLC. Tratamentos direcionados com TKI como o EGFR -inhibitor gefitinib contra tumores que carregam uma mutação ativando mostra EGFR resultados superiores em comparação com aqueles com quimioterapia à base de platina 18-21. Nós estabelecemos várias técnicas de leitura que são relevantes para avaliar a eficácia do composto. Além disso, após a TGF-beta-1 a estimulação somos capazes de investigar as acções de compostos em células tumorais que iniciou o processo de EMT, que se pensa ser uma etapa importante na transformação maligna 22,23 e que está ligado à droga resistance 24. O modelo de tumor 3D permitem monitorar as respostas específicas de células para tratamentos dirigidos, quimioterapia, ou combinações de fármacos com boa contrastes. Para melhorar ainda mais e acelerar droga triagem e encontrar resistência, isto é complementado por uma simulação em silico. Com base em algumas experiências, a resposta do tumor pode ser previsto no silício em relação ao resultado de uma ampla gama de medicamentos e suas combinações.

<table><tbody><tr><td>Presidente de Biorreatores</td><td>de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa, W&uuml; rzburg (GER)</td><td></td><td>Configuração do biorreator</td></tr><tr><td>BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji)</td><td>Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell crowns</td><td>Presidente de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa, W&uuml; rzburg (GER)</td><td></td><td>para cultura 3D estática</td></tr><tr><td>CellDesigner</td><td>http://www.celldesigner.org/</td><td>-</td><td>Este software foi usado para desenhar a rede.</td></tr><tr><td>Solução de estoque tampão de citrato (10x)</td> <td>em produção</td><td></td> interna <td>42 g/L Ácido cítrico monohidratado, 17,6 g/L Pastilhas de hidróxido de sódio em água deionizada, pH 6,0, armazenadas em RT.&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de trabalho de tampão de citrato</td><td>na produção</td><td></td> interna <td>Solução de estoque tampão de citrato a 10% em água desmineralizada, armazenada em RT.</td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidratado</td><td>VWR, Darmstadt (GER)</td><td>1002441000</td><td>usado para o tampão citrato</td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>VWR, Darmstadt (GER)</td><td>631-1339</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-GTM</td><td>SouthernBiotech, Birmingham (EUA)</td><td>SBA-0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Bancos de dados como KEGG, HPRD e QIAGEN (Genes & Caminhos)</td><td>http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/</td><td>-</td><td>Diferentes bancos de dados da literatura conhecida foram usados para gerar a topologia da rede.</td></tr><tr><td>Camiseta Feminina Estilo Luer Lug</td><td>Mednet, M&uuml; Configuração do</td> <td>biorreator</td>nster (GER)<td>FTLT-1</td></tr><tr><td>Estilo de rosca Luer fêmea com rosca hexagonal de 5/16" para rosca UNF de 1/4-28</td><td>Mednet, M&uuml; nster (GER)</td><td>SFTLL-J1A&nbsp;</td><td>Configuração do biorreator</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>Bio& SELL, Feucht (GER)</td> <td>FCS. ADD.0500</td><td>não inativado por calor</td></tr><tr><td>Gefitinib</td><td>Absource Diagnostics GmbH, M&uuml; nchen (GER)</td><td>S1025-100 mg</td><td>100 mM solução de estoque com DMSO</td></tr><tr><td>Balão de vidro (Schott, GER) fornecido com conexão de mangueira de vidro</td><td>Weckert, Kitzingen (GER)</td><td>feito sob medida</td><td></td></tr><tr><td>Histofix 4% (Paraformaldeído)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>P087.1</td><td></td></tr><tr><td>Acoplamento de mangueira</td><td>Mednet, M&uuml; Configuração do</td> <td>biorreator</td>nster (GER)<td>CC-9</td></tr><tr><td>Incubadora para biorreatores</td><td>Presidente