Name: Aplicação sequencial de lamelas de vidro para avaliar a compressão Rigidez do Lens Mouse: tensão e morfométricas Análises (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprenda a avaliar a rigidez compressiva e a geometria de lentes de camundongo usando lamelas de vidro. Este método preciso e de baixo custo permite estudar propriedades biomecânicas sem equipamentos especializados.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Eye Institute Grant R01 EY017724 (VMF) e pelo National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Grant K99 AR066534 (DSG).

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório pelos Institutos Nacionais de Saúde e sob um protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal no Scripps Research Institute. 1. Lens Dissection <ol><li> Euthanize camundongos acordo com as recomendações dos Institutos Nacionais de Saúde &quot;Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório&quot; e protocolos de uso instituição animais aprovados. </li><li> Enuclear o olho de ratos usando uma pinça curva. Deprimir o tecido em volta do olho com a pinça para trazer o olho para fora da tomada, e depois arrancar o olho do soquete com a pinça. Transferir os olhos ao fosfato 1x salina fresca tamponada (PBS) no prato de dissecação. </li><li> Cortar o nervo óptico tão perto do globo ocular possível. Suavemente e com cuidado insira uma pinça reta finos no globo ocular através do wher buracoe o nervo óptico sai do posterior. </li><li> Cuidadosamente fazer uma incisão com tesoura no globo ocular a partir do posterior para o bordo da córnea. lentes de roedores ~ ocupar 30% do olho. Faça essas incisões cuidadosamente, e não introduza pinças ou tesouras muito profundo no olho para evitar danificar a lente. </li><li> O corte ao longo da junção entre a córnea e a esclera, pelo menos, a meio caminho em torno do globo ocular. </li><li> Com cuidado, empurre sobre a córnea para remover a lente do olho, através da abertura feita nas etapas 1.4 e 1.5. </li><li> Use uma pinça ponta reta finos para remover cuidadosamente qualquer grande detritos que ainda está ligado à lente. inspecionar visualmente a lente por qualquer dano antes de prosseguir com as medidas de rigidez. </li></ol> 2. Medidas de rigidez <ol><li> Pesar pelo menos 10 lamelas a partir da mesma caixa usando uma balança analítica. Encontre o peso médio das lamelas. Para consistência, use a mesma caixa de lamelas para todos os experimentos. Pré-molhadoAs lamelas e em ângulo recto espelho em 1x PBS à temperatura ambiente durante pelo menos duas horas antes de começar as experiências. </li><li> Encha a câmara de medição (ver Figura 1) com 65 - 75 ml de 1x PBS. A câmara de medição foi feita de Plexiglas por uma loja de máquina em casa, e divots na câmara foram feitas por uma imprensa de broca ajustado para a profundidade desejada com uma broca apropriada. Lentes permanecer transparente em 1x PBS, à temperatura ambiente, durante a duração do teste mecânico. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig1.jpg" /> Figura 1:. Rigidez Medição Secção Uma foto que mostra as dimensões da câmara de medição de rigidez feito por medida com uma variedade de torrões de diferentes profundidades e formas. Os divots redondas que são 200 mm ou 300 mm de profundidade (setas amarelas) são utilizados para as medições em lentes de rato. Divots são 2 mm de diâmetro e 13 ~-. 14 mm a partir da borda da câmara <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53986/53986fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="3"><li> Coloque espelho de ângulo direito para dentro da câmara a uma distância constante do torrão que vai ser usada para segurar a lente. Certifique-se o espelho não se move durante o experimento. </li><li> Transferência de lentes dissecados a câmara de medição com cuidado com apreensão fórceps ou pinças curvas. </li><li> Dê uma vista de cima imagem da lente descarregado directamente de cima. Tome rato fotos lente em 30X de ampliação com iluminação de microscópio de dissecação (inferior) e uma fonte de luz de fibra óptica nas laterais esquerda e direita. Definir a fonte de alimentação da fibra óptica a 80% da intensidade de luz máxima. Ajustar a saída da fonte de alimentação com base na iluminação ambiente, a preferência do usuário e qualidade de imagem, conforme necessário. </li><li> Dê uma vista lateral imagem da lente sem carga, o que pode ser visto através do riespelho GHT-ângulo. Se a câmera não está calibrado, tirar uma foto da borda do espelho no foco. A aresta do espelho é de 5 mm de comprimento, e essa medida pode depois ser usado para determinar a pixels / mm e servir como uma barra de escala nas