Name: Usando folha de luz microscopia de fluorescência para Imagem Desenvolvimento Zebrafish Eye (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Aprenda a usar microscopia de fluorescência de folha de luz para imagem do desenvolvimento ocular em embriões de zebrafish. Este método permite observar eventos morfogenéticos em tempo real com alta resolução espacial e temporal.

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Queremos agradecer a Tobias Pietzsch por fornecer seu poderoso software de código aberto BigDataViewer. Agradecemos ao Centro de Microscopia de Luz do Instituto Max Planck de Biologia Celular Molecular e Genética (MPI-CBG), nomeadamente Jan Peychl, Sebastian Bundschuh e Davide Accardi pela assistência técnica, perfeita manutenção dos microscópios utilizados no estudo e pelos comentários sobre o manuscrito e H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) pelo BigDataServer. Agradecemos a Julia Eichhorn por montar o Filme 1. Os membros do laboratório Norden e Svea Grieb forneceram muitos comentários úteis sobre o manuscrito. Jaroslav Icha, Christopher Schmied e Jaydeep Sidhaye são membros da Escola Internacional de Pesquisa Max Planck para Biologia Celular, do Desenvolvimento e de Sistemas e estudantes de doutorado na TU Dresden. Pavel Tomancak é apoiado pela bolsa ERC Starting Grant: Análise Quantitativa do Modelo de Ampulheta da Evolução do Desenvolvimento e do Programa de Ciência da Fronteira Humana RGY0093/2012. Caren Norden é apoiada pelo Programa de Ciência da Fronteira Humana (CDA-00007/2011) e pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) [SFB 655, A25].

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A publicação deste vídeo-artigo é apoiado por Zeiss.

Morfogénese é o processo que molda o embrião e em conjunto com o crescimento e a diferenciação dirige a ontogenia a partir de um ovo fertilizado num organismo multicelular madura. Os processos morfogenéticos durante o desenvolvimento animal pode ser analisado melhor por imagem dos espécimes vivos intactos 1-3. Isto é porque tais imagiologia embrião inteiro preserva todos os componentes que conduzem e regulam o desenvolvimento, incluindo gradientes de moléculas de sinalização, matriz extracelular, vasculatura, inervação bem como as propriedades mecânicas do tecido circundante. Para colmatar as escamas, no qual a morfogénese ocorre, os eventos subcelulares rápidos tem que ser capturado numa escala de tempo minutos no contexto do desenvolvimento de todo o tecido ao longo de horas ou dias. Para cumprir todos estes requisitos, a aplicação moderna 4 do ortogonal microscópio avião iluminação 5 foi desenvolvido. Originalmente, ele foi nomeado o Selective Avião Illumination Microscopy (SPIM) 4; agora é um termo abrangente folha de luz microscopia de fluorescência (LSFM) é normalmente usado. LSFM permite imagens em resolução de tempo de alta, enquanto induz menos fototoxicidade de varredura a laser ou disco giratório microscópios confocal 6,7. Hoje em dia, já existem muitas implementações do princípio básico folha de luz de iluminação e que tem sido utilizado para a imagem uma grande variedade de amostras e os processos anteriormente inacessíveis aos investigadores 8-11. Nós primeiro lugar gostaria de destacar várias vantagens importantes de LSFM sobre as abordagens de microscopia confocal convencionais: Para obter resultados significativos a partir de imagens ao vivo experiências microscópicas, é importante que a observação afecta apenas minimamente a amostra. No entanto, muitos organismos, incluindo peixes-zebra são muito suscetíveis a exposição à luz laser, tornando-se um desafio para a imagem-los em um microscópio confocal com resolução temporal alta sem ef fototoxicidadefects como 6,7 desenvolvimento parado ou atrasado. LSFM é atualmente a técnica de imagem de fluorescência com o mínimo de efeitos perturbadores sobre a amostra 7. Uma vez que a folha fina de luz laser ilumina apenas a parte do espécime que é criada uma imagem num ponto de tempo específico, a folha de microscópio de luz é usando fótons de forma muito eficiente. Consequentemente, a exposição pouca luz permite observações de lapso de tempo mais longos de espécimes saudáveis, por exemplo, 12-17. Além disso, graças à capacidade de invasão mínima de LSFM, o número de imagens adquiridas já não é ditada pela quantidade de luz na amostra pode tolerar, mas sim pela quantidade de dados que podem ser processados ​​e armazenados. Na mesma linha de manter a amostra em condições fisiológicas perto, LSFM vem com a montagem de amostras estratégias alternativas bem adequado para embriões vivos. Em técnicas LSFM, os embriões são tipicamente incorporado dentro de uma coluna fina de baixa porcentagem de agarose. o mounting em cilindros de agarose permite a total liberdade de rotação, de modo que a amostra pode ser observado a partir do ângulo perfeito (em LSFM referido como vista) e a partir de vários pontos de vista simultaneamente. A imagem multiview e subsequente fusão multiview é benéfico especialmente para grandes amostras, espalhando e permite capturá-los