Name: assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprenda a microdissecação assistida por laser para isolar células germinativas femininas de Boechera e obter RNA de alta integridade para análise transcricional em genética do desenvolvimento vegetal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) por fornecer sementes de Boechera divaricarpa e Sharon Kessler (Universidade de Oklahoma) por leitura crítica e revisão. O trabalho em análises de transcriptoma específico do tipo de célula para estudar o desenvolvimento de gametófitos e apomixia no laboratório da UG é apoiado pela Universidade de Zurique, por uma bolsa da "Deutsche Forschungsgemeinschaft" e pelo projeto Marie Curie IDEAGENA to AS, por bolsas da "Staatssekretariat für Bildung und Forschung" no âmbito da ação COST FA0903 (para UG e AS) e da Fundação Nacional Suíça (para UG).

<ol><li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaheshwari%2C+P+%22An+Introduction+to+the+Embryology+of+Angiosperms%22">An Introduction to the Embryology of Angiosperms</a>. , McGraw-Hill. New York. (1950).</li>
<li>Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillemse%2C+MTM+%22Embryology+of+Angiosperms%22">Embryology of Angiosperms</a>. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).</li>
<li>Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomixis%3A+Molecular+strategies+for+the+generation+of+genetically+identical+seeds+without+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization.</a> Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).</li>
<li>Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomixis+-+the+asexual+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apomixis - the asexual revolution.</a> Science. 274, 1322-1323 (1996).</li>
<li>Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+future+for+apomixis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A bright future for apomixis.</a> Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).</li>
<li>Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+germline+formation%3A+molecular+insights+define+common+concepts+and+illustrate+developmental+flexibility+in+apomictic+and+sexual+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction.</a> Development. 142, 229-241 (2015).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomictic+and+sexual+germline+development+differ+with+respect+to+cell+cycle%2C+transcriptional%2C+hormonal+and+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+GENET%22%5BJournal%5D)">Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation.</a> PLOS GENET. 10, e1004476(2014).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarging+cells+initiating+apomixis+in+Hieractium+praealtum+transition+to+an+embryo+sac+program+prior+to+entering+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis.</a> Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).</li>
<li>Wuest, S. E., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+microdissection+applied+to+floral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted microdissection applied to floral tissues.</a> Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).</li>
<li>Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+expression+profiling+of+rare+cell+types+as+exemplified+by+its+impact+on+our+understanding+of+female+gametophyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).</li>
<li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20, 1-7 (2010).</li>
<li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+plant+cells+from+tape-transferred+paraffin+sections+promotes+recovery+of+structurally+intact+RNA+for+global+gene+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling.</a> Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).</li>
<li>Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+BIOL%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155(2011).</li>
<li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLOS ONE. 7, e29685(2012).</li>
<li>Mau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+apomicts+trapped+in+the+ecological+niches+of+their+sexual+ancestors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors.</a> Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).</li>
<li>Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+in+transcriptionally+active+regions+of+sexual+and+apomictic+Boechera.+demonstrates+independently+derived+apomictic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages.</a> Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).</li>
<li>Corral, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li>
<li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li>
<li>Schmid, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genome+Scale+Quantitative+Biology+in+Arabidopsis+thaliana%22">Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo é adequado para celulares diferentes e tipos de tecidos LAM combinado com transcriptoma analisa por microarrays ou RNA-Seq é uma ferramenta valiosa para obter insights sobre os padrões específicos de atividade dos genes que regulam os processos de desenvolvimento ou fisiológicos 7-11,13,14. No entanto, a adequação deste método para qualquer dado tipo de célula está criticamente dependente de problemas estruturais. A célula deve ser claramente visível e...

