Name: Análise alto teor de triagem para avaliar os efeitos toxicológicos de Constituintes nocivas e potencialmente prejudiciais (HPHC) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprenda a avaliar a toxicidade de constituintes da fumaça de cigarro usando análise de impedância em tempo real e triagem de alto conteúdo em células epiteliais brônquicas humanas. Este método fornece perfis toxicológicos detalhados.

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Os autores gostariam de agradecer Karsta Luettich e Grégory Vuillaume para a sua revisão do manuscrito.

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</ol>

Todos os autores são funcionários da Philip Morris International. Philip Morris International é a única fonte de financiamento e patrocinador deste projeto.

As necessidades de alternativas à experimentação animal e para novas abordagens de teste de alto rendimento têm sido amplamente discutido nos últimos anos. Isso levou os cientistas e autoridades reguladoras para investigar métodos alternativos para os testes de toxicidade padrão, utilizando ensaios celulares que imitam de perto a fisiologia dos tecidos-alvo. Neste estudo, demonstrámos a aplicabilidade da combinação de um analisador de células em tempo real (RTCA) com uma plataforma de alto teor de triagem (HCS) para avaliar o impacto da exposição aos componentes individuais CS em células epiteliais do pulmão humano. Esta configuração pode ser aplicada de forma análoga para avaliar a citotoxicidade induzida por vários outros poluentes transportados pelo ar, partículas transportadas pelo ar, e nanopartículas. Além disso, os resultados obtidos podem ser combinados com os de transcriptomics todo o genoma e métodos computacionais baseados em redes biológicas causais. Como relatado anteriormente, esta abordagem permitiu-nos para corroborar os dados sobre caminho molecularperturbação após exposição CS 5 com endpoints HCS, abordando estas perturbações via também fenotipicamente. Como um ensaio de fluxograma, análise de células em tempo real fornece informação relacionada com a viabilidade celular em uma resolução dose e tempo-dependente, que permite uma melhor tomada de decisão que a dose e ponto de tempo de exposição pode ser favorável para a análise a jusante 14. O princípio do analisador depende de alterações na impedância eléctrica produzida pelas células que atribuem e espalhada sobre uma superfície de cultura bem coberto com um microeléctrodo de ouro. A impedância é convertido num parâmetro adimensional denominada célula-índice, que pode ser usado para monitorar a adesão celular, espalhamento, morfologia e, finalmente, a viabilidade celular. Embora esta técnica não fornece informação sobre os mecanismos citotóxicos, a sua sensibilidade permite a detecção de mudanças morfológicas celulares, mesmo em doses muito baixas em que o HCS não é informativo (dados não mostrados). Com base na PREVIexperimentos ous, observamos que a metodologia RTCA é capaz de detectar alterações morfológicas em doses mais baixas em comparação com os endpoints HCS. Seguindo triagem inicial com o analisador de células em tempo real, uma plataforma HCS foi utilizado para obter informações mais detalhadas sobre o tipo de citotoxicidade provocada por cada HPHC. O painel de ensaio HCS permitido ao perfil HPHCs para seu potencial impacto sobre compartimentos celulares / organelas, bem como para identificar aqueles provocando genotoxicidade ou estresse oxidativo. A análise revelou perfis distintos em que as HPHCs selecionados induzem citotoxicidade nas células NHBE. Em geral, todos os compostos, excepto Fenol, foram encontrados para induzir a necrose nas doses testadas mais elevadas. Consistente com um potencial papel no desenvolvimento do cancro 1-aminonaphtalene fosforilação induzida de H2AX como um marcador para a genotoxicidade, no entanto, o painel HCS também descoberto actividade deste HPHC na leitura da toxicidade mitocondrial (massa aumentada e citocromo C releaSE) e estresse oxidativo (depleção de GSH). Da mesma forma, como anteriormente descrito, o fenol foi identificado para induzir disfunção mitocondrial, e causar danos no DNA, bem como o esgotamento de GSH. Crómio (VI), um dos compostos classificados como cancerígenos grupo I, e Crotonaldeído também foram ambos identificados como genotóxica, em particular, o cromo (VI) também induziu apoptose (caspase ativação em cascata) e Crotonaldeído causou aumento da geração de ROS. Finalmente arsênio (V), foi encontrada para induzir cJun fosforilação que é