com alta, resolução isotrópica. Um resumo das outras estratégias de montagem LSFM possíveis pode ser encontrada no manual de instruções do microscópio oficial, no capítulo sobre a preparação da amostra escrito pelo laboratório de E. Reynaud. É uma leitura recomendada, especialmente se o objetivo é imagem amostras diferentes do que o descrito aqui. A aquisição de imagem em LSFM é um campo largo, baseado em câmera, ao contrário de varredura a laser do microscópio confocal. Isto resulta num sinal-para maior ruído (SNR) de imagens adquiridas e pode ser extremamente rápido (dezenas a centenas de quadros por segundo). A alta sensibilidade do LSFM ainda permite que imagens de samp fracamente fluorescenteles, como fatores de transcrição expressos em níveis endógenos 18 ou, no futuro próximo, proteínas endógenas marcado usando CRISPR / Cas9. A elevada SNR também é importante para a análise de imagem a jusante bem sucedida. A alta velocidade é necessário não só para capturar processos intracelulares rápidos, mas também a imagem de todo o embrião a partir de vários pontos de vista suficientemente rápido. A fusão perfeita dos múltiplos pontos de vista só pode ser alcançado, se o fenômeno observado não muda durante a aquisição destas várias pilhas z provenientes de pontos de vista distintos. As vantagens de LSFM não normalmente vêm em detrimento da qualidade da imagem. A resolução lateral de LSFM é ligeiramente pior do que a resolução de um microscópio confocal. Isto é porque os objectivos de detecção utilizados em LSFM têm menor abertura numérica (normalmente 1,0 ou menos) em relação aos objectivos 1,2-1,3 de água ou imersão em silício configurações padrão confocal. Além disso, devido à ampla detecção de campo na LSFM (AbsenCE de um buraco de agulha), não há mais a luz para fora de foco em comparação com um microscópio confocal. A quantidade de luz fora do foco é determinada pela espessura da folha de luz. No entanto, estas desvantagens são compensadas pela maior SNR em LSFM. Na prática, isto resulta em imagens de qualidade semelhante em comparação com, por exemplo, girando disco de aquisição confocal 15. Consequentemente, isso permite a extração confiável de recursos como membranas celulares ou núcleos, por exemplo, para a linhagem celular de rastreamento 15,19. A resolução axial da LSFM é determinada, para além do objectivo de detecção, pela espessura da folha de luz. A resolução axial pode LSFM em alguns casos, ultrapassar a resolução de microscópios confocal. Em primeiro lugar, a melhoria na resolução ocorre quando a folha de luz é mais fina do que a resolução axial da objectiva de detecção, o que ocorre tipicamente para grandes espécimes fotografada com uma objectiva de baixa ampliação. A segunda maneira, como o LSFM pode achIEVE melhor resolução axial, é a fusão multiview, em que a informação de alta resolução xy a partir de diferentes pontos de vista é combinado em uma pilha de imagens. A pilha fundida resultante tem uma resolução isotrópica aproximando-se dos valores de resolução no sentido lateral 20,21. A estratégia para registrar as múltiplas vistas para o outro descrito neste artigo é baseado no uso de esferas de poliestireno fluorescentes como marcadores fiduciárias embutidos na agarose em torno da amostra 20,21. Como resultado da comercialização LSFM, esta técnica está agora disponível para uma ampla comunidade de cientistas 22. Portanto, a motivação para escrever este protocolo é o de tornar esta tecnologia acessível a biólogos do desenvolvimento sem experiência prática em LSFM e para obter estes cientistas começaram a usar essa tecnologia com suas amostras. Nosso protocolo usa o microscópio folha de luz comercial, o que constitui um microscópio conceitualmente simples tchapéu é fácil de operar. Gostaríamos, adicionalmente, gostaria de mencionar outros protocolos recentes para geração de imagens de peixe-zebra com configurações LSFM construídos em casa, o que pode ser adequado para responder a determinadas perguntas 23-25. Outra opção de entrada para LSFM são as plataformas abertas 26,27, que utilizam os princípios de acesso aberto para trazer microscopia folha de luz para uma comunidade mais ampla. A documentação, tanto do hardware e os aspectos de software podem ser encontradas em http://openspim.org e https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/. Neste protocolo, usamos o peixe-zebra teleósteos como um sistema modelo para estudar processos de desenvolvimento com LSFM. Morfogênese do olho de peixe-zebra é um exemplo que sublinha muitos dos benefícios de LSFM. LSFM já tenha sido utilizado no passado para investigar o desenvolvimento do olho em medaka 28 e no peixe-zebra 29,30. Na fase inicial de desenvolvimento do olho é complicado para orientar correctamente o embrião para microscopia convencional,como a gema de volumoso não permite que o embrião para deitar de lado com o olho voltado para o objetivo. No entanto, com LSFM de montagem para uma coluna de agarose, a amostra pode ser posicionado de forma reprodutível. Além disso, durante a transição da vesícula óptica com a fase cálice