Em estudos de transcrição feito ao nível dos tecidos, os transcriptomes de tipos de células altamente especializadas, mas raros são muitas vezes mascarados pelas células vizinhas mais abundantes. Um exemplo para tais tipos de células altamente especializadas são as células da linhagem reprodutor feminino (linha germinal) em plantas. A linha germinal feminina é especificada dentro de óvulos em desenvolvimento, os precursores de sementes no interior do gineceu do 1,2 flor. O saco embrionário (MMC), é a primeira célula da linha germinativa feminina. Ele sofre meiose para formar uma tétrade de megásporos reduzidos. Tipicamente, apenas uma destas megásporos sobrevive e divide mitoticamente sem citocinese, ou seja, em um sincício. Estes são seguidos por mitoses celularização para formar o gametófito madura, que, tipicamente, consiste em quatro tipos de células: três antípodas, duas células synergid, o ovo, e a célula central. Os óvulos e centrais são os gametas femininos que são fecundados por dois espermatozóides durante doufertilização vel para dar origem ao embrião e do endosperma da semente em desenvolvimento 1,2. No sistema modelo de Arabidopsis thaliana sexual, apenas ~ 50 sementes se desenvolvem por flor, enquanto cerca de 50-80 sementes se desenvolvem por flor no género intimamente relacionado Boechera. Assim, a linha germinativa feminina consiste de apenas alguns tipos de células altamente especializadas, tornando-a um excelente modelo para estudar processos de desenvolvimento, tais como a especificação e diferenciação celular. Além disso, insights sobre os processos de regulação de genes que regulam a reprodução de plantas pode ser de valor aplicada. Nas plantas, tanto a reprodução sexuada e assexuada através de sementes (apomixia) pode ocorrer. Enquanto a reprodução sexual gera diversidade genética numa população, apomixia, conduz à formação de prole clonal que é geneticamente idênticas à planta mãe. Portanto, apomixia tem um grande potencial para aplicações na agricultura e produção de sementes, como genótipos maternos mesmo complexo podeser mantido inalterado ao longo de várias gerações 3,4,5. Porque apomixia não ocorrem naturalmente em qualquer um dos principais espécies cultivadas, a engenharia de apomixia em culturas é de grande interesse 3,4,5. No entanto, este objectivo a longo prazo é difícil de conseguir porque a base genética e molecular subjacente de apomixia não é entendida em detalhe suficiente 6. Para obter insights sobre a base de transcrição que regulam a reprodução apomítica, de tipo específico de células de perfil transcricional usando microdissection assistida por laser (LAM) e ao lado sequenciamento geração (NGS) representa uma abordagem muito poderosa 7,8. LAM foi estabelecido pela primeira vez em animais e investigação biomédica. Nos últimos anos LAM também tem sido aplicada a biologia da planta 6,9,10. Em contraste com outros métodos que permitem a criação de perfil de tipos de células e tecidos individuais, LAM não requer a geração de linhas marcadoras 6,9,10. Portanto, ele pode ser appmentiu para qualquer tipo de célula ou tecido sem o conhecimento molecular antes. Outra vantagem da LAM é que ele pode ser aplicado a qualquer tipo de célula, desde que a célula pode ser reconhecido nas secções a seco com base na posição e / ou características estruturais. LAM tem a vantagem adicional de que os tecidos fixos são usados, o que impede que as alterações do perfil da transcrição durante o processamento. O tecido de interesse, por exemplo, tecido floral, é fixado num fixador não reticulado antes da inclusão em parafina. Incorporação em cera de parafina pode ser feito manualmente, seguindo protocolos estabelecidos 9,11. No entanto, a utilização de um processador automatizado de tecidos para a desidratação e infiltração com a cera resulta geralmente em maior reprodutibilidade em termos da conservação da qualidade do ARN e morfologia do tecido. A estratégia alternativa de incorporação de tecidos em resina também foi usada com sucesso para análises específicas do tipo de células por LAM 8. No entanto, a utilização de um automprocessador de tecidos ated para a incorporação em cera é muito tempo eficiente, como muitas amostras podem ser processadas ao mesmo tempo que exige um mínimo de mãos no tempo. Enquanto tipicamente sem perda significativa de qualidade de ARN ocorre durante a fixação e a incorporação, a preparação de secções finas com o micrótomo e, em particular, a montagem nas frameslides utilizados para LAM continua a ser um passo crítico para a conservação da qualidade do ARN. Isto tem sido observado anteriormente e a utilização de um sistema de transferência de fita foi descrita para resultar em melhor qualidade de ARN nesta etapa 12. No entanto, esta acrescenta um passo adicional demorada durante a preparação das lâminas e também requer equipamento especial. O protocolo otimizado descrito abaixo reproducibly produz RNA que é de qualidade suficiente para o perfil transcricional com GeneCHIPs e Next Generation Sequencing (NGS) se aproxima 7,11,13,14. Além disso, com o microscópio microdissecação laser utilizado, um elevado grau de pureza dos tipos de células isoladas é derrotainely produzida 7,11,13,14. O gênero Boechera é um excelente sistema modelo para estudar as principais etapas de reprodução apomítica. Em Boechera, uma variedade de diferentes acessos sexuais e apomíticas foram identificados e podem ser usados ​​para comparar as 15,16,17. Numa comparação de transcriptomes específicos do tipo de célula de células da linha germinativa feminina de Arabidopsis sexual e apomítico Boechera, foram identificados genes e vias que são expressos diferencialmente, identificando assim novos aspectos dos processos de regulação que regula apomixis 7. Além disso, este estudo verificou a adequação de LAM para transcrição específicos do tipo de célula análises de tipos de células pequenas e raras. Já têm utilizado este protocolo para a análise de diferentes tipos de células numa variedade de espécies de plantas, mas de espécies de modificações e específicos de tecidos para o protocolo pode ser necessária em certos casos.