assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais
10 de maio de 2016
Aqui apresentamos um protocolo para microdissecção assistida por laser de tipos específicos de células vegetais para perfil transcricional. Embora o protocolo seja adequado para diferentes espécies e tipos de células, o foco está nas células altamente inacessíveis da linha germinativa feminina, importantes para a reprodução sexual e apomítica no gênero de crucíferas Boechera.
O objetivo geral deste protocolo para LAM é isolar células vegetais específicas para a geração de RNA de alta integridade destinado à análise transcripcional. O foco está em células inacessíveis, como células-ovo, em espécies de boechera sexuais e apomíticas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da genética do desenvolvimento vegetal, como a base transcripcional que subjaz à reprodução sexual e assexuada de plantas por meio de sementes.
A principal vantagem desta técnica é que certos tipos específicos de estilos podem ser realizados, superando o efeito de mascaramento das transcrições de tipos celulares raros na análise de tecidos aterogênicos. Para iniciar este procedimento, utilize a estação de bloqueio para preencher uma bandeja plástica de equilíbrio, pré-aquecida e nova, com parafina derretida a 56 graus Celsius.
Levante a tampa do banho de parafina e pegue um cassete por vez. Transfira uma amostra para a parafina líquida a 56 °C em uma bandeja de equilíbrio. Proceda rapidamente para evitar o endurecimento da parafina ao redor da amostra durante o manuseio do cassete.
Em seguida, posicione a amostra de acordo com o delineamento experimental utilizando uma agulha de preparação. Repita o procedimento até que todas as amostras sejam transferidas. Para preparar cortes finos para LAM, em uma mesa iluminada, remova a parafina com a amostra da bandeja plástica.
Disseque um bloco de cera contendo a amostra, como um botão ou flor, usando uma lâmina de barbear livre de RNase. Em seguida, derreta uma pequena gota de cera de parafina na ponta de uma espátula. E use a cera quente para fixar o bloco com a amostra embutida no suporte.
Remova a cera extra ao redor da amostra com uma lâmina de barbear e certifique-se de que o bloco tenha uma superfície quadrada com bordas paralelas. Em seguida, ajuste a placa de aquecimento para 42 graus Celsius. Fixe a amostra ao micrótomo com segurança.
Prepare seções de sete micrômetros de espessura para as células do gametófito maduro de boechera. Em seguida, transfira as fitas de parafina com comprimento de 10 a 15 centímetros para uma caixa de plástico com papelão preto no fundo, antes de posicioná-las nas lâminas de LAM. Para preparar as lâminas para LAM, coloque de cinco a dez lâminas com moldura metálica sobre a placa aquecedora, com as superfícies planas voltadas para cima.
Pipete de um a dois mililitros de água livre de RNase na parte plástica das lâminas. Usando uma lâmina de barbear, corte as fitas de parafina em pedaços curtos de cerca de quatro a cinco centímetros. Comprimento suficiente para cobrir as janelas plásticas das lâminas.
Em seguida, utilize um par de pinças e uma agulha de preparação para posicionar as tiras de parafina paralelamente umas às outras na janela plástica das lâminas. Levante cuidadosamente as lâminas por uma extremidade para remover a água e coloque-as novamente. Cubra a placa de aquecimento com uma tampa plástica sem tocar nas lâminas e certifique-se de que a tampa plástica permita a troca de ar.
Seque as lâminas a 42 graus Celsius durante a noite. Sob uma capela química, desparafine as lâminas em xilol duas vezes, por 10 minutos cada vez. Certifique-se de submergir apenas a parte plástica das lâminas e mantenha a extremidade mais larga da estrutura metálica de cada lâmina seca para facilitar a remoção.
Deixe as lâminas secarem por 10 minutos na capela química antes da LAM. Neste procedimento, ligue o computador e o microscópio para a LAM. Em seguida, inicie o programa que controla o microscópio e o laser.
Ligue a caixa de controle do laser e ligue o laser pressionando o botão correspondente na caixa de controle. Em seguida, coloque uma tampa no suporte de tampas. Coloque o lâmina LAM sobre uma lâmina de vidro para microscopia e certifique-se de que a superfície plana da lâmina, com os tecidos fixados, esteja voltada para a lâmina de vidro.
Em seguida, coloque a lâmina no instrumento com a lâmina de vidro por baixo. Por fim, posicione o suporte da tampa com a tampa no instrumento. Selecione a objetiva de 4x.