de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa, W&uuml; rzburg (GER)</td><td></td><td>Configuração do biorreator</td></tr><tr><td>M30 CytoDeathTM ELISA</td><td>Peviva, Bromma (SWE)</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>Anel de Trava Integral Luer Macho</td><td>Mednet, M&uuml; nster (GER)</td><td>MTLL230-J1A</td><td>Configuração do biorreator</td></tr><tr><td>Câmara de umidade</td><td>feita</td><td></td><td></td>sob medida</tr><tr><td>Mouse anti Pan-Citoqueratina</td><td>Sigma-Aldrich, Munique (GER)&nbsp; &nbsp;</td><td>C2562-2ML</td><td>Clone C-11 + PCK-26 + CY-90 + KS-1A3
+M20+A53-B/A2, usado 1/100 para imunofluorescência</td></tr><tr><td>Válvula Swabable sem agulha Fêmea Luer</td><td>Mednet, M&uuml; nster (GER)</td><td>NVFMLLPC</td><td>Configuração do biorreator, para amostragem, O-Ring esterilizado por gama</td></tr><tr><td>MVQ 10 vermelho 37 x 3 mm</td><td>Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER)</td><td>21444</td><td>O-ring grande, configuração do biorreator</td></tr><tr><td>O-Ring MVQ 70 vermelho 27 x 2,5 mm</td><td>Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER)</td><td>19170</td><td>O-ring pequeno, configuração do biorreator</td></tr><tr><td>caneta PAP</td><td>Dako, Hamburgo (GER)</td><td>S002</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6642.6</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER)</td><td></td><td>Configuração do biorreator</td></tr><tr><td>Tamponamento de fosfato Salino</td><td>Sigma-Aldrich, Munique (GER)&nbsp; &nbsp;</td><td>D8537-6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>de tubulação de bomba</td><td>Ismatec, Wertheim (GER)</td> <td>IS 3710</td><td>Configuração do biorreator</td></tr><tr><td>Rabbit anti Ki67</td><td>Abcam, Cambridge (Reino Unido)</td> <td>ab16667</td><td>Clone SP6, usado para 1/100 para IF</td></tr><tr><td>Rabbit anti Vimentin</td><td>Abcam, Cambridge (Reino Unido)</td> <td>ab92547</td><td>usado 1/100 para</td></tr><tr><td>IF RPMI-1640 medium</td><td>Life technologies, Darmstadt (GER)</td> <td>61870-044</td><td>quente em 37 > C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Tubo de silicone</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER)</td><td>HC66.1</td><td>Configuração do biorreator</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich, M&uuml; nchen (GER)</td><td>30620-1KG-R</td><td>utilizado para o tampão citrato</td></tr><tr><td>SQUAD</td><td></td> <td>http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-Este</td> <td>software foi utilizado para a realização das simulações semiquantitativas.</td></tr><tr><td>Filtro de ar estéril, tamanho de poro 0,2 &micro; m</td><td>Sartorius Stedium Biotech, G&ouml; ttlingen (GER)</td><td>16596-HYK</td><td>Configuração do biorreator</td></tr><tr><td>Seringa Luer Lok 5 ml</td><td>BD Biosciences, Heidelberg (GER)</td><td>309649</td><td>para amostragem de biorreator</td></tr><tr><td>Placas de teste de cultura de tecidos: 6-,&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 12, 24, 96 poços</td><td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER)</td> <td>92006, 92012, 92024, 92048</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento transformador-beta 1 (TGF-&beta; 1) com Cell</td><td>Signaling, Frankfurt (GER)</td> <td>8915LC</td><td>solução estoque em tampão citrato estéril pH 3,0</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, M & uuml; nchen (GER)</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich, M&uuml; nchen (GER)</td> <td>P7949-500ml</td><td>para tampão de lavagem de coloração imunofluorescente</td></tr></tbody></table>

a tissue combinada 3d engineered<em&gt; in vitro</em&gt; /<em&gt; in silico</em&gt; modelo de tumor de pulmão para prever a eficácia da droga em fundos específicos de mutação