um marcador de activação da via cinase de stress. Neste estudo, utilizou-se células NHBE como um modelo para as células epiteliais do pulmão in vitro. Usando essas células em um ambiente HCS é sem precedentes e permitiu a investigação de uma gama mais ampla de endpoints, incluindo marcadores de genotoxicidade e estresse oxidativo. Ambos células vivas e abordagens de coloração de células fixadas foram descritos nos nossos protocolos, que demonstra a flexibilidade da técnica geral. na fato, os mesmos protocolos pode ser aplicado a uma ampla gama de alvos, que pode ser endereçado pela utilização de qualquer corante fluorescente ou um anticorpo. Para a execução com sucesso dos protocolos de coloração vivo, é importante respeitar o tempo de incubação, como alguns dos corantes têm uma meia-vida limitada e o sinal de fluorescência pode diminuir antes da aquisição de imagem está completado. É também importante ter em conta que, se um tipo de célula diferente é utilizado, todas as condições de coloração devem ser reavaliados, como a concentração de corante óptima e o tempo de incubação pode ser diferente. No presente trabalho, descrevemos um cenário em que apenas cinco compostos em que rastreados com a metodologia HCS. Considerando-se a disposição da placa anteriormente descrita, eles foram doseados mais de dois conjuntos diferentes de placas para um total de 24 placas (6 ensaios e 2-pontos de tempo) .O número de placas também pode ser aumentado, permitindo deste modo para o rastreio simultâneo de mais compostos ou os investigação de mais pontos de extremidade. Antes de o fazer, no entanto, deve-se tomar em consideração que certos pontos de extremidade (GSH e ROS) requerem aquisição imediata, e, como consequência, a dosagem das placas deve ser executada de forma escalonada para permitir a aquisição da placa anterior. Por outro lado, usando um protocolo de coloração de células fixadas representa uma vantagem que as placas podem ser empilhadas, interrompendo o protocolo em qualquer passo, após a fixação, para a conclusão do processo de coloração, numa fase posterior. Esta abordagem, por exemplo, que proporcionam ao operador o tempo para concluir todas as placas de coloração celular ao vivo, sem comprometer a qualidade dos dados. Para optimizar ainda mais o fluxo de trabalho através da diminuição do número de placas, seria também possível multiplexar ponto de extremidade mais juntos. Por exemplo, neste danos DNA contexto e estresse Kinase puderam ser investigadas em conjunto simplesmente usando anticorpo secundário dois com fluorocromos que emitem em diferentes channels. O desenvolvimento contínuo da plataforma HCS, incluindo a semeadura totalmente automatizado de células, diluição do composto, de dosagem e de coloração, assim como a adição de novos pontos de extremidade irá expandir ainda mais a capacidade da plataforma de HCS como uma ferramenta de perfil poderosa para HPHCs sobre epiteliais e outros tipos de células .

Avaliação do risco toxicológico tem historicamente se baseou na utilização de modelos animais que, embora fundamental nas ciências da vida, também estão ligados com deficiências tais como tradutibilidade inconsistentes para os seres humanos e de alto custo. Além disso, tem havido um esforço crescente para encontrar alternativas à experimentação animal no espírito de &quot;Os 3Rs&quot; 2 (substituição, redução e refinamento). Este esforço tem sido acelerado nos últimos anos, não só por causa dos avanços recentes, como técnicas de alto rendimento e abordagens de biologia de sistemas, mas também por causa da legislação que restringe o uso de testes em animais, especialmente na União Europeia. A complexidade das vias de sinalização celulares que regulam a resposta a insultos tóxicos torna evidente que o uso de parâmetros toxicológicos individuais não serão suficientes para descrever a base toxicológico de determinados compostos. Para isso, a interação de centenas de interagir proteins que contribuem para uma rede biológica também terão de ser tomadas em consideração. Para estudar o efeito de agentes tóxicos nessas redes, uma abordagem toxicologia sistema combinado com médio fenotípicas e ensaios de rastreio de alto rendimento é útil para inferir potências e, ao mesmo tempo, proporcionar mais informação sobre o mecanismo de acção de substâncias tóxicas individuais. Neste estudo, utilizou-HCS como uma ferramenta de rastreio poderoso, o qual é composto por um microscópio automatizado e uma aplicação de software biológico, que pode adquirir, processar e analisar os dados de imagem obtidos a partir de ensaios celulares com base em fluorescência específica. Isto permite alterações visuais dentro de uma célula a ser quantificado, a uma única célula ou nível subcelular, e muitos parâmetros a serem analisados ​​simultaneamente. 