No programa, mova a tampa para a posição superior. Em seguida, faça uma varredura da lâmina. Examine a lâmina e identifique as estruturas de interesse.
Localize e salve suas posições na lâmina para permitir o retorno à posição exata na etapa de corte. Em seguida, selecione uma objetiva apropriada. Verifique a posição do laser pressionando o botão de disparo do laser uma vez.
De preferência, em uma parte da membrana sem tecido. Com a tampa na posição para baixo, use a ferramenta de caneta para marcar os limites do tipo celular ou tecido de interesse. Por exemplo, a célula-ovo.
Disseque-o com o laser pressionando Cortar. Para isolar células individuais, é fundamental identificá-las claramente nas seções corretas. Além disso, as células devem ter um diâmetro de pelo menos oito micrômetros para tornar viável uma análise transcricional específica do tipo celular.
Observe que o seccionamento precisa ser repetido se a borda ao redor da célula não tiver sido completamente dissecada, o que normalmente pode ser visto na tela. Nesse caso, recomenda-se configurar o software para executar automaticamente duas repetições do seccionamento como padrão. Após isso, levante a tampa e mova para a próxima posição de salvamento com uma estrutura de interesse e disseque a próxima seção celular até que todas as células de interesse de um lâmina sejam coletadas.
Certifique-se de que a tampa esteja posicionada de forma que a nova seção adira a uma posição vazia na tampa. Após os tipos celulares de interesse de todos os lâminas terem sido isolados, remova a lâmina do instrumento. Coloque o suporte da tampa na posição inferior e inspecione visualmente a superfície da tampa.
E utilize o objetivo 4x para excluir contaminações inespecíficas da amostra. Em seguida, feche a tampa. E congele as seções secas a menos 80 graus Celsius até o uso posterior.
Aqui está o desenho esquemático do gametófito feminino maduro. Estas são seções finas de óvulos que contêm gametófitos femininos em boechera divaricarpa, nos quais as células-ovo são claramente identificáveis devido à morfologia característica do gametófito feminino. A qualidade do RNA foi semelhante à analisada nas seções das células-ovo em comparação com as áreas teciduais maiores colhidas dos mesmos lâminas como controles.
A qualidade do RNA obtida foi adequada para sequenciamento de RNA específico por tipo celular, levando à identificação de 236 genes expressos na célula-ovo apomítica, mas não na célula central apomítica, na célula sinérgide ou na célula inicial apomítica. Nem nas células do gametófito sexual maduro de Arabidopsis thaliana. Outros tipos celulares e tecidos de diferentes espécies podem ser analisados para responder a questões adicionais de genética do desenvolvimento.
Como, por exemplo, a base molecular da impressão genômica no endosperma e nos embriões de sementes de plantas. Após seu desenvolvimento, esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de genética do desenvolvimento e reprodução de plantas explorarem a base transcripcional da reprodução apomítica no gênero Boechera. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter RNA de alta qualidade para análises transcritômicas específicas de tipo celular utilizando microdissecção a laser.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método de microdissecção assistida por laser (LAM) para isolar células vegetais específicas, com foco nas células da linhagem germinativa feminina em espécies de Boechera. A técnica foi desenvolvida para gerar RNA de alta integridade para perfis transcricionais, auxiliando na compreensão da reprodução vegetal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Genética do desenvolvimento vegetal
- Perfilagem transcricional
- Biologia reprodutiva
Contexto
- O isolamento de células vegetais específicas é fundamental para o estudo da dinâmica transcricional.
- Células inacessíveis, como as células oosferas, são importantes para compreender a reprodução sexuada e a apomixia.
- Este método aborda os desafios na análise de tipos celulares raros.
- Ele fornece insights sobre a base transcricional da reprodução por meio de sementes.
Objetivo do Estudo
- Isolar células vegetais específicas para extração de RNA de alta integridade.
- Investigar os mecanismos transcricionais subjacentes à reprodução vegetal.
- Aprimorar a compreensão da reprodução sexual e assexuada em plantas.
Métodos Utilizados
- Técnica de microdissecção assistida por laser (LAM).
- Uso de uma estação de bloqueio e cera de parafina para o isolamento celular.
- Foco em células da linhagem germinativa feminina em espécies de Boechera.
- Análise transcricional de células isoladas.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de células ovulares de espécies de Boechera.
