Usando folha de luz microscopia de fluorescência para Imagem Desenvolvimento Zebrafish Eye

O objetivo geral deste protocolo experimental é obter imagens do desenvolvimento ocular do embrião de peixe-zebra no microscópio de folha de luz e processar o conjunto de dados multiview adquirido em Figi por meio do plug-in do aplicativo de reconstrução multiview. Este método pode ajudá-lo a entender os eventos morfogenéticos no desenvolvimento animal. A principal vantagem deste método é que você pode observar eventos morfogenéticos no embrião em desenvolvimento com alta resolução espacial e temporal.

A principal vantagem da microscopia de folha de luz é a baixa fototoxicidade do método, o rápido tempo de aquisição com o qual você pode obter imagens da amostra e que você pode obter imagens da amostra de vários ângulos, as chamadas visualizações. Capturar a amostra de diferentes visualizações nos permite superar a degradação do sinal e do eixo definido. Essas diferentes imagens podem ser usadas e registradas usando microesferas fluorescentes ao redor da amostra.

Podemos reconstruir o volume tridimensional atingindo a resolução isotrópica. Embora demonstremos o uso de microscopia de fluorescência de folha de luz para o desenvolvimento do olho do peixe-zebra, esse método também pode ser usado para responder a várias perguntas em biologia do desenvolvimento e neurociência usando vários organismos modelo. Para começar, aparafuse a objetiva de detecção no microscópio, mantendo as objetivas de iluminação cobertas.

Em seguida, destampe as objetivas e deslize cuidadosamente a câmara de amostra para dentro do microscópio. Prenda a câmara apertando o parafuso. Em seguida, conecte a sonda de temperatura e o bloco peltier ao microscópio.

Os dois tubos que circulam o líquido refrigerante para o bloco peltier são compatíveis com ambos os conectores e podem funcionar em qualquer orientação. Em seguida, use uma seringa para carregar a câmara através da seringa com solução até a borda superior das janelas da câmara e verifique se há vazamentos. Agora, ligue o microscópio, o computador e a incubação.

Inicie o software operacional do microscópio e ajuste a temperatura de incubação para 28.5 graus Celsius. Enquanto a temperatura requilabrate por uma hora, prepare a amostra. Comece preparando a agarose.

Derreta uma alíquota preparada de um mililitro de 1% de agarose de baixo ponto de fusão em E três meio a 70 graus Celsius. Após cerca de 15 minutos, transfira 600 microlitros de agarose derretida para um tubo novo de 1,5 mililitro e adicione 250 microlitros de E três meios, 50 microlitros de 0,4% MS 222 e 25 microlitros de solução de estoque de esferas fluorescentes de vórtice. Coloque o tubo em um bloco de aquecimento a cerca de 39 graus Celsius para permitir que a agarose se aproxime de seu ponto de gelificação.

Em seguida, empurre os êmbolos com ponta de Teflon para baixo até a parte inferior dos capilares de vidro de um milímetro de diâmetro interno. Prepare cinco deles. Agora, faça um vórtice breve da mistura de agarose e, em seguida, transfira cinco embriões com a quantidade mínima de líquido para ela.

Em seguida, insira um capilar e aspire uma cabeça de embrião primeiro. A cabeça deve entrar antes da cauda e não pode haver bolhas de ar. Retire solução suficiente para que haja cerca de dois centímetros de agarose acima do embrião e um centímetro de agarose abaixo dele.

Desenhe um embrião em cada capilar antes de prosseguir. Esta etapa requer alguma prática para dominar. Prepare-se para isso usando embriões não valiosos.

Quando a agarose solidificar completamente, armazenar as amostras em meio E três, transportando os capilares para uma parede de béquer com plasticina com a abertura inferior em solução. Agora monte o porta-amostras. Primeiro, insira duas mangas de plástico do tamanho certo uma contra a outra na haste.

As fendas nas mangas devem estar voltadas para fora. Em seguida, prenda um parafuso de fixação. E insira o capilar através do suporte até que a faixa preta fique visível do outro lado.

Evite tocar no êmbolo. Em seguida, aperte o parafuso de fixação. Em seguida, empurre um centímetro de agarose para fora do capilar e corte-o.

Em seguida, insira a haste no disco porta-amostras. Antes de carregar o disco de amostra, verifique se o stage está na posição superior no software de controle. Em seguida, use trilhos de guia para deslizar o suporte e a amostra para o microscópio.

Agora, crie uma imagem da amostra escolhida conforme descrito no protocolo de texto. O processamento de dados é feito em Figi. É uma distribuição do ImageJ.

Antes de começar, o Figi deve ser atualizado. Salve o conjunto de dados de imagem adquirida em uma única pasta. Os arquivos intermediários do processamento da imagem serão salvos na mesma pasta.

Agora, inicie o aplicativo de reconstrução de várias visualizações. Em seguida, defina um novo conjunto de dados. Selecione a opção Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats e crie um nome para o arquivo de dados de saída.

Em seguida, selecione o primeiro arquivo CZI do conjunto de dados. Os metadados serão carregados automaticamente. Nos metadados da imagem, verifique se o número de ângulos, os canais, as iluminações e o tamanho do voxel estão todos definidos corretamente.