3 Por exemplo, o ADN quebras de cadeia dupla foram avaliados usando uma identificação à base de anticorpo da fosforilação da histona H2AX e espécies reactivas de oxigénio (ROS) foram quantificados utilizando uma célula-permsuperóxido eable corante sensível. Como as células epiteliais pulmonares representam a primeira barreira biológica contra tóxicos inalados, incluindo o fumo do cigarro, utilizamos células epiteliais brônquicas primárias como um modelo in vitro para traçar o perfil do efeito da HPHCs publicados pelos Estados Unidos Food and Drug Administration. 4 Este manuscrito é um follow -up em um estudo anterior 5 em que se avaliou o impacto biológico de um subconjunto diferente de HPHCs. Como parte do nosso fluxo de trabalho para avaliar a citotoxicidade in vitro, inicialmente avaliou as potências de uma seleção de 15 HPHC de, através de uma análise celular em tempo real baseado em impedância do sistema (RTCA) que nos permitiu estabelecer doses-ranges, adequados para HCS subsequente análise (Figura 1). A avaliação toxicológica HCS foi depois conduzida utilizando nove pontos de extremidade de multi-paramétricos de toxicidade celular, cada monitorizada em dois pontos de tempo (4 e 24 h). Os marcadores utilizados foram indicativos de toxicidade mitocondrial, danos no ADN, o stress quinase, espécies reactivas de oxigénio (ROS), o teor de glutationa (GSH), a caspase 3 - actividade de 7, a libertação do citocromo C e permeabilidade da membrana celular, como descrito na Tabela 1. A nossa abordagem permitiu a identificação e a caracterização do efeito de constituintes do fumo do cigarro através de amostragem da dose e dependente do tempo. Em última análise, isso produziu um perfil toxicológico in vitro para cada HPHC. abordagens multi-genómica também pode ser usado para complementar ainda mais a análise de HCS. Isto iria finalmente também fornecer uma compreensão mais profunda dos efeitos na sinalização celular e / ou do nível de transcrição.

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td></td><td></td></tr> 05331625001 <tr><td>Screener (HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY contador TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plates VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Frame 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de Temperatura Cardio RTCA</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>Selante de Placa de vedação de respiração</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Células Epiteliais Bronquiais Humanas Normais (NHBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>doador masculino caucasiano de 60 anos não fumante&nbsp;</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Quente em 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>ReagentPack Subcultura Kit de reagentes</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Quente a 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tampa do filtro Easy Flask 75&nbsp; cm2</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>96 placa de ensaio de 96 poços preto&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (Para Coloração Nuclear Far Red)</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Corante Mitocondrial: MitoTracker Red CMXRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Corante Mitocondrial: MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>Corante ROS: Dihidroetídio</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>Corante ROS: CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>Corante ROS: MitoSOX</td><td>Life technologies</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH Corante: Monoclorobimano</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>GSH Corante: Monobromobimane</td><td>Life technologies</td><td>M-1378</td><td>Permeabilidade de</td></tr><tr><td>membrana tóxica Corante: YO-PRO-1&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Y3603</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>Permeabilidade da membrana Corante: TO-PRO-1&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3602</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>Permeabilidade da membrana Corante: TOTO-1&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3600</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>Corante