imagens. </li><li> lente lugar no torrão, e confirme que a lente está sentado de forma segura e em linha reta no torrão. Tire uma foto da lente antes do carregamento. A lente deve estar descansando na torrão sobre o seu anterior ou pólo posterior. </li><li> Coloque uma lamela suavemente sobre a lente. Aguarde 2 min para permitir a fluência, e pegue outro lado-vista de imagem da lente carregado. </li><li> Continue adicionando lamelas como no passo 2.8 e tendo side-ver fotos após a adição de cada lamela como no passo 2.8 até um total de 10 lamelas são aplicadas. </li><li> Remova todas as lamelas. Aguarde 2 min, e dar uma visão lateral imagem da lente (dentro e fora do torrão) após a remoção de todas as lamelas. </li></ol> Medição 3. Lens Nucleus <ol><li> para determine o tamanho núcleo da lente, mover a lente para uma placa de Petri limpa preenchido com 1x PBS. </li><li> Gentilmente decapsulate a lente usando uma pinça reta finos. </li><li> Slough fora das células das fibras corticais por rolando a lente entre os dedos enluvados. O núcleo do cristalino remanescente vai se sentir como um mármore duro. Usar este procedimento para isolar o núcleo em lentes de adultos a partir de 1 mês de idade. Uma vez que o núcleo isolado é um corpo rígido, mais ensaios mecânica do núcleo da lente não pode ser executada utilizando este método descrito. </li><li> Lave o núcleo da lente em 1x PBS numa placa de Petri. </li><li> Coloque o núcleo da lente de volta para a câmara de medição (não no torrão), e tomar uma imagem do núcleo da lente através do espelho de ângulo direito. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig2.jpg" /> Figura 2:. A Lenses mouse comprimido por Lamelas (A) Esquema e (B) fotografia do exconfiguração perimental mostrando uma lente de 2 meses de idade mouse em um torrão de 200 mm de profundidade na câmara de medição preenchida com 1x PBS. Um espelho ângulo direito e uma câmera digital acoplada a um microscópio de dissecação foram usadas para recolher imagens da lente durante a compressão por lamelas. (C) Fotos de pontos de vista sagital de um 2 meses de idade lente de tipo selvagem comprimido sucessivamente um número crescente de lamelas, desde que os dados brutos para medir diâmetros axiais e equatoriais e calculando tensões axiais e equatoriais durante o teste de compressão à base de lamela. A reflexão da lente pode, por vezes, ser visto nas lamelas (mais claramente visível na imagem uma lamela). Ao fazer medições, ignorar a reflexão e medir até o ápice da lente. (D) Fotos de pontos de vista sagital dos 2 meses de idade, do tipo selvagem lente pós-compressão eo núcleo isolado lente. A lente pós-compressão e núcleo isolado está sentado fora do torrão. Barras de escala, de 1 mm. Este valor é modificado a partir Gokhin, et al. PLoS ONE, 19, 2012. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53986/53986fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Análise 4. Imagem <ol><li> Medir diâmetros equatoriais e axiais de lentes antes do carregamento e após cada etapa de carregamento usando ImageJ ou software similar. Medir o diâmetro de cada núcleo da lente. O núcleo da lente é esférica de modo quase uma medição em qualquer orientação será suficiente 19,21. </li><li> Corrigir a lente axial diâmetros adicionando a profundidade do torrão utilizado. Na câmara de medição, o torrão obscurecido 200 uM (lentes de 2 meses de idade) ou de ratinho (300 um lentes de 4 meses de idade e 8 meses de idade) do rato da espessura axial da lente. </li><li> Calcule o axial e estirpes equatoriais a partir das medições do diâmetro da lente usando a equação, ε = (d - d 0) / d 0, onde ε é a tensão, d é a axial ou ediâmetro quatorial a uma determinada carga, e d é o diâmetro 0 axial ou equatorial correspondente a uma carga nula. </li><li> Traça-se a estirpes axial e equatorial como funções da carga aplicada (em mg). </li><li> Traçar a axial, equatorial e diâmetros nucleares. Calcular e traçar a relação de aspecto lente dividindo o diâmetro axial pelo diâmetro equatorial. </li><li> Calcular e definir o volume da lente usando a equação, Volume = 4/3 x π × 2 × R e R a, em que Re é o raio equatorial e R a é o raio medido a partir axial da fotografia tirada no passo 2.6. Esta equação assume a lente é um esferóide oblato (elipsóide) 1,22. </li><li> Calcular e definir o volume nuclear utilizando a equação, Volume = 4/3 x π × R 3 N, em que R N é o raio do núcleo da lente, conforme medido a partir da fotografia tirada no passo 3.5. Esta equação assume que o núcleo da lente iesfera sa 19,21. </li><li> Calcular e representar graficamente a fracção nuclear, tal como a razão do volume nuclear para o volume da lente. </li></ol>