óptico, o olho sofre grandes rearranjos morfogenéticas acompanhados de crescimento, o que requer a captura de um grande pilha Z e um grande campo de visão. Também para estes desafios LSFM é superior à imagem confocal convencional. O processo de formação cálice óptico é tridimensional, portanto, é difícil de compreender e visualizar apenas pela imagem de um ponto de vista. Isso faz com que imagem multiview com resolução isotrópica benéfico. Após a formação do cálice óptico, a retina torna-se cada vez mais sensíveis à exposição a laser. Assim, a baixa fototoxicidade associada com LSFM é uma grande vantagem para a imagem latente a longo prazo. Aqui apresentamos um protocolo otimizado para a imagem latente de um a três dias de peixe-zebra de idade embriões alarvas nd com foco no desenvolvimento do olho. Nosso método permite a gravação de filmes de lapso de tempo, cobrindo até 12-14 h com alta resolução espacial e temporal. Importante, que também mostram uma conduta para o processamento de dados, que é um passo essencial na LSFM, como esta técnica gera invariavelmente grandes conjuntos de dados, frequentemente na gama de terabytes.

<table><tbody><tr><td>Microscópio Lightsheet Z.1</td><td>Microscopia Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose de baixo ponto de fusão</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de baixo ponto de fusão</td><td>Sigma</td><td>A4018 ou A9414</td><td></td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoato de metanossulfonato (MESAB/MS-222/Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>N-Feniltioureia (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>500 nm contas fluorescentes vermelhas F-Y 050</td><td>Millipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l (1&nbsp; mm de diâmetro interno, marcado em preto) capilllaries</td><td>Marca</td><td>701904</td><td>vendida como peça de reposição para plungers de ponta de</td></tr><tr><td>Teflon transferpettor para 20&nbsp; &mu; l capilares</td><td>Marca</td><td>701932</td><td>vendida como peça de reposição para transferpettor</td></tr><tr><td>Lamínulas circulares de vidro diâmetro 18 mm, espessura selecionada 0.17&nbsp; mm</td><td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O-rings para janelas de câmara 17&vezes; Pinça</td><td>de Microscopia</td><td></td><td></td>Carl Zeiss de 1,5 mm</tr><tr><td>, estilo 55</td><td>Seringas Luer-Lock Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td> cabo de extensão de <td></td></tr><tr><td>150 cm para infusão compatível com seringas Luer-Lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>Links</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Link 1 Aplicativo</td><td></td><td></td> de reconstrução Multiview<td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration</a> <a href="http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction">http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction</a></td></tr><tr><td>Link 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer"> https://github.com/bigdataviewer</a></td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataViewer">http://fiji.sc/BigDataViewer</a></td></tr><tr><td>Link 4 Problemas</td><td></td><td></td> de aplicação de reconstrução de visualização múltipla<td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues</a></td></tr><tr><td>Link 5 BigDataViewer-issues</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues">https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues</a></td></tr><tr><td>Link 6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataServer">http://fiji.sc/BigDataServer</a></td></tr></tbody></table>

usando folha de luz microscopia de fluorescência para imagem desenvolvimento zebrafish eye

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

A microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) está ganhando cada vez mais popularidade como um método para obter imagens do desenvolvimento embrionário. As principais vantagens do LSFM em comparação com os sistemas confocais são sua baixa fototoxicidade, estratégias de montagem suaves, aquisição rápida com alta relação sinal-ruído e a possibilidade de imagens de amostras de vários ângulos (visualizações) por longos períodos de tempo. A geração de imagens de várias visualizações libera todo o potencial do LSFM, mas, ao mesmo tempo, pode criar conjuntos de dados do tamanho de terabytes. O processamento de tais conjuntos de dados é o maior desafio do uso do LSFM. Neste protocolo, descrevemos algumas soluções para este problema. Até recentemente, o LSFM era realizado principalmente em laboratórios que tinham experiência para construir e operar seus próprios microscópios de folha de luz. No entanto, nos últimos três anos, várias implementações comerciais do LSFM tornaram-se disponíveis, que são polivalentes e fáceis de usar para qualquer biólogo do desenvolvimento. Este artigo é direcionado principalmente aos pesquisadores, que não são desenvolvedores de tecnologia LSFM, mas desejam empregar o LSFM como uma ferramenta para responder a questões específicas de biologia do desenvolvimento. 