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>1.009.861.000</td><td>absoluto EMPROVE Ph Eur, BP, USP</td></tr><tr><td>15 ml tubos de centrífuga de falcão</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalisador</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% Biologia Molecular grau</td></tr><tr><td>Ambion Nuclease livre de</td><td>água tecnologias</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>ASP200 S</td><td>Leica</td><td>14048043624</td><td>processador de tecidos&nbsp;</td></tr><tr><td>papelão</td><td></td><td></td> preto <td>pode ser comprado em papelarias especiais</td></tr><tr><td>Lâminas de moldura sem DNA e RNAse</td><td>Micro Dissect GmbH</td><td></td><td>1, 4 &micro; m PET-membrana; também pode ser comprado na Leica</td></tr><tr><td>Dumond Fórceps</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>lâmpada</td><td></td><td></td><td></td>de etanol</tr><tr><td>exsiccator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z354074-1EA</td><td>Nalgene Vaccuum Dessecator ou equipamento similar</td></tr><tr><td>pontas de filtro 10&nbsp; &micro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>pode ser substituído por pontas semelhantes</td></tr> pontas <tr><td>de filtro 1.000&nbsp; &micro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>pode ser substituído por pontas de</td></tr><tr><td>filtro semelhantes 20&nbsp; &micro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60020</td><td>pode ser substituído por pontas de filtro de pontas semelhantes</td></tr><tr><td>200&nbsp; &micro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60200</td><td>pode ser substituído por pontas semelhantes</td></tr><tr><td>fórceps de precisão</td><td>VWE</td><td>232-1221</td><td></td></tr><tr><td>suporte de lâmina de vidro</td><td>Huber & Co.AG</td><td>10.0540.01</td><td>F&auml; rbek&auml; Mancha de vidro Hellendahl</td></tr><tr><td>através de Huber</td><td>& Co.AG</td><td>10.0570.01</td><td>F&auml; Módulo</td></tr> de <tr><td>Incorporação de Parafina Aquecida</td> rbekasten Leica <td>Leica</td><td>Leica EG 1150 H</td><td>estação de bloqueio, dispositivos semelhantes são adequados</td></tr><tr><td>Mesa de Aquecimento e Secagem</td><td>Medax</td><td>15501</td><td>outros modelos e/ou fornecedores são adequados</td></tr><tr><td>balde de</td><td>gelo VWR balde de gelo com tampa&nbsp;</td><td>10146-184</td><td>baldes semelhantes mesa</td></tr><tr><td>de luz</td> igualmente adequada <td>UVP Uma empresa analítica Jena</td><td>TW-26&nbsp;</td><td>transluminador de luz branca</td></tr><tr><td>lâmina de microscópio</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td> lâmina de micrótomo de <td>bordas cortadas</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>FEAHS35</td><td>lâmina de micrótomo S35 descartável</td></tr><tr><td>MMI Cell Cut Plus Instrument</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuge antiaderentes, sem RNAse, tecnologias</td><td>de vida</td><td>de</td> 2 ml AM12475 <td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Roth</td><td>X882.2</td><td>para histologia</td></tr><tr><td>Kit de isolamento de RNA PicoPure</td><td>tecnologias de vida</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure RNA Kit</td></tr> de <tr><td>isolamento bandejas de equilíbrio de plástico</td><td>Semadeni AG</td><td>2513</td><td></td></tr><tr><td>caixa de plástico</td><td>Semadeni AG</td><td>2971</td><td>Plastikdose PS</td></tr><tr><td>tampa de plástico para placa</td><td></td><td></td> de aquecimento <td>agulha de</td></tr><tr><td>preparação</td> caseira <td>VWR</td><td>631-7159</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Kit Pico</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga livre de RNAse</td><td>life technologies</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Descontaminação ZAP de RNAse</td><td>life technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo Rotativo Semi-automatizado&nbsp;</td><td>Dispositivos semelhantes Leica</td><td>RM2245</td><td>são igualmente adequados</td></tr><tr><td>de tela Tissue Loc Histo</td><td>C-1000_AQ Thermo Scientific</td><td></td><td>semelhantes de outros fornecedores são adequados</td></tr><tr><td>Tubos com tampa adesiva, sem difusor 500 &micro; l&nbsp;</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td>50204</td><td></td></tr><tr><td>Xilol (Isômero) ROTIPURAN</td><td>VWR</td><td>4436.2</td><td>min. 99%, p.a., ACS,</td></tr><tr><td>de incorporação de processo</td> ISO SP <td>Leica</td><td>14039440000</td><td>Leica Jet I sem tampa</td></tr><tr><td>Forno Universal</td><td>Memmert</td><td>UF55</td><td>outros modelos e/ou fornecedores são adequados</td></tr></tbody></table>

