Análise alto teor de triagem para avaliar os efeitos toxicológicos de Constituintes nocivas e potencialmente prejudiciais (HPHC)

O objetivo geral desta abordagem, que combina um analisador de células em tempo real baseado em impedância e uma plataforma baseada em triagem de alto conteúdo, é fornecer informações sobre doses efetivas, toxicidade e efeitos biológicos, para obter o perfil Tox dos compostos testados. Essa abordagem pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Toxicologia. Abordando, por exemplo, citotoxiticidade, genotoxicidade e respostas ao estresse celular.

Além disso, não apenas fornece informações sobre vários parâmetros bioquímicos e morfológicos simultaneamente, mas também pode ser aplicado a uma gama diferente de tipos de células e modelos de cultura de células. Devido à jurisdição e limitação, toda a abordagem será realizada avaliando apenas um pequeno pedaço de composto. Pelo mesmo motivo, apenas um protocolo será mostrado para demonstrar a Avaliação de Triagem de Alto Conteúdo.

Demonstrando o procedimento estarão Stefano Acali e Alexander Laurent, técnicos do meu laboratório. Para ver as células epiteliais brônquicas humanas normais, ou células NHBE, programe o instrumento para definir o número e a duração das medições de impedância. Neste estudo, os dados são registrados a cada 15 minutos, durante 48 horas.

Meça o fundo da placa pipetando 50 microlitros de meio pré-aquecido em cada poço de uma placa RTCA de 96 poços. Esta etapa representa um requisito técnico para o instrumento calcular a resistência elétrica média a ser usada como referência de linha de base para cálculos baseados em células. Em seguida, adicione 50 microlitros de suspensão celular a uma concentração de 144.000 células por mililitro ao meio já existente em cada poço da placa RTCA.

Uma vez que a célula tenha aquecido, é muito importante deixar a placa em temperatura ambiente por 40 minutos para permitir que as células se fixem e obtenham uma distribuição celular homogênea. Incube as placas RTCA no berço da incubadora e comece a registrar os dados pelas próximas 24, mais ou menos duas horas, antes da dosagem. Para o controlo positivo, diluir a solução-mãe de estaurosporina a 10 milimolares, um a 10, em DMSO.

Adicione cinco microlitros da diluição a 195 microlitros de meio para obter uma solução de trabalho 5x. Para os constituintes nocivos e potencialmente nocivos, dissolva cada um deles no veículo para gerar uma solução de estoque de um molar. Em seguida, diluir cada solução-mãe da substância de ensaio, um a 10, em meio para obter uma solução de 100 milimolares.

Gere a placa mestra composta adicionando primeiro meio mais 10% de veículo nos poços de B a F e a solução de 100 milimolares no poço A. Execute uma diluição em série de cinco etapas, de um a 10, para obter as soluções de trabalho 5x. Para a dosagem, pause o instrumento RTCA, abra o berço para remover a placa de exposição e coloque a placa na ferramenta de temperatura RTCA para evitar o resfriamento das células, o que pode afetar a medição da impedância. Adicione 25 microlitros de solução 5x da placa mestra Compound às células em triplicata, mantendo a mesma ordem de dosagem da placa mestra Compound.

Não remova o meio de cultura celular existente. Em seguida, adicione 25 microlitros de solução de controle positivo 5x às células na metade direita da linha inferior, sem remover o meio de cultura existente. Da mesma forma, adicione 25 microlitros de meio às células na metade esquerda da linha inferior.

Depois de selar a placa com o selador de placas, coloque a placa de volta no berço RTCA e trave-a. Reinicie a gravação de dados para o tempo de exposição desejado. Após o registro dos dados, analise os dados de viabilidade celular RTCA para determinar qual substância de teste usar na análise HCS.

Neste experimento, 1-aminonaftaleno, arsênico, cromo e crotonaldeído são selecionados para análise de HCS. Para ver as células NHBE, adicione 100 microlitros de uma suspensão celular a 120.000 células por mililitro a cada poço de uma placa preta de 96 poços. Depois de deixar a placa HCS em temperatura ambiente por 30 minutos, para permitir que as células se fixem nos poços, incube a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 24, mais ou menos duas horas, antes da dosagem.

Para o controlo positivo, distribuir 40 microlitros da solução-mãe de cada controlo positivo na coluna dois. Em seguida, dispense 20 microlitros do veículo nas colunas três e cinco. E 40 microlitros do veículo na coluna quatro.

Retire 12 microlitros dos poços da coluna dois, distribua para os poços da coluna três e misture. Continuar até obter uma diluição final em série com três doses e veículo para cada composto de controlo positivo. Para gerar a placa de controle positivo, prepare uma diluição de um a 40 em meio das três doses e veículo.

Para fazer a placa principal composta, ressuspender e diluir cada solução-mãe da substância de ensaio, um a 10 em meio para uma concentração de 100 milimolares. Realizar diluições utilizando meio com veículo a 10% para obter as 5 doses seleccionadas para cada substância de ensaio. Tanto os controles positivos quanto a placa composta estão agora prontos para serem dosados sobre a placa de exposição.