Aqui, usamos imagens do desenvolvimento do olho do peixe-zebra como exemplo para apresentar ao leitor a tecnologia LSFM e demonstramos aplicações do LSFM em várias escalas espaciais e temporais. Este artigo descreve um protocolo experimental completo começando com a montagem de embriões de peixe-zebra para LSFM. Em seguida, descrevemos as opções de imagem usando o microscópio de folha de luz disponível comercialmente. É importante ressaltar que também explicamos um pipeline para registro e fusão subsequentes de conjuntos de dados multivisualização usando uma solução de código aberto implementada como um plug-in Fiji. Embora este protocolo se concentre na imagem do olho do peixe-zebra em desenvolvimento e no processamento de dados de uma configuração de imagem específica, a maioria dos insights e sugestões de solução de problemas apresentados aqui são de uso geral e o protocolo pode ser adaptado a uma variedade de experimentos de microscopia de folha de luz.

LSFM é um método ideal para imagiologia processos de desenvolvimento através de escalas. Várias aplicações são compilados aqui mostrando imagens tanto de curto e longo prazo de estruturas intracelulares, bem como as células e tecidos inteiros. Estes exemplos também demonstram que LSFM é uma ferramenta útil em vários estágios de desenvolvimento do olho de formação copo óptica a neurogénese na retina. Filme 1 serve como uma ilustração da abordagem geral LSFM, primeiro que mostra uma vista ampliada de um embrião intacto no incorporação do cilindro de agarose em campo claro e depois mostra uma vista detalhada da retina no canal de fluorescência. <img alt="filme 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> Filme 1:. LSFM da retina zebrafish Para ilustrar a abordagem LSFM, este filme mostra pela primeira vez no campo claro que o embrião é imaginada intacta dentro do umgarose cilindro antes de mudar para fluorescência. Mais tarde, é mostrado que o grande campo de visão permite a observação de toda a retina. Em seguida, o filme mostra uma pequena região ampliada da retina para destacar a boa resolução subcelular. Um Ath5: gap-GFP 37 transgênico embrião de peixe-zebra foi usada para geração de imagens. Este transgene rótulos diferentes neurônios na retina (principalmente células ganglionares e precursores fotorreceptoras). A parte de fluorescência do filme foi capturado como uma visão única gravação com iluminação dupla face usando a objetiva de 40X / 1.0 W com intervalos de 5 min. A projeção de intensidade máxima de um volume de espessura 30 mm é mostrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a> Filme 2 demonstra, como os eventos intracelulares muito rápidas podem ser capturadas com alta resolução; Neste caso, o crescimento dos microtúbulos emsua mais termina nas células progenitoras neuronais da retina. As informações contidas no filme permite rastreamento e quantificação do crescimento dos microtúbulos mais fim. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> Filme 2:. Dinâmica dos microtúbulos em uma única célula Este filme capta crescente dicas além de microtúbulos marcados pela mais ponta proteína marcadora EB3-GFP 38. A proteína é expressa em uma única célula progenitora da retina. Os microtúbulos são predominantemente crescente na direcção a partir apical para basal (de cima para baixo). A velocidade média dos cometas EB3 foi medida como sendo de 0,28 ± 0,05 ^ M / seg. O ponto brilhante no lado apical da célula que exibe actividade de nucleação alta microtúbulos é o centrossoma. O tipo selvagem embrião foi injectado com Hsp70: EB3-GFP plasmídeo de ADN. O filme foi adquirida 4 horas após o choque térmico (15 minutos a 37 ° C) em cerca de 28 FERTILIZ hrpostção (hpf) como uma visão única gravação com iluminação face única usando os intervalos de tempo objetiva e 1 seg W 63X / 1.0. A única célula foi colhido a partir de um campo de visão que cobre a maior parte da retina. A intensidade máxima de projeção de duas fatias é mostrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a> A Figura 3 mostra, como estruturas intracelular pode ser seguido ao longo de muitas horas. Aqui, o centrossoma dentro translocação células ganglionares da retina (RGCs) é capturado. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> Figura 3:. Centrossoma localização durante a translocação células ganglionares da retina Esta montagem de um experimento de lapso de tempo mostra a posição do centrossoma em toda a maturação das células ganglionares da retina (RGC).Nos progenitores neuronais do centrossoma é localizada na ponta do processo apical (01:00). Durante a divisão celular, os dois centrossomas servir como pólos para o fuso mitótico (2:25). Esta divisão resulta em uma célula filha, que se diferencia em uma das CGR e uma segunda célula filha que torna-se um precursor das células fotorreceptoras. Após a divisão, o corpo celular do RGC transloca-se para o lado basal da retina, enquanto o processo apical permanece ligado ao lado apical. Uma vez que o RGC atinge o lado basal, apical seu processo separa o centrossoma e desloca com ela (06:15). O centrossoma pode ser seguido ao gradualmente de retracção em conjunto com o processo de apical (06:50, 07:20, 08:10). No último quadro (08:55) a células ganglionares está crescendo um axônio do seu lado basal, enquanto o centrossoma ainda está localizada no ápice. A expressão mosaico foi conseguida por injecção do ADN de plasmídeo do tipo selvagem em embriões em uma fase celular. As células são visualizados pela Ath5: GFP-CAAX (verde) construct, que rotula RGCs e outros neurônios. Os centrossomas (setas) são rotulados por Centrin-tdTomato 29 expressão (magenta). O lado apical da retina está na parte superior da imagem e o lado da base, na parte inferior. A projeção de intensidade máxima de um volume de espessura 30 mm é mostrado. As imagens foram cortadas de um filme que abrange toda a retina. O filme começa em torno de 34 h após a fertilização (hpf). Uma pilha z foi obtida a cada 5 minutos com o objectivo de 40X / 1,0 W. O tempo é mostrado na hh: mm. Barra de escala representa 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Na Figura 4 é exibido, como único comportamento célula pode ser extraída a partir dos dados da captação de todo o tecido, tal como em um filme. Translocação de um RGC podem ser facilmente rastreados e seu processo apical e basalES seguido. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> Figura 4:. A translocação de uma única célula do gânglio retinal A translocação de RGC apical para o lado basal da retina ocorre após a mitose terminal como descrito na Figura 3 A é RGC marcadas por expressão do Ath5:. GAP-37 GFP transgene. A projeção de intensidade máxima de um volume de espessura 30 mm é mostrado. As imagens foram cortadas de um filme que abrange toda a retina. O filme começa em cerca de 34 hpf. Uma pilha z foi obtida a cada 5 minutos com o objectivo de 40X / 1,0 W. O tempo é mostrado na hh: mm. Barra de escala representa 5 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A Figura 5 demonstra a capacidade de LSFM multivista para capturar o tecido SCprocessos morfogenéticos ale com resolução de celular no exemplo da morfogênese cálice óptico, durante o qual vesícula óptica transforma em um cálice óptico. A qualidade da imagem pode ser muito melhorado por imagem multiview, quando a imagem final é combinado a partir das informações de 5 pontos de vista diferentes (neste caso) em uma pilha z com resolução isotrópica. Esta figura ilustra a melhoria na qualidade da imagem após a fusão médio ponderado e mais ganho de contraste de imagem e resolução após deconvolução multiview. A figura mostra duas fatias ópticos em diferentes orientações através do conjunto de dados. Além disso, uma montagem do conjunto de dados deconvolved mostra a morfogênese cálice óptico ao longo do tempo. Todos os pontos de tempo são mostrados no Movie 3. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> Figura 5: Comparação da qualidade de imagem entre visão única e dois métodos de multivfusion iew. (A) Uma fatia óptica de dados visão única mostrados do ponto de vista lateral e (B) vista dorsal. artefatos listra e degradação do sinal mais profundo dentro da amostra são aparentes. Também uma parte da imagem visível nos dados fundidos (CF) não foi capturados neste ponto de vista particular. (C) A mesma fatia óptico, agora como dados multivistas fundido mostrado da vista lateral e (D) vista dorsal. Note-se que artefatos de banda são suprimidas e estruturas profundas na amostra são melhores resolvidos. (E) A mesma fatia óptica agora como multiview deconvolved dados mostrados do ponto de vista lateral e (F) vista dorsal. Observe o aumento do contraste e resolução para que as membranas de células individuais e núcleos pode ser bem distinto. A resolução não se deteriora notavelmente mais profundo dentro da amostra. O conjunto de dados foi adquirido com iluminação de dupla face de 5 visualizações aproximadamente 20 graus de separação. As pilhas z de aba 100 mm com 1,5 mm tamanho do passo foram adquiridas em cada vista em intervalos de 10 min por 10 horas com o objetivo 20X / 1.0 W. imagens de entrada para a fusão multiview e deconvolução foram amostrados para baixo 2 × para acelerar o processamento de imagem. 15 iterações do deconvolução multiview foram executados. (G) A montagem mostra uma área recortada da vista dorsal a partir dos dados deconvolved para destacar os eventos morfogenéticos durante o desenvolvimento do olho no início da vesícula óptica para o palco cálice óptico. As duas camadas da vesícula óptica, que são epitélio colunar inicialmente semelhante, diferenciam-se em populações de células distintas. A camada mais afastada perto da epiderme se torna o neuroepitélio da retina (RN) e a camada proximal perto do tubo neural torna-se o epitélio pigmentado da retina (RP). As células na alongado RN e invaginado para formar a cúpula óptica (01:40 - 05:00); ao mesmo tempo as células RP achatar. A ectoderme superfície é induzida de modo a formar uma lente (01:40), whinvagina ich mais tarde (5:00). O filme começa em 17 hpf. O tempo é mostrado na hh: mm. Todas as membranas celulares são rotulados pela β-actina: transgene GFP-ras e todos os núcleos são rotulados pela hsp70: H2B-RFP transgene. A barra de escala representa 30 um. FB cérebro anterior, lente LE, OP placï¿½io olfativa, RN neuroepitélio da retina, epitélio pigmentar da retina RP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="filme 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> Filme 3: Copo de morfogênese Optic mostrado com visão única e dois métodos de fusão multiview O filme de lapso de tempo ilustra o processo completo de morfogênese cálice óptico da vesícula óptica para o palco cálice óptico.. Ele mostra uma única fatia óptica a partir da visão lateral (superior) e uma única fatia óptica do ponto de vista dorsal (parte inferior). As células da vesícula óptica desenvolvimento de sofrer rearranjos complexos para finalmente formar o copo óptica hemisférica, com o neuroepitélio da retina interna e externa epitélio pigmentar da retina. A lente é formada a partir da ectoderme superfície. Ele invagina juntamente com o neuroepitélio e senta-se no cálice óptico. Todas as membranas celulares são rotulados pela expressão da β-actina: ras-transgene GFP (verde) e os núcleos são rotulados com Hsp70: H2B-RFP (magenta). O filme começa em cerca de 17 hpf. O conjunto de dados foi adquirido com iluminação de dupla face de 5 visualizações aproximadamente 20 graus uns dos outros e az pilhas de cerca de 100 um foram adquiridos a cada 10 minutos com o objetivo 20X / 1.0 W. O tempo é mostrado na hh: mm. Barra de escala representa 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a>

A microscopia de fluorescência de folha de luz é uma excelente ferramenta para imagens do desenvolvimento embrionário. Permite a gravação de filmes de longo lapso de tempo de embriões vivos em condições quase fisiológicas. Demonstramos sua aplicação para o desenvolvimento de imagens do olho do peixe-zebra em amplas escalas espaço-temporais e apresentamos um pipeline para fusão e deconvolução de conjuntos de dados multiview.