assistida por laser microdissecção (lam) como ferramenta para transcricional profiling de tipos de células individuais

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

A compreensão dos processos de desenvolvimento no nível molecular requer insights sobre a regulação transcricional e, portanto, o transcriptoma, no nível de tipos de células individuais. Embora os métodos descritos aqui sejam geralmente aplicáveis a uma ampla gama de espécies e tipos de células, nossa pesquisa se concentra na reprodução de plantas. O cultivo de plantas e a produção de sementes são de importância crucial para a nutrição humana e animal. Uma compreensão detalhada das redes regulatórias que governam a formação da linhagem reprodutiva (linha germinativa) e, em última análise, das sementes é uma pré-condição para a manipulação direcionada da reprodução das plantas. Em particular, a engenharia da apomixia (reprodução assexuada por meio de sementes) em plantas cultivadas promete grandes melhorias, pois leva à formação de sementes clonais geneticamente idênticas à planta-mãe. Consequentemente, os tipos de células da linha germinativa feminina são de grande importância para a compreensão e engenharia da apomixia. No entanto, como as células correspondentes estão profundamente incorporadas nos tecidos florais, elas são muito difíceis de acessar para análises experimentais, incluindo transcriptômica específica do tipo de célula. Para superar essa limitação, seções de células individuais podem ser isoladas por microdissecção assistida por laser (LAM). Embora o LAM em combinação com o perfil transcricional permita a identificação de genes e vias ativas em qualquer tipo de célula com alta especificidade, estabelecer um protocolo adequado pode ser um desafio. Especificamente, a qualidade do RNA obtido após o LAM pode ser comprometida, especialmente quando células pequenas e únicas são direcionadas. Para contornar esse problema, estabelecemos um fluxo de trabalho para LAM que resulta de forma reprodutível em alta qualidade de RNA que é bem adequada para transcriptômica, como exemplificado aqui pelo isolamento de células da linha germinativa feminina em Boechera apomítica. Neste protocolo, são descritos procedimentos para preparo de tecidos e LAM, também no que diz respeito à extração de RNA e controle de qualidade.