Caspase: Cellevent Caspase 3/7 green</td><td>Life technologies</td><td>C10423</td><td>Irritante&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-citocromo C (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-c-Jun (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG DyLight 650&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x tampão de permeabilização</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído a 4%</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>Tampão de bloqueio tóxico</td></tr><tr><td>10x</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco ' s Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hanks</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Estaurosporina</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>Valinomicina tóxica</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Paraquat tóxico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Anisomicina</td> tóxica <td>Sigma</td><td>A9789</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etacrínico</td> tóxico <td>Sigma</td><td>E4754</td><td></td></tr><tr><td>1-aminonaftaleno</td> tóxico <td>Sigma</td><td>34390</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>2-nitropropano</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td></td></tr><tr><td>acetamida</td> tóxica <td>Sigma</td><td>695122</td><td></td></tr><tr><td>acetona</td><td>tóxica</td><td>Sigma</td><td>650501</td></tr><tr><td>acrilamida</td> tóxica <td>Sigma</td><td>A9099</td><td></td></tr><tr><td>Arsênico tóxico (V)</td> <td>Sigma</td><td>A6756</td><td>tóxico</td></tr><tr><td>Benzeno</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>Cromo Tóxico</td></tr><tr><td>(VI)</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td></td></tr><tr><td>Crotonaldeído</td> Tóxico <td>Sigma</td><td>262668</td><td></td></tr><tr><td>Tóxico Metil etil cetona</td><td>Sigma</td><td>34861</td><td></td></tr><tr><td>Níquel Tóxico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td></td></tr><tr><td>Nitrobenzeno</td> Tóxico <td>Sigma</td><td>48547</td><td>Fenol</td></tr><tr><td></td><td>Tóxico Sigma</td><td>P5566</td><td></td></tr><tr><td>Quinolina</td> Tóxica <td>Sigma</td><td>241571</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno</td> Tóxico <td>Sigma</td><td>34866</td><td>Tóxico</td></tr></tbody></table>

análise alto teor de triagem para avaliar os efeitos toxicológicos de constituintes nocivas e potencialmente prejudiciais (hphc)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

A fumaça do cigarro (CS) é um importante fator de risco para doenças cardiovasculares e pulmonares. Porque CS é um aerossol complexo contendo mais de 7.000 produtos químicos 1 é um desafio para avaliar as contribuições de componentes individuais para a sua toxicidade geral. Perfis toxicológicos dos componentes individuais, bem como misturas podem ser no entanto estabelecida in vitro, através da aplicação de alta through-colocar ferramentas de rastreio, que permitem a caracterização dos componentes nocivos e potencialmente prejudiciais (HPHCs) da fumaça do tabaco, tal como definido por os EUA Food and Drug Administration (FDA) 2. Para uma avaliação inicial, um instrumento baseado em impedância foi usado para um tempo real de avaliação, sem rótulo de toxicidade do composto. O instrumento de leitura depende de adesão celular, viabilidade e morfologia que todos juntos fornecem uma visão geral do status celular. Um parâmetro adimensional, denominado índice de celular, é usado para a quantificação. Um conjunto de difprotocolos de coloração dife- foi desenvolvido para uma investigação baseada em imagens de fluorescência e uma plataforma de HCS foi utilizado para obter informações mais detalhadas sobre o tipo de citotoxicidade provocada por cada HPHC. Dos 15 componentes testados, apenas cinco foram seleccionados para análise baseia-HCS em que registada uma calculável LD 50 (&lt;20 mM). Estes incluíram 1-aminonaphtalene, Arsénio (V), cromo (VI), Crotonaldeído e fenol. Com base no seu efeito na HCS, 1-aminonaphtalene e fenol pode ser identificada para induzir disfunção mitocondrial, e, em conjunto com crómio (VI) como genotóxico com base no aumento da fosforilação da histona H2AX. Crotonaldeído foi identificado como um indutor de estresse oxidativo e arsênico como um ativador de quinase via do estresse. Este estudo demonstra que uma combinação de tecnologias baseadas em impedância e HCS fornece uma ferramenta robusta para a avaliação in vitro dos constituintes CS.