Usando folha de luz microscopia de fluorescência para Imagem Desenvolvimento Zebrafish Eye

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

O objetivo geral deste protocolo experimental é obter imagens do desenvolvimento ocular do embrião de peixe-zebra no microscópio de folha de luz e processar o conjunto de dados multiview adquirido em Figi por meio do plug-in do aplicativo de reconstrução multiview. Este método pode ajudá-lo a entender os eventos morfogenéticos no desenvolvimento animal. A principal vantagem deste método é que você pode observar eventos morfogenéticos no embrião em desenvolvimento com alta resolução espacial e temporal.A principal vantagem da microscopia de folha de luz é a baixa fototoxicidade do método, o rápido tempo de aquisição com o qual você pode obter imagens da amostra e que você pode obter imagens da amostra de vários ângulos, as chamadas visualizações. Capturar a amostra de diferentes visualizações nos permite superar a degradação do sinal e do eixo definido. Essas diferentes imagens podem ser usadas e registradas usando microesferas fluorescentes ao redor da amostra.Podemos reconstruir o volume tridimensional atingindo a resolução isotrópica. Embora demonstremos o uso de microscopia de fluorescência de folha de luz para o desenvolvimento do olho do peixe-zebra, esse método também pode ser usado para responder a várias perguntas em biologia do desenvolvimento e neurociência usando vários organismos modelo. Para começar, aparafuse a objetiva de detecção no microscópio, mantendo as objetivas de iluminação cobertas.Em seguida, destampe as objetivas e deslize cuidadosamente a câmara de amostra para dentro do microscópio. Prenda a câmara apertando o parafuso. Em seguida, conecte a sonda de temperatura e o bloco peltier ao microscópio.Os dois tubos que circulam o líquido refrigerante para o bloco peltier são compatíveis com ambos os conectores e podem funcionar em qualquer orientação. Em seguida, use uma seringa para carregar a câmara através da seringa com solução até a borda superior das janelas da câmara e verifique se há vazamentos. Agora, ligue o microscópio, o computador e a incubação.Inicie o software operacional do microscópio e ajuste a temperatura de incubação para 28.5 graus Celsius. Enquanto a temperatura requilabrate por uma hora, prepare a amostra. Comece preparando a agarose.Derreta uma alíquota preparada de um mililitro de 1% de agarose de baixo ponto de fusão em E três meio a 70 graus Celsius. Após cerca de 15 minutos, transfira 600 microlitros de agarose derretida para um tubo novo de 1,5 mililitro e adicione 250 microlitros de E três meios, 50 microlitros de 0,4% MS 222 e 25 microlitros de solução de estoque de esferas fluorescentes de vórtice. Coloque o tubo em um bloco de aquecimento a cerca de 39 graus Celsius para permitir que a agarose se aproxime de seu ponto de gelificação.Em seguida, empurre os êmbolos com ponta de Teflon para baixo até a parte inferior dos capilares de vidro de um milímetro de diâmetro interno. Prepare cinco deles. Agora, faça um vórtice breve da mistura de agarose e, em seguida, transfira cinco embriões com a quantidade mínima de líquido para ela.Em seguida, insira um capilar e aspire uma cabeça de embrião primeiro. A cabeça deve entrar antes da cauda e não pode haver bolhas de ar. Retire solução suficiente para que haja cerca de dois centímetros de agarose acima do embrião e um centímetro de agarose abaixo dele.Desenhe um embrião em cada capilar antes de prosseguir. Esta etapa requer alguma prática para dominar. Prepare-se para isso usando embriões não valiosos.Quando a agarose solidificar completamente, armazenar as amostras em meio E três, transportando os capilares para uma parede de béquer com plasticina com a abertura inferior em solução. Agora monte o porta-amostras. Primeiro, insira duas mangas de plástico do tamanho certo uma contra a outra na haste.As fendas nas mangas devem estar voltadas para fora. Em seguida, prenda um parafuso de fixação. E insira o capilar através do suporte até que a faixa preta fique visível do outro lado.Evite tocar no êmbolo. Em seguida, aperte o parafuso de fixação. Em seguida, empurre um centímetro de agarose para fora do capilar e corte-o.Em seguida, insira a haste no disco porta-amostras. Antes de carregar o disco de amostra, verifique se o stage está na posição superior no software de controle. Em seguida, use trilhos de guia para deslizar o suporte e a amostra para o microscópio.Agora, crie uma imagem da amostra escolhida conforme descrito no protocolo de texto. O processamento de dados é feito em Figi. É uma distribuição do ImageJ.Antes de começar, o Figi deve ser atualizado. Salve o conjunto de dados de imagem adquirida em uma única pasta. Os arquivos intermediários do processamento da imagem serão salvos na mesma pasta.Agora, inicie o aplicativo de reconstrução de várias visualizações. Em seguida, defina um novo conjunto de dados. Selecione a opção Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats e crie um nome para o arquivo de dados de saída.Em seguida, selecione o primeiro arquivo CZI do conjunto de dados. Os metadados serão carregados automaticamente. Nos metadados da imagem, verifique se o número de ângulos, os canais, as iluminações e o tamanho do voxel estão todos definidos corretamente.Ao pressionar OK, uma janela de log, a janela do