Preparação de Amostras e LAM são feitas em etapas consecutivas Um número de passos consecutivos são necessários para preparar ARN para a análise da transcrição a partir de tipos de células seleccionadas pela LAM (Figura 1). Isto começa com a colheita das flores e a fixação imediata para assegurar que a população de RNA permanece inalterado após a colheita. O tecido é incorporado, em corte, e m...

Aqui apresentamos um protocolo para microdissecção assistida por laser de tipos específicos de células vegetais para perfil transcricional. Embora o protocolo seja adequado para diferentes espécies e tipos de células, o foco está nas células altamente inacessíveis da linha germinativa feminina, importantes para a reprodução sexual e apomítica no gênero de crucíferas Boechera.

assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

O objetivo geral deste protocolo para LAM é isolar células vegetais específicas para a geração de RNA de alta integridade destinado à análise transcripcional. O foco está em células inacessíveis, como células-ovo, em espécies de boechera sexuais e apomíticas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da genética do desenvolvimento vegetal, como a base transcripcional que subjaz à reprodução sexual e assexuada de plantas por meio de sementes.A principal vantagem desta técnica é que certos tipos específicos de estilos podem ser realizados, superando o efeito de mascaramento das transcrições de tipos celulares raros na análise de tecidos aterogênicos. Para iniciar este procedimento, utilize a estação de bloqueio para preencher uma bandeja plástica de equilíbrio, pré-aquecida e nova, com parafina derretida a 56 graus Celsius.Levante a tampa do banho de parafina e pegue um cassete por vez. Transfira uma amostra para a parafina líquida a 56 °C em uma bandeja de equilíbrio. Proceda rapidamente para evitar o endurecimento da parafina ao redor da amostra durante o manuseio do cassete.Em seguida, posicione a amostra de acordo com o delineamento experimental utilizando uma agulha de preparação. Repita o procedimento até que todas as amostras sejam transferidas. Para preparar cortes finos para LAM, em uma mesa iluminada, remova a parafina com a amostra da bandeja plástica.Disseque um bloco de cera contendo a amostra, como um botão ou flor, usando uma lâmina de barbear livre de RNase. Em seguida, derreta uma pequena gota de cera de parafina na ponta de uma espátula. E use a cera quente para fixar o bloco com a amostra embutida no suporte.Remova a cera extra ao redor da amostra com uma lâmina de barbear e certifique-se de que o bloco tenha uma superfície quadrada com bordas paralelas. Em seguida, ajuste a placa de aquecimento para 42 graus Celsius. Fixe a amostra ao micrótomo com segurança.Prepare seções de sete micrômetros de espessura para as células do gametófito maduro de boechera. Em seguida, transfira as fitas de parafina com comprimento de 10 a 15 centímetros para uma caixa de plástico com papelão preto no fundo, antes de posicioná-las nas lâminas de LAM. Para preparar as lâminas para LAM, coloque de cinco a dez lâminas com moldura metálica sobre a placa aquecedora, com as superfícies planas voltadas para cima.Pipete de um a dois mililitros de água livre de RNase na parte plástica das lâminas. Usando uma lâmina de barbear, corte as fitas de parafina em pedaços curtos de cerca de quatro a cinco centímetros. Comprimento suficiente para cobrir as janelas plásticas das lâminas.Em seguida, utilize um par de pin&ccedil;as e uma agulha de prepara&ccedil;&atilde;o para posicionar as tiras de parafina paralelamente umas &agrave;s outras na janela pl&aacute;stica das l&acirc;minas. Levante cuidadosamente as l&acirc;minas por uma extremidade para remover a &aacute;gua e coloque-as novamente. Cubra a placa de aquecimento com uma tampa pl&aacute;stica sem tocar nas l&acirc;minas e certifique-se de que a tampa pl&aacute;stica permita a troca de ar.Seque as lâminas a 42 graus Celsius durante a noite. Sob uma capela química, desparafine as lâminas em xilol duas vezes, por 10 minutos cada vez. Certifique-se de submergir apenas a parte plástica das lâminas e mantenha a extremidade mais larga da estrutura metálica de cada lâmina seca para facilitar a remoção.Deixe