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

No presente estudo, nós combinamos um modelo de tumor in vitro 3D pulmão com um modelo em silico para otimizar previsões de resposta à droga com base em um fundo mutacional específico. O modelo é gerado num andaime porcino descelularizado que reproduz as características específicas de tecidos em relação à composição da matriz extracelular e arquitectura, incluindo a membrana basal. Nós padronizado um protocolo que permite a geração de tecido tumoral artificial no prazo de 14 dias incluindo três dias de tratamento com fármaco. Nosso artigo fornece várias descrições detalhadas de 3D ​​leitura de técnicas de rastreio, como a determinação da do índice de proliferação Ki67 coloração, a apoptose a partir de sobrenadantes por M30-ELISA e avaliação de epitelial para mesenquimal (EMT), que são ferramentas úteis para avaliar a eficácia das compostos terapêuticos. Pudéssemos mostrar em relação à cultura 2D uma redução da proliferação em nosso modelo de tumor em 3D que é related com a situação clínica. Apesar desta proliferação inferior, o modelo previu EGFR de respostas ao fármaco -targeted correctamente de acordo com o estado biomarcador como se mostra por comparação das linhas de células de carcinoma de pulmão HCC827 (EGFR -mutated, KRAS do tipo selvagem) e A549 (EGFR de tipo selvagem, KRAS - mutado) tratados com o inibidor da tirosina-gefitinib cinase (TKI). Para investigar as respostas de drogas de células de tumor mais avançadas, EMT induzida por tratamento de longo prazo com TGF-beta-1, tal como avaliado por vimentina / imunofluorescência pan-citoqueratina. Um fluxo-biorreator foi empregado para ajustar a cultura às condições fisiológicas, o que melhorou a geração de tecido. Além disso, vamos mostrar a integração de respostas de drogas após tratamento gefitinib ou TGF-beta-1 de estimulação - a apoptose, índice de proliferação e EMT - em um booleano no modelo silico. Além disso, explicamos como respostas de drogas de células de tumor com um fundo mutacional específico e contagemerstrategies contra a resistência pode ser previsto. Estamos confiantes de que o nosso 3D abordagem in vitro especialmente com sua expansão in silico proporciona um valor adicional para testes de drogas pré-clínicos em condições mais realistas do que na cultura de células 2D.

Na base do andaime SISmuc (Figura 2A a C), foi estabelecido um protocolo de funcionamento normalizado para a geração, a estimulação e tratamento de um sistema de teste do tumor 3D (Figura 2D). Este modelo permite a determinação do índice de proliferação e a quantificação da apoptose utilizando M30-ELISA, como mostrado na Figura 1 e Figura 3, respectivamente. A Figura 3 mostra representativa H &amp; E de ...

Apresentamos um modelo tridimensional (3D) de câncer de pulmão baseado em um andaime de colágeno biológico para estudar a sensibilidade a terapias direcionadas ao câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Demonstramos diferentes técnicas de leitura para determinar o índice de proliferação, apoptose e status de transição epitelial-mesenquimal (EMT). Os dados coletados são integrados em um modelo in silico para previsão da sensibilidade aos medicamentos.

A Tissue Combinada 3D Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmão para prever a eficácia da droga em fundos específicos de mutação