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<li>Pau, H., Kranz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+sclerosis+of+the+human+lens+with+age+and+its+relevance+to+accommodation+and+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).</li>
<li>Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+elasticity+in+human+lenses+using+bubble-based+acoustic+radiation+force%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force.</a> Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).</li>
<li>Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lens+stiffness+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse lens stiffness measurements.</a> Exp Eye Res. 91 (2), 300-307 (2010).</li>
<li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry%2C+transparency%2C+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734(2012).</li>
<li>Sindhu Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Aquaporin+0+in+lens+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics.</a> Biochem Biophys Res Commun. , (2015).</li>
<li>Fudge, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+filaments+regulate+tissue+size+and+stiffness+in+the+murine+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).</li>
<li>Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+modeling+of+secondary+fiber+development+and+growth%3A+I.+Nonprimate+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses.</a> Mol Vis. 12, 251-270 (2006).</li>
<li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+age-related+stiffening+in+the+crystalline+lens+by+Brillouin+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy.</a> Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Há várias considerações importantes quando se usa este método para medir a rigidez da lente. Em primeiro lugar, as lamelas são aplicados para a lente com um ângulo ligeiramente oblíquo (8-8,5 °) em relação ao fundo da câmara (θ). Isto aplica-se um componente muito pequeno da carga equatorial ao invés de axial. No entanto, essa carga equatorial é considerado insignificante, porque o pecado θ ≈ 0,1 19. Se este método é adaptado para lentes maiores, o ângulo das lamelas para o fundo da câmara que têm de ser medi...

O cristalino é um órgão transparente e avascular na câmara anterior do olho que é responsável pelo foco fino da luz na retina. Uma membrana basal transparente, chamada cápsula do cristalino, envolve uma grande quantidade de células de fibra alongadas cobertas por uma monocamada anterior de células epiteliais1,2. O crescimento ao longo da vida do cristalino depende da proliferação e diferenciação contínuas de células epiteliais no equador do cristalino em novas células de fibra que são adicionadas às gerações anteriores de células de fibra de maneira concêntrica2. Com o tempo, as células da fibra do cristalino sofrem compactação, resultando em um centro rígido no meio do cristalino chamado núcleo1. A acomodação, definida como uma mudança dióptrica na potência óptica do olho, ocorre em humanos quando os músculos ciliares se contraem para deformar o cristalino e permitir um verdadeiro aumento na potência óptica para focar em objetos próximos3-5. No olho não acomodado, o cristalino é mantido em um estado relativamente achatado devido à tensão das fibras zonulares. Quando os músculos ciliares se contraem, a tensão no cristalino é liberada, levando à diminuição do diâmetro equatorial do cristalino e aumento da espessura axial. Alterações relacionadas à idade no cristalino causam presbiopia, uma perda progressiva da acomodação do cristalino, o que leva à necessidade de óculos de leitura. 
Vários estudos associaram a presbiopia ao aumento da rigidez intrínseca do cristalino relacionado à idade6-11. A rigidez é definida como a resistência de um objeto elástico à deformação sob carga aplicada. Uma variedade de métodos tem sido usada para examinar a rigidez das lentes humanas, incluindo compressão de spin12-14, compressão do atuador15, recuo da sonda16, análise mecânica dinâmica 6,10 e força de radiação acústica baseada em bolhas17. Embora as lentes de camundongos não acomodem ou desenvolvam presbiopia, os modelos de camundongos para patologias de lentes são ferramentas valiosas porque os camundongos são mais baratos do que animais maiores, bem caracterizados geneticamente e sofrem mudanças aceleradas relacionadas à idade devido ao rápido envelhecimento. Um punhado de estudos examinou a rigidez do cristalino de camundongos com métodos de compressão e demonstrou mudanças na rigidez do cristalino devido ao envelhecimento ou interrupções genéticas direcionadas18-21. Assim, as lentes de camundongos são bons modelos para estudar as mudanças relacionadas à idade na rigidez da lente. 
Este protocolo descreve um método de compressão simples e barato, mas preciso e reprodutível, para determinar a rigidez da lente do mouse com base na aplicação de lamínulas de vidro na lente em conjunto com a fotografia da lente através de um microscópio de dissecção e espelho. Este método produz dados morfométricos e de deformação robustos com um aparelho facilmente fabricado e montado. Os resultados representativos confirmam que as lentes de camundongos aumentam em rigidez com a idade.