as lâminas secarem por 10 minutos na capela química antes da LAM. Neste procedimento, ligue o computador e o microscópio para a LAM. Em seguida, inicie o programa que controla o microscópio e o laser.Ligue a caixa de controle do laser e ligue o laser pressionando o botão correspondente na caixa de controle. Em seguida, coloque uma tampa no suporte de tampas. Coloque o lâmina LAM sobre uma lâmina de vidro para microscopia e certifique-se de que a superfície plana da lâmina, com os tecidos fixados, esteja voltada para a lâmina de vidro.Em seguida, coloque a lâmina no instrumento com a lâmina de vidro por baixo. Por fim, posicione o suporte da tampa com a tampa no instrumento. Selecione a objetiva de 4x.No programa, mova a tampa para a posição superior. Em seguida, faça uma varredura da lâmina. Examine a lâmina e identifique as estruturas de interesse.Localize e salve suas posições na lâmina para permitir o retorno à posição exata na etapa de corte. Em seguida, selecione uma objetiva apropriada. Verifique a posição do laser pressionando o botão de disparo do laser uma vez.De preferência, em uma parte da membrana sem tecido. Com a tampa na posição para baixo, use a ferramenta de caneta para marcar os limites do tipo celular ou tecido de interesse. Por exemplo, a célula-ovo.Disseque-o com o laser pressionando Cortar. Para isolar células individuais, é fundamental identificá-las claramente nas seções corretas. Além disso, as células devem ter um diâmetro de pelo menos oito micrômetros para tornar viável uma análise transcricional específica do tipo celular.Observe que o seccionamento precisa ser repetido se a borda ao redor da célula não tiver sido completamente dissecada, o que normalmente pode ser visto na tela. Nesse caso, recomenda-se configurar o software para executar automaticamente duas repetições do seccionamento como padrão. Após isso, levante a tampa e mova para a próxima posição de salvamento com uma estrutura de interesse e disseque a próxima seção celular até que todas as células de interesse de um lâmina sejam coletadas.Certifique-se de que a tampa esteja posicionada de forma que a nova seção adira a uma posição vazia na tampa. Após os tipos celulares de interesse de todos os lâminas terem sido isolados, remova a lâmina do instrumento. Coloque o suporte da tampa na posição inferior e inspecione visualmente a superfície da tampa.E utilize o objetivo 4x para excluir contaminações inespecíficas da amostra. Em seguida, feche a tampa. E congele as seções secas a menos 80 graus Celsius até o uso posterior.Aqui está o desenho esquemático do gametófito feminino maduro. Estas são seções finas de óvulos que contêm gametófitos femininos em boechera divaricarpa, nos quais as células-ovo são claramente identificáveis devido à morfologia característica do gametófito feminino. A qualidade do RNA foi semelhante à analisada nas seções das células-ovo em comparação com as áreas teciduais maiores colhidas dos mesmos lâminas como controles.A qualidade do RNA obtida foi adequada para sequenciamento de RNA específico por tipo celular, levando à identificação de 236 genes expressos na célula-ovo apomítica, mas não na célula central apomítica, na célula sinérgide ou na célula inicial apomítica. Nem nas células do gametófito sexual maduro de Arabidopsis thaliana. Outros tipos celulares e tecidos de diferentes espécies podem ser analisados para responder a questões adicionais de genética do desenvolvimento.Como, por exemplo, a base molecular da impressão genômica no endosperma e nos embriões de sementes de plantas. Após seu desenvolvimento, esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de genética do desenvolvimento e reprodução de plantas explorarem a base transcripcional da reprodução apomítica no gênero Boechera. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter RNA de alta qualidade para análises transcritômicas específicas de tipo celular utilizando microdissecção a laser.

laser-assisted-microdissection-lam-as-tool-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Laser Microdissecção Captura de tecidos de mamíferos

Microdissecção a laser foi aplicado para analisar perfil de expressão gênica em compartimentos específicos de Drosophila disco asa submetido a RNAi...