Ao pressionar OK, uma janela de log, a janela do explorador de configuração de exibição e uma janela do console são abertas. O explorador de configuração de exibição fornece uma interface amigável. Selecione os arquivos que precisam ser processados e pressione o botão direito do mouse.

Uma nova janela será aberta mostrando as diferentes etapas de processamento à medida que são executadas. No canto superior direito estão os botões de informações e salvar. Informações exibe um resumo do conteúdo do arquivo de dados salvo e pressionar salvar salvará os resultados do processamento.

Caso contrário, o programa não grava os resultados das etapas de processamento. Para salvar novamente todo o conjunto de dados, primeiro selecione todos os arquivos pressionando Ctrl+A e clicando com o botão direito. Em seguida, selecione Salvar novamente o conjunto de dados e Como HDF5.

Uma confirmação da ação de salvar novamente deve ser marcada. Após alguns minutos, para cada ponto de tempo, o programa indicará quando o salvamento for concluído. Em seguida, prossiga com a detecção de pontos de interesse nos dados.

Selecione todos os pontos de tempo pressionando Ctrl+A e clique com o botão direito do mouse. Para selecionar, detecte pontos de interesse. Nas opções, selecione diferença-de-gaussiana.

E selecione, diminua as imagens de amostra antes da segmentação. Na próxima janela, escolha as configurações de detecção. Nas opções de localização de subpixel, selecione Ajuste quadrático tridimensional.

Em seguida, na especificação do ponto de interesse, selecione interativo. Para a opção XY de redução da amostra, selecione corresponder à resolução Z. E para a amostra Z para baixo, selecione 1x.

Em seguida, execute a operação selecionando a opção computar na CPU Java. Na janela pop-up, selecione uma visualização para testar os parâmetros. Depois que a exibição for carregada, ajuste o brilho e o contraste pressionando Ctrl+Shift+C no teclado.

Além disso, para detecção de contas, alterne a opção de aparência de verde máximo. Agora observe a segmentação como anéis verdes ao redor das detecções. Ajuste os valores de diferença de gaussien para sigma um e parâmetros de limite para segmentar de forma ideal as contas com o número mínimo de falsos positivos.

Cada conta deve ser detectada apenas uma vez. Depois de determinar os parâmetros ideais, pressione concluído. Depois que o computador carrega, cada visualização individual do ponto de tempo e segmenta as contas, o programa gera um arquivo de log com o número de contas detectadas por visualização.

Deve haver entre 600 e vários milhares de contas por visualização. Caso contrário, os parâmetros de detecção precisam de ajustes. Este é um processo complicado.

A pirâmide de detecção raramente é precisa na primeira tentativa e as redefinições podem variar entre os pontos de tempo de um filme. Relaxar o fresco detectará todas as contas reais e permitirá que mais falsos positivos possam ajudar. Se nenhuma combinação da pirâmide funcionar, um novo conjunto de dados usando diferentes esferas fluorescentes deve ser adquirido.

Agora prossiga com o registro das detecções e faça uma deconvolução de várias visualizações da pilha. O LSFM é um método ideal para obter imagens de processos de desenvolvimento em várias escalas, desde estruturas intercelulares até células e tecidos inteiros por longos períodos de tempo. Eventos intercelulares muito rápidos podem ser capturados em alta resolução, como o crescimento de microtúbulos em células neuroprogenitoras.

A partir de um único filme, a quantificação do crescimento dos microtúbulos é possível. As estruturas intracelulares podem ser acompanhadas por muitas horas, como o centrossomo dentro das células ganglionares da retina. O comportamento de uma única célula pode ser extraído de imagens de tecido inteiro, como a translocalização de uma célula ganglionar na retina.

A deconvolução de várias visualizações cria uma pilha Z isotrópica combinando várias visualizações diferentes usando a função de propagação de pontos. Isso fornece imagens amplamente aprimoradas em comparação com visualizações únicas ou fusões de média ponderada. Por exemplo, a transformação da vesícula óptica em um copo óptico pode ser estudada a partir de fatias ópticas em diferentes orientações por meio do conjunto de dados mostrado.

Além disso, a boa qualidade geral da imagem, mesmo no interior do embrião, é aparente. Como ao visualizar a morfogênese do copo óptico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar uma imagem de embriões de peixe-zebra em um microscópio de folha de luz.

E como processar conjuntos de dados de várias visualizações no Figi. Uma vez dominado, levará cerca de duas horas para iniciar um experimento de lapso de tempo no microscópio de folha de luz. A análise de dados subsequente levará muito mais tempo.

Pode ser benéfico usar um cluster de computadores para essa tarefa. Mais dicas práticas, conselhos para solução de problemas e links para outros recursos podem ser encontrados no protocolo de texto. Deve haver capacidade de armazenamento suficiente e um plano claro de processamento de dados disponível antes do experimento.

Se você tiver algum problema, dúvida ou solicitação futura, consulte o respectivo site de recursos ou problemas de arquivo nos respectivos repositórios do github.