<table><tbody><tr><td>Pinça reta de ponta fina</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de microdissecação, borda reta</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinça curva</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de apreensão</td><td>Hammacher</td><td>HSC 702-93</td><td>Prato de</td></tr><tr><td>dissecção</td> opcional <td>Fisher Scientific</td><td>12565154</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>1x solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 mm lamínulas de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de medição com divots para segurar as lentes</td><td></td><td></td><td>Feito sob medida (ver Figura 1)</td></tr><tr><td>Espelho de ângulo reto</td><td>Edmund Optics</td><td>45-591</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz</td><td>Schott/Fostec</td><td>8375</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação iluminado</td><td>Olympus</td><td>SZX-ILLD100</td><td>Com tubo fotográfico SZ-PT</td></tr><tr><td>Câmera digital</td><td>Nikon</td><td>Coolpix 990</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicação sequencial de lamelas de vidro para avaliar a compressão rigidez do lens mouse: tensão e morfométricas análises

Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

A lente do olho é um órgão transparente que refrata e focaliza a luz para formar uma imagem nítida sobre a retina. Nos seres humanos, os músculos ciliares contrato para deformar a lente, levando a um aumento na potência óptica das lentes para focar objetos próximos, um processo conhecido como acomodação. mudanças relacionadas à idade na rigidez da lente têm sido associados a presbiopia, uma redução na capacidade da lente para acomodar, e, por extensão, a necessidade de óculos de leitura. Mesmo que as lentes do mouse não acomodar ou desenvolver presbiopia, modelos de ratos pode fornecer uma ferramenta genética inestimável para patologias lente compreensão, eo envelhecimento acelerado observado em camundongos permite o estudo de mudanças relacionadas à idade na lente. Este protocolo demonstra um método simples, precisa e de custo eficaz para determinar a rigidez da lente do mouse, utilizando lamelas de vidro para aplicar sequencialmente crescente cargas de compressão na lente. Os dados representativos confirmar que as lentes do mouse se tornar mais rígida com a idade, comolentes humanas. Este método é altamente reprodutível e pode, potencialmente, ser ampliados por meios mecânicos lentes de teste a partir de animais maiores.

A rigidez e dimensões de lentes 2-, 4- e 8 meses de idade rato foram medidos. Os ratinhos foram todos os animais de tipo selvagem sobre um fundo puro estirpe C57BL6 obtido a partir da criação de animais Facilidade TSRI animal, e cada lente foi carregado com 1 a 10 lamelas. As estirpes axiais e equatoriais foram calculadas como uma função da carga aplicada através da medição do diâmetro equatorial e axial da lente após a adição de cada lamela, e depois normalizando a cada mudança de diâme...

Aumentos relacionados à idade na rigidez da lente ocular estão ligados à presbiopia. Este protocolo descreve um método simples e econômico para medir a rigidez da lente do mouse. As lentes de camundongos, como as lentes humanas, tornam-se mais rígidas com a idade. Este método é preciso e pode ser adaptado para lentes de animais maiores.

Aplicação sequencial de lamelas de vidro para avaliar a compressão Rigidez do Lens Mouse: tensão e morfométricas Análises

