Aplicação sequencial de lamelas de vidro para avaliar a compressão Rigidez do Lens Mouse: tensão e morfométricas Análises

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a rigidez compressiva e a geometria das lentes do mouse usando uma abordagem simples e barata. Este método pode responder a perguntas-chave no campo da lente. Por exemplo, como diferentes perturbações genéticas e experimentais afetam as propriedades biomecânicas do cristalino.

As principais vantagens dessa técnica são que ela é precisa, reprodutível e não requer equipamentos caros ou especializados. Este método fornece informações sobre as propriedades das lentes de camundongos, com aplicação potencial a organismos modelo maiores, como ratos e coelhos. A visualização do método é crítica porque as etapas de dissecção do cristalino e aplicação da lamínula são difíceis de aprender sem demonstração.

Demonstrando o procedimento estará Catherine Cheng, uma pós-doutoranda do meu laboratório. Comece a dissecção usando uma pinça curva para deprimir o tecido ao redor do olho de um camundongo sacrificado, trazendo o olho para fora da órbita. Em seguida, remova o olho e coloque-o em uma placa de dissecação contendo PBS fresco sob um microscópio de dissecação.

Corte o nervo óptico o mais próximo possível do globo ocular. E insira delicada e cuidadosamente uma pinça reta e fina no globo ocular através do orifício onde o nervo óptico sai da parte posterior do órgão. Faça cuidadosamente uma incisão com uma tesoura da parte posterior até a borda da córnea, tomando cuidado para não danificar o cristalino.

Continue a incisão ao longo da junção entre a córnea e a esclera, pelo menos na metade do globo ocular. E empurre suavemente a córnea para remover a lente do olho pela abertura. Em seguida, use uma pinça reta de ponta fina para remover cuidadosamente quaisquer detritos grandes que ainda estejam presos à lente.

E confirme visualmente que a lente está livre de danos. Pelo menos duas horas antes de iniciar as medições de rigidez, use uma balança analítica para pesar pelo menos 10 lamínulas da mesma caixa. Determine o peso médio das lamínulas.

Em seguida, pré-molhe as lamínulas e um espelho de ângulo reto em temperatura ambiente PBS. Enquanto os materiais estão sendo hidratados, encha a câmara de medição com 65 a 75 mililitros de PBS. E coloque a câmara sob um microscópio de dissecação ajustado para uma ampliação de 30 X, com iluminação da parte inferior e uma fonte de luz de fibra óptica nos lados esquerdo e direito.

Quando as lamínulas estiverem prontas, coloque o espelho de ângulo reto na câmara a uma distância constante do divot que será usado para segurar a lente. Em seguida, usando uma pinça curva, transfira cuidadosamente as lentes dissecadas para a câmara de medição. Defina a fonte de alimentação óptica para 80% da intensidade máxima da luz e ajuste a saída da fonte de alimentação com base na iluminação ambiente, preferência do usuário e qualidade da imagem, conforme necessário.

Obtenha imagens de vista superior das lentes descarregadas diretamente acima da câmara. Em seguida, tire uma foto da borda do espelho em foco, seguida por uma imagem de vista lateral da lente descarregada através do espelho fora do divot. Em seguida, coloque uma lente no divot e confirme se a lente está encaixada de forma segura e reta dentro do divot em seu pólo anterior ou posterior.

Tire uma foto da lente no espelho. Em seguida, coloque delicadamente uma lamínula na lente. Após dois minutos, tire outra imagem de vista lateral da lente carregada.

Continue adicionando lamínulas, obtendo imagens de vista lateral dois minutos após a adição de cada lamínula, até que o total de 10 lamínulas tenha sido aplicado. Em seguida, remova todas as lamínulas, aguarde dois minutos finais e obtenha imagens de visão lateral da lente dentro e fora do divot. E uma imagem de vista superior da lente fora do divot.

Para determinar o tamanho do núcleo da lente, coloque uma lente em uma placa de Petri limpa cheia de PBS e use uma pinça fina e reta para descapsular suavemente a lente. Para remover as células da fibra cortical, role a lente entre os dedos enluvados. Em seguida, enxágue suavemente o núcleo da lente no PBS e coloque o núcleo de volta na câmara de medição.

Adquira uma imagem do núcleo da lente através do espelho de ângulo reto. Finalmente, para analisar as imagens, use o software de análise de imagem apropriado para medir os diâmetros equatoriais e axiais das lentes antes e depois de cada etapa de carregamento. Meça também o diâmetro de cada núcleo da lente.

Neste experimento representativo, a rigidez e as dimensões das lentes de camundongos de dois, quatro e oito meses de idade foram medidas e as deformações axiais e equatoriais foram calculadas. A deformação axial é uma função logarítmica da carga aplicada com uma diminuição estatisticamente significativa e dependente da idade nas deformações axiais e equatoriais sob a carga máxima aplicada, indicando que a lente do mouse enrijece com a idade. Os dados de imagem coletados durante este experimento também foram usados para determinar várias outras características morfológicas do cristalino.

Como esperado, os diâmetros axial e equatorial e o volume do cristalino aumentaram com a idade. A proporção indica que a lente tem um diâmetro equatorial ligeiramente maior do que o diâmetro axial. E esse parâmetro não mudou com a idade.

O diâmetro, o volume e a fração do núcleo do cristalino aumentam com a idade, sugerindo que o núcleo do cristalino se remodela para aumentar em tamanho relativo à medida que o cristalino envelhece. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 30 a 45 minutos por lente, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante posicionar a lente uniformemente dentro do divot e permitir que a lente relaxe por dois minutos entre cada lamínula adicional.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a rigidez compressiva e a morfometria das lentes de camundongos usando a aplicação sequencial de lamínulas. Essa técnica precisa, simples e barata abre caminho para os pesquisadores de lentes explorarem os efeitos biomecânicos das mutações genéticas em camundongos.