explorador de configuração de exibição e uma janela do console são abertas. O explorador de configuração de exibição fornece uma interface amigável. Selecione os arquivos que precisam ser processados e pressione o botão direito do mouse.Uma nova janela será aberta mostrando as diferentes etapas de processamento à medida que são executadas. No canto superior direito estão os botões de informações e salvar. Informações exibe um resumo do conteúdo do arquivo de dados salvo e pressionar salvar salvará os resultados do processamento.Caso contrário, o programa não grava os resultados das etapas de processamento. Para salvar novamente todo o conjunto de dados, primeiro selecione todos os arquivos pressionando Ctrl+A e clicando com o botão direito. Em seguida, selecione Salvar novamente o conjunto de dados e Como HDF5.Uma confirmação da ação de salvar novamente deve ser marcada. Após alguns minutos, para cada ponto de tempo, o programa indicará quando o salvamento for concluído. Em seguida, prossiga com a detecção de pontos de interesse nos dados.Selecione todos os pontos de tempo pressionando Ctrl+A e clique com o botão direito do mouse. Para selecionar, detecte pontos de interesse. Nas opções, selecione diferença-de-gaussiana.E selecione, diminua as imagens de amostra antes da segmentação. Na próxima janela, escolha as configurações de detecção. Nas opções de localização de subpixel, selecione Ajuste quadrático tridimensional.Em seguida, na especificação do ponto de interesse, selecione interativo. Para a opção XY de redução da amostra, selecione corresponder à resolução Z. E para a amostra Z para baixo, selecione 1x.Em seguida, execute a operação selecionando a opção computar na CPU Java. Na janela pop-up, selecione uma visualização para testar os parâmetros. Depois que a exibição for carregada, ajuste o brilho e o contraste pressionando Ctrl+Shift+C no teclado.Além disso, para detecção de contas, alterne a opção de aparência de verde máximo. Agora observe a segmentação como anéis verdes ao redor das detecções. Ajuste os valores de diferença de gaussien para sigma um e parâmetros de limite para segmentar de forma ideal as contas com o número mínimo de falsos positivos.Cada conta deve ser detectada apenas uma vez. Depois de determinar os parâmetros ideais, pressione concluído. Depois que o computador carrega, cada visualização individual do ponto de tempo e segmenta as contas, o programa gera um arquivo de log com o número de contas detectadas por visualização.Deve haver entre 600 e vários milhares de contas por visualização. Caso contrário, os parâmetros de detecção precisam de ajustes. Este é um processo complicado.A pirâmide de detecção raramente é precisa na primeira tentativa e as redefinições podem variar entre os pontos de tempo de um filme. Relaxar o fresco detectará todas as contas reais e permitirá que mais falsos positivos possam ajudar. Se nenhuma combinação da pirâmide funcionar, um novo conjunto de dados usando diferentes esferas fluorescentes deve ser adquirido.Agora prossiga com o registro das detecções e faça uma deconvolução de várias visualizações da pilha. O LSFM é um método ideal para obter imagens de processos de desenvolvimento em várias escalas, desde estruturas intercelulares até células e tecidos inteiros por longos períodos de tempo. Eventos intercelulares muito rápidos podem ser capturados em alta resolução, como o crescimento de microtúbulos em células neuroprogenitoras.A partir de um único filme, a quantificação do crescimento dos microtúbulos é possível. As estruturas intracelulares podem ser acompanhadas por muitas horas, como o centrossomo dentro das células ganglionares da retina. O comportamento de uma única célula pode ser extraído de imagens de tecido inteiro, como a translocalização de uma célula ganglionar na retina.A deconvolução de várias visualizações cria uma pilha Z isotrópica combinando várias visualizações diferentes usando a função de propagação de pontos. Isso fornece imagens amplamente aprimoradas em comparação com visualizações únicas ou fusões de média ponderada. Por exemplo, a transformação da vesícula óptica em um copo óptico pode ser estudada a partir de fatias ópticas em diferentes orientações por meio do conjunto de dados mostrado.Além disso, a boa qualidade geral da imagem, mesmo no interior do embrião, é aparente. Como ao visualizar a morfogênese do copo óptico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar uma imagem de embriões de peixe-zebra em um microscópio de folha de luz.E como processar conjuntos de dados de várias visualizações no Figi. Uma vez dominado, levará cerca de duas horas para iniciar um experimento de lapso de tempo no microscópio de folha de luz. A análise de dados subsequente levará muito mais tempo.Pode ser benéfico usar um cluster de computadores para essa tarefa. Mais dicas práticas, conselhos para solução de problemas e links para outros recursos podem ser encontrados no protocolo de texto. Deve haver capacidade de armazenamento suficiente e um plano claro de processamento de dados disponível antes do experimento.Se você tiver algum problema, dúvida ou solicitação futura, consulte o respectivo site de recursos ou problemas de arquivo nos respectivos repositórios do github.

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Research

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