The eye lens is a transparent organ that refracts and focuses light to form a clear image on the retina. In humans, ciliary muscles contract to deform the ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a rigidez compressiva e a geometria das lentes do mouse usando uma abordagem simples e barata. Este método pode responder a perguntas-chave no campo da lente. Por exemplo, como diferentes perturbações genéticas e experimentais afetam as propriedades biomecânicas do cristalino.As principais vantagens dessa técnica são que ela é precisa, reprodutível e não requer equipamentos caros ou especializados. Este método fornece informações sobre as propriedades das lentes de camundongos, com aplicação potencial a organismos modelo maiores, como ratos e coelhos. A visualização do método é crítica porque as etapas de dissecção do cristalino e aplicação da lamínula são difíceis de aprender sem demonstração.Demonstrando o procedimento estará Catherine Cheng, uma pós-doutoranda do meu laboratório. Comece a dissecção usando uma pinça curva para deprimir o tecido ao redor do olho de um camundongo sacrificado, trazendo o olho para fora da órbita. Em seguida, remova o olho e coloque-o em uma placa de dissecação contendo PBS fresco sob um microscópio de dissecação.Corte o nervo óptico o mais próximo possível do globo ocular. E insira delicada e cuidadosamente uma pinça reta e fina no globo ocular através do orifício onde o nervo óptico sai da parte posterior do órgão. Faça cuidadosamente uma incisão com uma tesoura da parte posterior até a borda da córnea, tomando cuidado para não danificar o cristalino.Continue a incisão ao longo da junção entre a córnea e a esclera, pelo menos na metade do globo ocular. E empurre suavemente a córnea para remover a lente do olho pela abertura. Em seguida, use uma pinça reta de ponta fina para remover cuidadosamente quaisquer detritos grandes que ainda estejam presos à lente.E confirme visualmente que a lente está livre de danos. Pelo menos duas horas antes de iniciar as medições de rigidez, use uma balança analítica para pesar pelo menos 10 lamínulas da mesma caixa. Determine o peso médio das lamínulas.Em seguida, pré-molhe as lamínulas e um espelho de ângulo reto em temperatura ambiente PBS. Enquanto os materiais estão sendo hidratados, encha a câmara de medição com 65 a 75 mililitros de PBS. E coloque a câmara sob um microscópio de dissecação ajustado para uma ampliação de 30 X, com iluminação da parte inferior e uma fonte de luz de fibra óptica nos lados esquerdo e direito.Quando as lamínulas estiverem prontas, coloque o espelho de ângulo reto na câmara a uma distância constante do divot que será usado para segurar a lente. Em seguida, usando uma pinça curva, transfira cuidadosamente as lentes dissecadas para a câmara de medição. Defina a fonte de alimentação óptica para 80% da intensidade máxima da luz e ajuste a saída da fonte de alimentação com base na iluminação ambiente, preferência do usuário e qualidade da imagem, conforme necessário.Obtenha imagens de vista superior das lentes descarregadas diretamente acima da câmara. Em seguida, tire uma foto da borda do espelho em foco, seguida por uma imagem de vista lateral da lente descarregada através do espelho fora do divot. Em seguida, coloque uma lente no divot e confirme se a lente está encaixada de forma segura e reta dentro do divot em seu pólo anterior ou posterior.Tire uma foto da lente no espelho. Em seguida, coloque delicadamente uma lamínula na lente. Após dois minutos, tire outra imagem de vista lateral da lente carregada.Continue adicionando lamínulas, obtendo imagens de vista lateral dois minutos após a adição de cada lamínula, até que o total de 10 lamínulas tenha sido aplicado. Em seguida, remova todas as lamínulas, aguarde dois minutos finais e obtenha imagens de visão lateral da lente dentro e fora do divot. E uma imagem de vista superior da lente fora do divot.Para determinar o tamanho do núcleo da lente, coloque uma lente em uma placa de Petri limpa cheia de PBS e use uma pinça fina e reta para descapsular suavemente a lente. Para remover as células da fibra cortical, role a lente entre os dedos enluvados. Em seguida, enxágue suavemente o núcleo da lente no PBS e coloque o núcleo de volta na câmara de medição.Adquira uma imagem do núcleo da lente através do espelho de ângulo reto. Finalmente, para analisar as imagens, use o software de análise de imagem apropriado para medir os diâmetros equatoriais e axiais das lentes antes e depois de cada etapa de carregamento. Meça também o diâmetro de cada núcleo da lente.Neste experimento representativo, a rigidez e as dimensões das lentes de camundongos de dois, quatro e oito meses de idade foram medidas e as deformações axiais e equatoriais foram calculadas. A deformação axial é uma função logarítmica da carga aplicada com uma diminuição estatisticamente significativa e dependente da idade nas deformações axiais e equatoriais sob a carga máxima aplicada, indicando que a lente do mouse enrijece com a idade. Os dados de imagem coletados durante este experimento também foram usados para determinar várias outras características morfológicas do cristalino.Como esperado, os diâmetros axial e equatorial e o volume do cristalino aumentaram com a idade. A proporção indica que a lente tem um diâmetro equatorial ligeiramente maior do que o diâmetro axial. E esse parâmetro não mudou com a idade.O diâmetro, o volume e a fração do núcleo do cristalino aumentam com a idade, sugerindo que o núcleo do cristalino se remodela para aumentar em tamanho relativo à medida que o cristalino envelhece. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 30 a 45 minutos por lente, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante posicionar a lente uniformemente dentro do divot e permitir que a lente relaxe por dois minutos entre cada lamínula adicional.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a rigidez compressiva e a morfometria das lentes de camundongos usando a aplicação sequencial de lamínulas. Essa técnica precisa, simples e barata abre caminho para os pesquisadores de lentes explorarem os efeitos biomecânicos das mutações genéticas em camundongos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Usando um dispositivo projetado previamente para aplicar a tensão mecânica às pilhas aderentes, este papel descreve uma geometria redesenhada do substrato e um instrumento personalizado para a imagem latente da único-pilha de alta resolução de pilhas tensas com um objetivo da imersão do óleo 100x.