Em seguida, adicione 25 microlitros de soluções 5x da placa mestra Compound às células em triplicata, mantendo a mesma ordem de dosagem da placa mestra Compound. Não remova o meio de cultura celular existente. Em seguida, adicione 25 microlitros da solução 5x da placa de controle positivo às células da linha inferior, mantendo a mesma ordem de dosagem da placa de controle positivo.

Preparar um volume suficiente da solução de coloração de células vivas, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, dilua o corante mitocondrial e o corante de permeabilidade da membrana na solução de coloração de células vivas, de acordo com as instruções do fornecedor. Adicione 50 microlitros da solução de coloração de células vivas a cada poço da placa designada Ensaio de Citotoxicidade.

Não remova o meio de cultura de células e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius, 5% de CO2. Aspire suavemente o meio e a solução de coloração e adicione 100 microlitros de solução de fixação a cada poço. Em seguida, incube a placa por 20 minutos em temperatura ambiente, no escuro.

Após a incubação, aspire suavemente a solução de fixação e lave uma vez com 100 microlitros por poço de tampão de lavagem. Remova o tampão de lavagem e adicione 100 microlitros por poço de 1x tampão de permeabilização a cada poço, antes de incubar por 10 minutos em temperatura ambiente, no escuro. Aspirar o tampão de permeabilização e lavar a placa duas vezes com 100 microlitros, por alvéolo, de tampão de lavagem.

Em seguida, aspire o tampão de lavagem e adicione 100 microlitros de 1x tampão de bloqueio a cada poço. Em seguida, incube por 15 minutos em temperatura ambiente, no escuro. Dilua o anticorpo anticitocromo C, um a 250, em solução de anticorpo primário.

Em seguida, aspire o tampão de bloqueio e adicione 50 microlitros, por poço, de solução de anticorpo primário a cada poço, antes de incubar por 60 minutos em temperatura ambiente, no escuro. Dilua o anticorpo anti-camundongo, um a 500, em anticorpo secundário e solução nuclear. Além disso, dilua o corante nuclear, um a 1.000, em anticorpo secundário e solução nuclear.

Após aspirar a Solução Primária de Anticorpos, lave a placa três vezes com 100 microlitros, por poço, de tampão de lavagem, usando a lavadora de placas. Aspire o tampão de lavagem e adicione 50 microlitros, por poço, de anticorpo secundário e solução nuclear a cada poço da placa. Agora, incube a placa por 60 minutos em temperatura ambiente, no escuro.

Após a aspiração do Anticorpo Secundário e da Solução Nuclear, lave a placa três vezes com 100 microlitros de, por poço, de tampão de lavagem usando a lavadora de placas. Em seguida, adicione 100 microlitros, por poço, de tampão de lavagem. A placa está agora pronta para ser avaliada no instrumento HCS e a aquisição é iniciada.

São apresentados resultados representativos da viabilidade celular RTCA do tratamento com a substância em estudo. Um efeito tóxico dependente da dose é obtido ao longo de 24 horas de exposição apenas com 1-aminonaftaleno, arsênico, cromo e crotonaldeído, pois todos exibiram um LD50 calculado inferior a 20 milimolares. Nenhum efeito tóxico foi obtido com os outros compostos.

Aqui são apresentados resultados representativos do HCS apenas para o tratamento com 1-aminonaftaleno. O efeito tóxico do 1-aminonaftaleno está induzindo um dano grave da membrana celular, o que leva a um aumento da permeabilidade da membrana celular de maneira dose-dependente, após quatro horas de exposição. O composto também está afetando as mitocôndrias, induzindo um aumento de massa após quatro horas de exposição, juntamente com a liberação do citocromo C, que é então detectável nos núcleos após quatro e 24 horas de exposição.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada dentro de dois a três dias, pois a maioria delas requer cerca de uma hora por dia de tempo prático para configuração e dosagem. Dependendo do protocolo selecionado, a triagem de alto teor requer no máximo três horas e meia para a execução de todo o procedimento de coloração. Ao tentar este procedimento, lembre-se de que, embora a seleção de uma gama mais ampla de endpoints adicione complexidade ao fluxo de trabalho, ela não aumentará substancialmente o tempo.

Com um fluxo de trabalho ideal, de fato, várias placas podem ser avaliadas em paralelo. O desenvolvimento contínuo da plataforma de triagem de alto conteúdo, incluindo configuração de células totalmente automatizada, diluição de compostos, dosagem e coloração, e a adição de um novo ponto final, expandirá ainda mais a capacidade da plataforma de triagem de alto conteúdo como uma ferramenta poderosa para perfis toxicológicos. Além disso, a combinação de múltiplos parâmetros toxicológicos únicos com um rendimento tão elevado levar-nos-á um passo em frente no nosso esforço para reduzir os ensaios químicos em animais.