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Os objetivos gerais deste modelo combinado de câncer de pulmão in vitro / in silico são estudar a sensibilidade das terapias direcionadas ao câncer de pulmão de células não pequenas e prever a eficácia de novas substâncias. Este sistema de modelo 3D permite o monitoramento de respostas específicas da célula a tratamentos direcionados ou combinações diretas. A principal vantagem desta técnica é que as previsões in Silico podem facilitar o teste pré-clínico de drogas em um ambiente mais relevante do ponto de vista fisiológico.As implicações dessa técnica se estendem à terapia de diferentes entidades tumorais, pois pode ser usada para otimizar as previsões de resposta a medicamentos com base em contextos mutacionais específicos. Demonstrando o procedimento estará, Franziska Schmitt, assistente de pesquisa, do nosso laboratório. Para configurar uma cultura dinâmica, comece cultivando o modelo de tumor em condições de cultura estática, em uma coroa de células a 37 graus Celsius e 5% de CO2, em uma incubadora convencional.Após três dias, monte um biorreator autoclavado e insira um submucoso biológico do intestino delgado com sementes e um andaime de mucosa no sistema. Em seguida, adicione 45 mililitros de RPMI, complementados com a quantidade apropriada de FCS a um frasco e conecte o dispositivo de amostragem sem agulha ao sistema de tubulação entre o biorreator e o frasco do meio. Coloque o Biorreator na incubadora e conecte-o à bomba para cultivar o modelo de tumor, por mais 14 dias, com um fluxo médio constante de três mililitros por minuto.Para tratar um modelo de tumor estático com Gefitinibe, no dia 11 de cultura na incubadora convencional, primeiro use uma pipeta pasteur para remover o meio antigo dos poços. Em seguida, adicione um mililitro de RPMI recém-preparado, complementado com FCS e Gefitinibe, no interior de cada coroa celular e 1,5 mililitros no fundo de cada poço. Para coletar as amostras de Elisa de uma cultura dinâmica, nos dias 11 a 14 de cultura, conecte a seringa ao dispositivo de amostragem e remova um mililitro de meio do sistema do biorreator.Em seguida, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até que o Elisa seja realizado. Para determinar o número de núcleos positivos Ki67, primeiro use um microscópio invertido para obter cinco imagens fluorescentes de coloração DAPI e cinco Ki67 de culturas 2D com uma ampliação de 20 vezes de cada condição, a partir de seções não sobrepostas da amostra. Para contar manualmente os núcleos positivos Ki67, abra a imagem emergida em Fiji e selecione Plugins e Cell Counter, clique em inicializar, selecione um tipo de contador e clique em cada núcleo positivo Ki67.O número de células clicadas aparecerá ao lado do tipo de contador selecionado. Para contagem automática de células do número total de núcleos nas imagens 2D, inicie o gravador de macros, abra uma imagem DAPI e clique em imagem, digite e 8 bits, clique em melhorar contraste e defina o parâmetro saturado como um e normalize. Para aumentar a nitidez da imagem, defina a máscara de nitidez, usando um raio de um e uma máscara de 60.Para associar a imagem, clique em limite automático e escolha o método Reny/Entropy com objetos brancos em fundo preto. Em seguida, clique em Plugins, seguido de BioVoxxel, e feição irregular da bacia hidrográfica, com um raio de erosão de cinco para separar as células. Clique em analisar e analisar partículas e defina o tamanho como 02 infinito e marque resumir.O número de células será mostrado na tabela de resumo como contagens. Em seguida, clique em criar para salvar a macro para permitir a contagem automática de núcleos, em outras imagens de cultura de células 2D. Depois de usar bancos de dados conhecidos para gerar uma rede de tumores, abra o software de análise de rede apropriado, clique em arquivo e novo e insira modelos de tumor jove.Clique em ok, para gerar uma nova rede, depois clique, quadrado closeup North e ok, para visualizar o receptor em uma membrana dupla. Para visualizar os nós como retângulos, clique em proteína genérica, depois em EGFR, Ok.To rotular os nós na rede, clique com o botão direito do mouse para alterar a cor e a forma e defina os códigos de cores dos nós conforme indicado. Para visualizar os parâmetros de leitura como hexágonos, selecione fenótipo, insira proliferação e clique em ok.Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione alterar cor e forma novamente para definir o código de cores para 255, 204, 204. Para visualizar as bordas das interações de nós, clique em transição de estado para setas de ativação e inibição para setas de inibição embotadas. Em seguida, clique em arquivo e salvar como, e salve a rede de sinalização gerada, como jove tumor models.xml.Para análise de estado estacionário do equilíbrio do sistema, abra o software SQUAD, clique em carregar rede e carregue o arquivo models. xml tumor jove. Clique e execute a análise.Para escrever um protocolo de simulação, clique em avançado e pertubador e, em seguida, clique em editar protocolo para simular a resistência anit-EGFR. Em seguida, clique em pertubação e selecione o estado inicial padrão igual ao estado estacionário quatro. Clique em adicionar para adicionar o novo pulso constante, selecione o parâmetro de estado e defina o alvo como FLIP, o tempo como zero e o valor como 4.Clique em ok e defina os estados para c-MET e Gefitinibe, da mesma maneira. Para definir um valor de estado para o nó EGFR ativo, clique em nó ativo e, em seguida, clique em editar. Defina o estado como 8 e clique em ok.Clique em ok para salvar o protocolo. Para exibir as curvas específicas, no painel de opções, selecione EGF-EGFR, estrela EGF-EGFR, estrela Mek, caspases, PI3K, Gegitinibe, apoptose, proliferação, inibidor de MEk e inibidor de PI3K. Em seguida, clique em inicializar e executar para iniciar uma simulação completa da resposta do sistema.Para simular um tratamento combinado com inibidores de PI3K e Mek, clique em editar protocolo. Em seguida, usando o mesmo parâmetro de nó que acabamos de demonstrar, clique em pertubação, seguido de adicionar, para adicionar um novo pulso constante. Em seguida, selecione um parâmetro de estado e defina o alvo para inibidor de PI3K, o tempo para zero e o valor para um e clique em ok.Clique em adicionar, novamente, para adicionar outro novo pulso constante e, no parâmetro de estado, defina o alvo para inibidor de Mek, defina o tempo para zero e o valor para um e clique em ok, seguido de ok novamente, para salvar o protocolo. No painel de opções, usando os mesmos nós para a representação gráfica demonstrada, clique em inicializar e execute para iniciar uma simulação completa da resposta do sistema. Em seguida, para finalizar a simulação, clique em redefinir.Este sistema de teste de tumor 3D facilita a determinação do índice de proliferação. E a quantificação da apoptose usando M30 Elisa. Neste experimento representativo, por exemplo, apenas células tumorais HCC827 com mutação EGFR, incubadas em condições de cultura estática, responderam à inibição do fator de crescimento epidérmico.Pelo inibidor da tirosina-quinase, Gefitinibe, como evidenciado pelo aumento da apoptose observado no sistema modelo de tumor HCC827. Aqui são mostradas imagens representativas de modelos tumorais 3D estáticos, com ou sem, indutor de transição epitelial-mesenquimal, simulação de TGF-beta-1. Observe o aumento da expressão de vimentina, nas culturas de células tumorais tratadas.Em condições dinâmicas, o Gefitinibe exerce um efeito robusto nas células HCC827 com mutação EGFR, como evidenciado pela diminuição de estruturas semelhantes a tecidos, na presença do inibidor de tirosina-quinase, em comparação com a cultura controlada não tratada. Neste gráfico, observa-se a simulação do conhecido impulso na mutação, coativação de EGFR e c-MET e aumento da taxa de proliferação e diminuição da taxa de apoptose em células HCC827, ao longo do tempo, refletindo uma resistência induzida por Gefitinibe que se correlaciona com a ativação de MEK e PI3K. De fato, a modelagem dos inibidores combinados de PI3K e MEK resulta em uma reversão do efeito de resistência anti-EGFR, uma redução na proliferação e na indução de apoptose.Seguindo este procedimento, outros métodos como Western Blot ou podem ser realizados para investigar vias de sinalização a jusante. Além disso, sistemas de co-cultura com diferentes tipos de células também podem ser usados para analisar a conversa cruzada entre várias células no microambiente tumoral. Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo do desenvolvimento de medicamentos explorarem a eficácia do medicamento em Silico.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como prever a eficácia do medicamento em grupos estratificados de pacientes, simulando mudanças de sinalização e analisando as respostas do sistema resultantes em diferentes mutações e origens.

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