Microdissecção a laser Aplicada ao perfil de expressão gênica de subconjunto de células a partir do Drosophila Asa Disco

Nós descrevemos como usar microdissecção a laser de captura (LCM) para obtenção das populações enriquecidas de neurônios do hipocampo ou neurônios individuais a partir de cortes congelados do cérebro do rato feridos para posterior análise de expressão de genes usando quantitativa PCR em tempo real e / ou do genoma inteiro microarrays.

Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

O isolamento de neurônios de dopamina individuais ou a área tegmental ventral com imunohistoquímica direta ou indireta é demonstrada usando captura a laser microdissection. São discutidos os parâmetros para o isolamento de tecido a partir de uma lâmina de vidro usando um laser de infravermelhos e a partir de lâminas de membrana usando a combinação de um laser infravermelho e ultravioleta.

Captura Laser Microdissection - uma demonstração do Isolamento de Pessoa dopamina Neurônios e região ventral tegmental Entire

O objetivo deste protocolo é usar a microdissecção por captura a laser como um método eficaz para isolar populações puras de tipos de células de tecidos heterogêneos da próstata para análise de RNA a jusante.

Captura de Laser Microdissection de Próstata Humano Epithelium para Análise de RNA

Muitos genes importantes para o desenvolvimento têm padrões de expressão específicos de células ou tecidos. Este artigo descreve experimentos de LM RNA-seq para identificar genes que são diferencialmente expressos no limite lâmina da folha do milho e em mutantes lg1-R em comparação com o tipo selvagem. As considerações experimentais discutidas aqui se aplicam a análises transcriptômicas de outros fenômenos de desenvolvimento.

Projeto Experimental de Laser Microdissecção RNA-Seq: Lições de uma análise do desenvolvimento foliar do milho

A microdissecção a laser (LMD) é uma técnica sensível e altamente reprodutível que pode ser usada para descobrir caminhos que mediam a heterogeneidade e invasão do glioma. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar áreas discretas do tecido glioma usando LMD a laser seguido de análise transcritiva.

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

Apresentado aqui é um protocolo para microdisseção de captura a laser (LCM) de tecidos vegetais. LCM é uma técnica microscópica para isolar áreas de tecido de forma livre de contaminação. O procedimento inclui fixação tecidual, incorporação de parafina, secção, LCM e extração de RNA. O RNA é usado na análise temporalmente resolvida do tecido a jusante dos transcriptomes.

Microdissection laser RNA-Sequenciamento para Análise de Expressão Genética Espacial e Temporal-Específica do Tecido em Plantas

Um protocolo é descrito que usa microdissecção a laser para isolar tecidos nematoides individuais para sequenciamento de RNA. O protocolo não exige kits de ferramentas genéticas específicos para espécies, permitindo que perfis de expressão genética sejam comparados entre diferentes espécies ao nível de amostras de tecido único.

Microdisseção a laser para aplicações de tecido único agnóstico de espécies

A microdissecção por captura a laser de tecidos de fibrose submucosa oral permite a extração precisa de células de regiões histológicas de interesse para a análise de dados multi-ômicos com informações morfológicas e espaciais.

Isolamento de Células com Informações Morfológicas e Espaciais de Amostras de Fibrose Submucosa Oral por Microdissecção por Captura a Laser

Este protocolo descreve um método para isolar RNA de regiões histológicas definidas de tecido hepático de camundongo, fixado com paraformaldeído, composto de Temperatura Ótima de Corte, utilizando microdissecação por captura a laser, permitindo análise direcionada de expressão gênica a jusante.

Microdissecação por captura a laser de tecido hepático de camundongo fixado com paraformaldeído para análise de RNA

Aprenda a microdissecação assistida por laser para isolar células germinativas femininas de Boechera e obter RNA de alta integridade para análise transcricional em genética do desenvolvimento vegetal.

assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais

Explorar mais vídeos