A Tissue Combinada 3D Engineered

Os objetivos gerais deste modelo combinado de câncer de pulmão in vitro / in silico são estudar a sensibilidade das terapias direcionadas ao câncer de pulmão de células não pequenas e prever a eficácia de novas substâncias. Este sistema de modelo 3D permite o monitoramento de respostas específicas da célula a tratamentos direcionados ou combinações diretas. A principal vantagem desta técnica é que as previsões in Silico podem facilitar o teste pré-clínico de drogas em um ambiente mais relevante do ponto de vista fisiológico.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia de diferentes entidades tumorais, pois pode ser usada para otimizar as previsões de resposta a medicamentos com base em contextos mutacionais específicos. Demonstrando o procedimento estará, Franziska Schmitt, assistente de pesquisa, do nosso laboratório. Para configurar uma cultura dinâmica, comece cultivando o modelo de tumor em condições de cultura estática, em uma coroa de células a 37 graus Celsius e 5% de CO2, em uma incubadora convencional.

Após três dias, monte um biorreator autoclavado e insira um submucoso biológico do intestino delgado com sementes e um andaime de mucosa no sistema. Em seguida, adicione 45 mililitros de RPMI, complementados com a quantidade apropriada de FCS a um frasco e conecte o dispositivo de amostragem sem agulha ao sistema de tubulação entre o biorreator e o frasco do meio. Coloque o Biorreator na incubadora e conecte-o à bomba para cultivar o modelo de tumor, por mais 14 dias, com um fluxo médio constante de três mililitros por minuto.

Para tratar um modelo de tumor estático com Gefitinibe, no dia 11 de cultura na incubadora convencional, primeiro use uma pipeta pasteur para remover o meio antigo dos poços. Em seguida, adicione um mililitro de RPMI recém-preparado, complementado com FCS e Gefitinibe, no interior de cada coroa celular e 1,5 mililitros no fundo de cada poço. Para coletar as amostras de Elisa de uma cultura dinâmica, nos dias 11 a 14 de cultura, conecte a seringa ao dispositivo de amostragem e remova um mililitro de meio do sistema do biorreator.

Em seguida, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até que o Elisa seja realizado. Para determinar o número de núcleos positivos Ki67, primeiro use um microscópio invertido para obter cinco imagens fluorescentes de coloração DAPI e cinco Ki67 de culturas 2D com uma ampliação de 20 vezes de cada condição, a partir de seções não sobrepostas da amostra. Para contar manualmente os núcleos positivos Ki67, abra a imagem emergida em Fiji e selecione Plugins e Cell Counter, clique em inicializar, selecione um tipo de contador e clique em cada núcleo positivo Ki67.

O número de células clicadas aparecerá ao lado do tipo de contador selecionado. Para contagem automática de células do número total de núcleos nas imagens 2D, inicie o gravador de macros, abra uma imagem DAPI e clique em imagem, digite e 8 bits, clique em melhorar contraste e defina o parâmetro saturado como um e normalize. Para aumentar a nitidez da imagem, defina a máscara de nitidez, usando um raio de um e uma máscara de 60.

Para associar a imagem, clique em limite automático e escolha o método Reny/Entropy com objetos brancos em fundo preto. Em seguida, clique em Plugins, seguido de BioVoxxel, e feição irregular da bacia hidrográfica, com um raio de erosão de cinco para separar as células. Clique em analisar e analisar partículas e defina o tamanho como 02 infinito e marque resumir.

O número de células será mostrado na tabela de resumo como contagens. Em seguida, clique em criar para salvar a macro para permitir a contagem automática de núcleos, em outras imagens de cultura de células 2D. Depois de usar bancos de dados conhecidos para gerar uma rede de tumores, abra o software de análise de rede apropriado, clique em arquivo e novo e insira modelos de tumor jove.

Clique em ok, para gerar uma nova rede, depois clique, quadrado closeup North e ok, para visualizar o receptor em uma membrana dupla. Para visualizar os nós como retângulos, clique em proteína genérica, depois em EGFR, Ok.To rotular os nós na rede, clique com o botão direito do mouse para alterar a cor e a forma e defina os códigos de cores dos nós conforme indicado. Para visualizar os parâmetros de leitura como hexágonos, selecione fenótipo, insira proliferação e clique em ok.

Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione alterar cor e forma novamente para definir o código de cores para 255, 204, 204. Para visualizar as bordas das interações de nós, clique em transição de estado para setas de ativação e inibição para setas de inibição embotadas. Em seguida, clique em arquivo e salvar como, e salve a rede de sinalização gerada, como jove tumor models.xml.

Para análise de estado estacionário do equilíbrio do sistema, abra o software SQUAD, clique em carregar rede e carregue o arquivo models. xml tumor jove. Clique e execute a análise.

Para escrever um protocolo de simulação, clique em avançado e pertubador e, em seguida, clique em editar protocolo para simular a resistência anit-EGFR. Em seguida, clique em pertubação e selecione o estado inicial padrão igual ao estado estacionário quatro. Clique em adicionar para adicionar o novo pulso constante, selecione o parâmetro de estado e defina o alvo como FLIP, o tempo como zero e o valor como 4.

Clique em ok e defina os estados para c-MET e Gefitinibe, da mesma maneira. Para definir um valor de estado para o nó EGFR ativo, clique em nó ativo e, em seguida, clique em editar. Defina o estado como 8 e clique em ok.

Clique em ok para salvar o protocolo. Para exibir as curvas específicas, no painel de opções, selecione EGF-EGFR, estrela EGF-EGFR, estrela Mek, caspases, PI3K, Gegitinibe, apoptose, proliferação, inibidor de MEk e inibidor de PI3K. Em seguida, clique em inicializar e executar para iniciar uma simulação completa da resposta do sistema.

Para simular um tratamento combinado com inibidores de PI3K e Mek, clique em editar protocolo. Em seguida, usando o mesmo parâmetro de nó que acabamos de demonstrar, clique em pertubação, seguido de adicionar, para adicionar um novo pulso constante. Em seguida, selecione um parâmetro de estado e defina o alvo para inibidor de PI3K, o tempo para zero e o valor para um e clique em ok.

Clique em adicionar, novamente, para adicionar outro novo pulso constante e, no parâmetro de estado, defina o alvo para inibidor de Mek, defina o tempo para zero e o valor para um e clique em ok, seguido de ok novamente, para salvar o protocolo. No painel de opções, usando os mesmos nós para a representação gráfica demonstrada, clique em inicializar e execute para iniciar uma simulação completa da resposta do sistema. Em seguida, para finalizar a simulação, clique em redefinir.

Este sistema de teste de tumor 3D facilita a determinação do índice de proliferação. E a quantificação da apoptose usando M30 Elisa. Neste experimento representativo, por exemplo, apenas células tumorais HCC827 com mutação EGFR, incubadas em condições de cultura estática, responderam à inibição do fator de crescimento epidérmico.

Pelo inibidor da tirosina-quinase, Gefitinibe, como evidenciado pelo aumento da apoptose observado no sistema modelo de tumor HCC827. Aqui são mostradas imagens representativas de modelos tumorais 3D estáticos, com ou sem, indutor de transição epitelial-mesenquimal, simulação de TGF-beta-1. Observe o aumento da expressão de vimentina, nas culturas de células tumorais tratadas.

Em condições dinâmicas, o Gefitinibe exerce um efeito robusto nas células HCC827 com mutação EGFR, como evidenciado pela diminuição de estruturas semelhantes a tecidos, na presença do inibidor de tirosina-quinase, em comparação com a cultura controlada não tratada. Neste gráfico, observa-se a simulação do conhecido impulso na mutação, coativação de EGFR e c-MET e aumento da taxa de proliferação e diminuição da taxa de apoptose em células HCC827, ao longo do tempo, refletindo uma resistência induzida por Gefitinibe que se correlaciona com a ativação de MEK e PI3K. De fato, a modelagem dos inibidores combinados de PI3K e MEK resulta em uma reversão do efeito de resistência anti-EGFR, uma redução na proliferação e na indução de apoptose.

Seguindo este procedimento, outros métodos como Western Blot ou podem ser realizados para investigar vias de sinalização a jusante. Além disso, sistemas de co-cultura com diferentes tipos de células também podem ser usados para analisar a conversa cruzada entre várias células no microambiente tumoral. Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo do desenvolvimento de medicamentos explorarem a eficácia do medicamento em Silico.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como prever a eficácia do medicamento em grupos estratificados de pacientes, simulando mudanças de sinalização e analisando as respostas do sistema resultantes em diferentes mutações e origens.