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Aqui, descrevemos o uso da tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) para visualizar estruturas retinianas e oculares in vivo em modelos de degeneração da retina, glaucoma, retinopatia diabética e miopia.

Avaliações estruturais in vivo de doenças oculares em modelos de roedores utilizando tomografia de coerência óptica

Protocolos passo a passo detalhados são descritos aqui para o estudo de sinais mecânicos in vitro usando células de crista neural O9-1 multipotentes e hidrânis de poliacrilamida de rigidez variada.

Um sistema otimizado de O9-1/Hidrogel para estudar sinais mecânicos em células de crista neural

Uma abordagem é aqui apresentada para imagens intravitais de longo prazo usando janelas de silicone opticamente claras que podem ser coladas diretamente ao tecido/órgão de interesse e à pele. Essas janelas são mais baratas e mais versáteis do que outras atualmente utilizadas no campo, e a inserção cirúrgica causa inflamação e angústia limitadas aos animais.

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O protocolo descreve um método para o estudo da viscoelasticidade da matriz extracelular e sua dependência da composição proteica ou fatores ambientais. O sistema de matriz alvo é o zonule do rato. O desempenho do método é demonstrado comparando o comportamento viscoelástico das fibraszonulares do tipo selvagem com as que não possuem glicoproteína associada a microfibril-1.

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Este protocolo descreve métodos para preparar células de fibras periféricas, maduras e nucleares do cristalino ocular para coloração por imunofluorescência para estudar interdigitações complexas célula-célula e a arquitetura da membrana.

Preparo e Coloração por Imunofluorescência de Feixes e Células Monofibrais do Córtex e Núcleo do Cristalino Ocular

Os protocolos descritos são novos métodos de visualização de estruturas periféricas na lente ocular com métodos de quantificação de imagens. Estes protocolos podem ser utilizados em estudos para melhor compreender a relação entre as estruturas da microescala do cristalino e o desenvolvimento/função do cristalino.

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Apresentamos um método automatizado para caracterizar o módulo de elasticidade efetivo de uma lente ocular usando um teste de compressão.

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Este método modela a cirurgia de catarata in vivo , removendo as células da fibra do cristalino de camundongos adultos e deixando para trás a bolsa capsular com células epiteliais do cristalino (LECs) anexadas. A resposta à lesão é então avaliada em vários momentos após a cirurgia usando critérios moleculares e morfológicos.

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Recentemente, identificamos o enrijecimento capilar da retina como um novo paradigma para a disfunção retiniana associada ao diabetes. Este protocolo elabora as etapas para o isolamento dos capilares retinianos de camundongos e da matriz subendotelial das culturas endoteliais da retina, seguidas de uma descrição da técnica de medição da rigidez usando microscopia de força atômica.

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Preparação de olhos suínos para microscopia de refletância confocal para visualizar a rede de fibras de colágeno vítreo

Aprenda a avaliar a rigidez compressiva e a geometria de lentes de camundongo usando lamelas de vidro. Este método preciso e de baixo custo permite estudar propriedades biomecânicas sem equipamentos especializados.

Aplicação sequencial de lamelas de vidro para avaliar a compressão Rigidez do Lens Mouse: tensão e morfométricas Análises

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