RTCA Porque os pontos finais HCS não será informativa quando nenhum efeito tóxico é detectada, os compostos não mostram diminuição da viabilidade celular até à concentração máxima no RCTA não são testados por HCS (Figura 3b, c, d, G, K, L, M , p). Os compostos que apresentam diminuição da viabilidade celular em apenas a mais alta concentração (Figura 3e, o) são também desmarcada para HCS. Finalmente, apenas os constituintes com um LD 50 calculável (&lt;20 mM) são seleccionadas para posterior análise HCS (Figura 3a, f, h, j, n). HPHCs que satisfazem os critérios acima são: 1-aminonaphtalene, Arsénio (V), cromo (VI), Crotonaldeído e fenol. HCS Como uma verificação de qualidade (QC), os controlos positivos são fiprimeiro analisados ​​para assegurar que o processo de coloração é realizada corretamente. Imagens representativas de células tratadas com o controlo positivo são mostrados na Figura 6. Os valores de dados são normalizados ao veículo, como descrito anteriormente. Sem curvas de resposta à dose são representados como apenas três doses são testadas e não todas as três doses são considerados em cada ponto de tempo. A dose de controlo positivos são seleccionada (com base em experiências anteriores, dados não mostrados), de modo que as respostas apropriadas são observados para cada parâmetro em ambos 4 horas e 24 horas. Em doses particulares 1 e 2 são usados ​​para avaliar o efeito em 4 horas, enquanto as doses 2 e 3 são usados ​​para avaliar o efeito às 24 h. As placas são descartados se nenhuma resposta for observada para as doses de controlo positivo. Note-se que para todos os terminais, excepto o potencial de membrana mitocondrial e conteúdo de GSH, é esperado um aumento da intensidade de sinal. Todos os compostos, com exceção de Fenol, induziu uma pheno necrótica<html> tipo, com base no aumento da permeabilidade da membrana celular (Figura 7a, F, H, L). 1-aminonaphtalene, crómio (VI), Crotonaldeído e fenol foram identificados como sendo genotóxicos baseado no aumento da fosforilação da histona H2AX (Figura 7e, j, n, p). Fenol e 1-aminonaphtalene foram encontrados para induzir a disfunção mitocondrial grave (Figura 7b, o) que, com 1-aminonaphtalene, levou a um aumento da liberação de citocromo C (Figura 7c). A detecção de um aumento da actividade da caspase 3/7 fornecida evidência de evento de apoptose por exposição crómio. Indução de estresse oxidativo (ROS ou GSH) também foi detectada após tratamento com 1-aminonaphtalene, Crotonaldeído e fenol (Figura 7d, m, q). Finalmente, o arsénio induz o stress celular, como demonstrado pelo aumento da fosforilação do factor de transcrição cJun (figura 7g). carga / 53987 / 53987fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Composto Tox-Profiler fluxo de trabalho. A) Representação esquemática do fluxo de trabalho seguido neste estudo. Em primeiro lugar, uma determinação de dose-gama foi realizada utilizando a plataforma RTCA para seleccionar as doses apropriadas para a subsequente HCS para caracterizar os perfis de toxicidade específica de composto. B) Desenho experimental do estudo. 24 horas após a semeadura, as células foram dosados ​​e valores de impedância continuamente monitorada durante as 24 horas seguintes, enquanto HCS endpoints foram investigados 4 e 24 horas após a dosagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" /> Figura 2. RTCA Placa de Exposição. Placa Composto mestre é gerado pela primeira vez por executar uma de cinco etapas 01:10 série de diluição. Cada composto,incluindo o controlo de veículo (dose 0) são então adicionados em triplicado à placa de exposição em conjunto com o meio e estaurosporina como controlos. Note-se que as doses sequência é mantida após a transferência, doses mais altas estão em linha número 1, enquanto comandos do veículo estão em linha número 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" /> Figura 3. Representante RTCA viabilidade celular Resultados. A) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropano, c) acetamida, d) de acetona, e) acrilamida, f) arsênio (V), g) benzeno, h) de crómio (VI) , j) crotonaldeído, k) metil etil cetona, l) Nickel (II), m), nitrobenzeno, n) fenol, o) quinolina, p) Adicionou-se tolueno. Em 24 horas após a administração, a área sob a curva (AUC) foi calculada para cada dose (incluindo o controlo positivo e do veículo) e normalizado numa gama de 0 a actividade -100% (eixo y), em que 0 reflecte a actividade de o veículo e -100 do controlo positivo. Os valores foram então representados graficamente e ajustados utilizando uma equação de Hill de quatro parâmetros e, quando possível, LD50 foi calculada. As concentrações são expressas em uma escala log (eixo-x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" /> Figura 4. Esquema de diluição para o controlo positivo Compostos para HCS Os ensaios. A) Adição de controlos positivos e veculo para a placa de diluição em série. b) A diluição em série dos controlos positivos. c) 200X controlos positivos doses. DE) Diluição dos 200x doses controlos positivos em meio (1:40) para gerar a placa de controlo positivo contendo as doses 5x. Note-se que cada dose é diluído em triplicado para refletir o layout final na placa de exposição). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" /> Figura 5. HCS Placa de Exposição. Placa Composto mestre é gerado pela primeira vez por realização de uma diluição de cinco etapas. Cada composto, incluindo o controlo de veículo (dose 0) são então adicionados em triplicado à placa de exposição em conjunto com os controlos positivos. Note que a ordem doses é mantido após a transferência,doses mais elevadas são em número da linha 1 enquanto comandos do veículo estão em linha número 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" /> Figura 6. Representante fluorescentes Fotos de anticorpo-ou Dye-manchados Cells a) Parâmetros nucleares - corante Nuclear:. Um corante permeável que se liga ao DNA em células vivas ou fixas. Esta mancha é usada para identificar células individuais de rótulos, a região nuclear b) Necrose - corante permeabilidade da membrana celular:. A detecção à base de corantes de integridade da membrana celular. Reagente é intrinsecamente impermeável à membrana celular. Durante a necrose, a membrana torna-se permeável e o corante entra na célula e liga-se ao ADN produzindo um forte fluorescente s. ignal c) A apoptose - citocromo C: detecção baseada em anticorpo da libertação de citocromo C, uma característica bem conhecida da apoptose precoce. Após a indução de apoptose, citocromo c é libertado a partir da mitocôndria e difunde-se para o núcleo d) de danos de ADN - pH2AX:.. Detecção baseada em anticorpo da fosforilação de H2AX histona, uma característica bem conhecida de quebras duplas ADN de cadeia e) Tensão Quinase - cJun:. detecção baseada em anticorpo da fosforilação em Ser-73 de cJun, uma característica bem conhecida de stress celular f) O stress oxidativo - DHE: detecção à base de corantes de radicais superóxido. -Se Dihydroethidium fluorescente azul no citoplasma, enquanto a forma de etídio oxidado fluorescência vermelha em cima do DNA intercalação g) GSH - mBcl:. Detecção de base de corantes de moléculas de GSH livres. mBcl reage com a GSHgerar um produto altamente fluorescente h) A apoptose - Caspase 3/7 activação:. detecção de base de corantes de 3/7 atividade caspase. Reagente é não fluorescente com um péptido de quatro aminoácidos que inibe a ligação ao ADN. Após a activação de caspase-3/7, o péptido é clivado permitindo que o corante se ligar a ADN e produzir uma resposta brilhante, fluorogénico. Painéis BH mostra células tratadas com controlo positivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" /> Figura 7. Representante HCS Resultados. 1-aminonaphtalene (ae), Arsénio (V) (F e G), cromo (VI) (hk), Crotonaldeído (ln) e fenol (OQ). 4 h (linha azul) e24 h (linha laranja) sinais foram calculados para cada dose e normalizada para a actividade de veículo (0%). Valores que não estão incluídos na curva cálculos de montagem são mostradas em cinza. As concentrações são expressas em uma escala log (eixo-x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Ensaio </td><td> Endpoint # </td><td> endpoint biológica </td><td> compartimento celular </td><td> recurso de saída </td></tr><tr><td rowspan="4"> citotoxicidade </td><td> 1 </td><td> Massa mitocondrial 6 </td><td> Citoplasma </td><td> Mancha área média </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Potencial de membrana mitocondrial 6 </td><td> Citoplasma </td><td> intensidade média local </td></tr><tr><td> 3 </td><td> liberação do citocromo C <sup&gt; 7 </td><td> Núcleo </td><td> intensidade média </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Permeabilidade da membrana celular 8 </td><td> Núcleo </td><td> intensidade média </td></tr><tr><td> Dano ao DNA </td><td> 5 </td><td> fosfo-H2AX 9 </td><td> Núcleo </td><td> intensidade média </td></tr><tr><td> Kinase estresse </td><td> 6 </td><td> fosfo-cJun 10 </td><td> Núcleo </td><td> intensidade média </td></tr><tr><td> ROS </td><td> 7 </td><td> ROS 11 </td><td> Núcleo </td><td> intensidade média </td></tr><tr><td> conteúdo de GSH </td><td> 8 </td><td> GSH 12 </td><td> Citoplasma </td><td> intensidade média local </td></tr><tr><td> apoptose </td><td> 9 </td><td> Caspase 3 13 </td><td> Citoplasma </td><td> intensidade média local </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Lista de HCS umssays e endpoints. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td rowspan="2"> Veículo </td><td colspan="6" rowspan="2"> doses RTCA (uM) </td><td rowspan="2"> LD 50 </td><td colspan="5"> doses HCS </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> Viabilidade celular-seleccionado (uM) </td><td> 3R4F (nM) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1-Aminonaphtalene </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 280? M </td><td> 2.000 </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 150 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2-nitropropano </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Acetamide </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Acetona </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> acrilamida </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Arsénio (V) </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 160 uM </td><td> 200 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 25 </td> &lt;td&gt; 0,17 </td></tr><tr><td colspan="2"> Benzeno </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> O crómio (VI) </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 20 uM </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td colspan="2"> crotonaldeído </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 200 uM </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2.000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Metil-etil-cetona </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt;20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Níquel </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> nitrobenzeno </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Fenol </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 2.300? M </td><td> 5.000 </td><td> 2.000 </td><td> 1.000 </td><td> 500 </td><td> 240 </td></tr><tr><td colspan="2"> quinolina </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td&gt; <td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Tolueno </td><td> água </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2. Lista de compostos HPHC testados com o LD Relativa 50 às 24 horas de tratamento. Os compostos selecionados para análise HCS são destacados em laranja e doses testadas também são dadas. A dose 3R4F é equivalente à quantidade de constituinte presente na fumaça de um pedaço de madeira do 3R4F cigarro de referência. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Ensaio </td><td> Composto </td><td> Solução stock </td><td> Solvente </td&gt; <td colspan="3"> Dose (s) (uM) </td></tr><tr><td> Viabilidade celular </td><td> estaurosporina </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td colspan="3"> 50 </td></tr><tr><td> citotoxicidade </td><td> valinomicina </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Dano ao DNA </td><td> paraquat </td><td> 100 mM </td><td> DMSO </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Kinase estresse </td><td> anisomicina </td><td> 2 mM </td><td> DMSO </td><td> 10 </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> rotenone </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1.000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> conteúdo de GSH </td><td> ácido etacrínico </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1.000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> apoptose </td><td> estaurosporina </td><td> 40 mM </td><td> DMSO </td><td> 200 &lt;/ Td&gt; <td> 50 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Lista de controlos positivos e concentrações utilizadas para cada ensaio.

O objetivo do estudo foi avaliar o impacto biológico de 15 constituintes da fumaça de cigarro usando uma combinação de um analisador de células em tempo real baseado em impedância e uma plataforma baseada em triagem de alto conteúdo (HCS) para avaliação toxicológica in vitro. Este estudo fornece informações sobre doses efetivas, toxicidade e modos de ação dos compostos testados.

Análise alto teor de triagem para avaliar os efeitos toxicológicos de Constituintes nocivas e potencialmente prejudiciais (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

O objetivo geral desta abordagem, que combina um analisador de células em tempo real baseado em impedância e uma plataforma baseada em triagem de alto conteúdo, é fornecer informações sobre doses efetivas, toxicidade e efeitos biológicos, para obter o perfil Tox dos compostos testados. Essa abordagem pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Toxicologia. Abordando, por exemplo, citotoxiticidade, genotoxicidade e respostas ao estresse celular.Além disso, não apenas fornece informações sobre vários parâmetros bioquímicos e morfológicos simultaneamente, mas também pode ser aplicado a uma gama diferente de tipos de células e modelos de cultura de células. Devido à jurisdição e limitação, toda a abordagem será realizada avaliando apenas um pequeno pedaço de composto. Pelo mesmo motivo, apenas um protocolo será mostrado para demonstrar a Avaliação de Triagem de Alto Conteúdo.Demonstrando o procedimento estarão Stefano Acali e Alexander Laurent, técnicos do meu laboratório. Para ver as células epiteliais brônquicas humanas normais, ou células NHBE, programe o instrumento para definir o número e a duração das medições de impedância. Neste estudo, os dados são registrados a cada 15 minutos, durante 48 horas.Meça o fundo da placa pipetando 50 microlitros de meio pré-aquecido em cada poço de uma placa RTCA de 96 poços. Esta etapa representa um requisito técnico para o instrumento calcular a resistência elétrica média a ser usada como referência de linha de base para cálculos baseados em células. Em seguida, adicione 50 microlitros de suspensão celular a uma concentração de 144.000 células por mililitro ao meio já existente em cada poço da placa RTCA.Uma vez que a célula tenha aquecido, é muito