- RNA de alta integridade obtido para análises subsequentes.
- Informações sobre os perfis transcritômicos de células reprodutivas.
- O método demonstra potencial para aplicações mais amplas em genética vegetal.
Conclusões
- O protocolo LAM é eficaz para o isolamento de células vegetais específicas.
- Ele abre perspectivas para pesquisas em biologia reprodutiva de plantas.
- Essa técnica pode ajudar a elucidar a base genética da reprodução em plantas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microdissecção assistida por laser (LAM) permite o isolamento de RNA com alta integridade a partir de tipos celulares raros e de difícil acesso, como as células-ovo de plantas, solucionando um gargalo fundamental no perfilamento transcricional em genética do desenvolvimento. Ao fornecer dados transcriptômicos específicos de tipo celular, a LAM auxilia na redução mecanicista de riscos na validação de alvos e aumenta a confiança preditiva em fluxos de trabalho iniciais de descoberta. Essa capacidade é diretamente aplicável aos esforços de P&D em biofármacos focados na compreensão de sistemas biológicos complexos por meio da dissecção molecular precisa.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação da atividade transcricional em tipos celulares específicos para esclarecer a função gênica e o envolvimento de vias em processos biológicos.
- Valor Operacional: Reduz sinais confundidores provenientes de tecidos heterogêneos, melhorando a especificidade do alvo e a redução de riscos biológicos.
- Valor Preditivo: Apoia a identificação de alvos baseada em hipóteses, vinculando perfis moleculares a resultados fenotípicos em contextos celulares definidos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera insumos de RNA purificado adequados para ensaios transcricionais subsequentes, incluindo sequenciamento de RNA e qPCR, a partir de células microdissecadas.
- Valor Operacional: Estabelece um fluxo de trabalho reprodutível para preparação de amostras que mantém a integridade do RNA, permitindo desempenho consistente nos ensaios.
- Escalabilidade: Facilita a preparação de amostras biológicas validadas para campanhas de triagem de alto rendimento direcionadas a populações celulares raras.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta o perfilamento transcricional na fase de descoberta à validação pré-clínica, fornecendo insights moleculares específicos de tipo celular e relevantes para a doença.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia a identificação de assinaturas transcricionais que podem funcionar como biomarcadores preditivos ou farmacodinâmicos em modelos pré-clínicos.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de prosseguir ou não prosseguir com base na redução da incerteza mecanicista nas vias-alvo por meio de resolução celular precisa.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A LAM se insere na fase inicial da descoberta ao permitir o isolamento preciso de células-alvo antes da análise transcricional, apoiando a identificação de compostos promissores por meio de clareza mecanicista e orientando estudos pré-clínicos por meio de conjuntos de dados alinhados a biomarcadores.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir o perfilamento transcricional de tipos celulares específicos de interesse.
- Triagem: Produz extratos de RNA padronizados e de alta qualidade, adequados para ensaios transcricionais quantitativos e perfilamento da resposta a compostos.
- Análises: Fornece medidas de expressão gênica específicas por tipo celular que permitem comparação precisa entre condições experimentais e efeitos de tratamentos.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados moleculares de células isoladas à continuidade pré-clínica por meio de assinaturas transcricionais conservadas e validação funcional.
- Reutilização Empresarial: Representa uma capacidade de plataforma adaptável, aplicável em múltiplos projetos que estudam tipos celulares raros ou de difícil acesso em tecidos complexos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio de dados específicos de tipo celular.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade e a padronização do preparo de amostras para fluxos de trabalho transcricionais.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao permitir a eliminação precoce de riscos de alvos com base em um contexto biológico preciso.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos ao fornecer uma justificativa mecanicista mais clara para o avanço.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em histologia, microscopia e técnicas de dissecação a laser.
- Depende do acesso a sistemas de microdissecação a laser, ambientes livres de RNase e kits de extração de RNA compatíveis.
- Necessita padronização entre equipes para preparação de lâminas, corte e parâmetros de dissecação, a fim de garantir consistência.
- Deve levar em conta a variabilidade no rendimento e na qualidade do RNA ao trabalhar com tipos celulares pequenos ou frágeis, conforme observado no material de origem.
- Limitado pela necessidade de protocolos de corte e coloração otimizados para manter a morfologia do tecido e a integridade do RNA durante o processamento.