importante deixar a placa em temperatura ambiente por 40 minutos para permitir que as células se fixem e obtenham uma distribuição celular homogênea. Incube as placas RTCA no berço da incubadora e comece a registrar os dados pelas próximas 24, mais ou menos duas horas, antes da dosagem. Para o controlo positivo, diluir a solução-mãe de estaurosporina a 10 milimolares, um a 10, em DMSO.Adicione cinco microlitros da diluição a 195 microlitros de meio para obter uma solução de trabalho 5x. Para os constituintes nocivos e potencialmente nocivos, dissolva cada um deles no veículo para gerar uma solução de estoque de um molar. Em seguida, diluir cada solução-mãe da substância de ensaio, um a 10, em meio para obter uma solução de 100 milimolares.Gere a placa mestra composta adicionando primeiro meio mais 10% de veículo nos poços de B a F e a solução de 100 milimolares no poço A. Execute uma diluição em série de cinco etapas, de um a 10, para obter as soluções de trabalho 5x. Para a dosagem, pause o instrumento RTCA, abra o berço para remover a placa de exposição e coloque a placa na ferramenta de temperatura RTCA para evitar o resfriamento das células, o que pode afetar a medição da impedância. Adicione 25 microlitros de solução 5x da placa mestra Compound às células em triplicata, mantendo a mesma ordem de dosagem da placa mestra Compound.Não remova o meio de cultura celular existente. Em seguida, adicione 25 microlitros de solução de controle positivo 5x às células na metade direita da linha inferior, sem remover o meio de cultura existente. Da mesma forma, adicione 25 microlitros de meio às células na metade esquerda da linha inferior.Depois de selar a placa com o selador de placas, coloque a placa de volta no berço RTCA e trave-a. Reinicie a gravação de dados para o tempo de exposição desejado. Após o registro dos dados, analise os dados de viabilidade celular RTCA para determinar qual substância de teste usar na análise HCS.Neste experimento, 1-aminonaftaleno, arsênico, cromo e crotonaldeído são selecionados para análise de HCS. Para ver as células NHBE, adicione 100 microlitros de uma suspensão celular a 120.000 células por mililitro a cada poço de uma placa preta de 96 poços. Depois de deixar a placa HCS em temperatura ambiente por 30 minutos, para permitir que as células se fixem nos poços, incube a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 24, mais ou menos duas horas, antes da dosagem.Para o controlo positivo, distribuir 40 microlitros da solução-mãe de cada controlo positivo na coluna dois. Em seguida, dispense 20 microlitros do veículo nas colunas três e cinco. E 40 microlitros do veículo na coluna quatro.Retire 12 microlitros dos poços da coluna dois, distribua para os poços da coluna três e misture. Continuar até obter uma diluição final em série com três doses e veículo para cada composto de controlo positivo. Para gerar a placa de controle positivo, prepare uma diluição de um a 40 em meio das três doses e veículo.Para fazer a placa principal composta, ressuspender e diluir cada solução-mãe da substância de ensaio, um a 10 em meio para uma concentração de 100 milimolares. Realizar diluições utilizando meio com veículo a 10% para obter as 5 doses seleccionadas para cada substância de ensaio. Tanto os controles positivos quanto a placa composta estão agora prontos para serem dosados sobre a placa de exposição.Em seguida, adicione 25 microlitros de soluções 5x da placa mestra Compound às células em triplicata, mantendo a mesma ordem de dosagem da placa mestra Compound. Não remova o meio de cultura celular existente. Em seguida, adicione 25 microlitros da solução 5x da placa de controle positivo às células da linha inferior, mantendo a mesma ordem de dosagem da placa de controle positivo.Preparar um volume suficiente da solução de coloração de células vivas, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, dilua o corante mitocondrial e o corante de permeabilidade da membrana na solução de coloração de células vivas, de acordo com as instruções do fornecedor. Adicione 50 microlitros da solução de coloração de células vivas a cada poço da placa designada Ensaio de Citotoxicidade.Não remova o meio de cultura de células e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius, 5% de CO2. Aspire suavemente o meio e a solução de coloração e adicione 100 microlitros de solução de fixação a cada poço. Em seguida, incube a placa por 20 minutos em temperatura ambiente, no escuro.Após a incubação, aspire suavemente a solução de fixação e lave uma vez com 100 microlitros por poço de tampão de lavagem. Remova o tampão de lavagem e adicione 100 microlitros por poço de 1x tampão de permeabilização a cada poço, antes de incubar por 10 minutos em temperatura ambiente, no escuro. Aspirar o tampão de permeabilização e lavar a placa duas vezes com 100 microlitros, por alvéolo, de tampão de lavagem.Em seguida, aspire o tampão de lavagem e adicione 100 microlitros de 1x tampão de bloqueio a cada poço. Em seguida, incube por 15 minutos em temperatura ambiente, no escuro. Dilua o anticorpo anticitocromo C, um a 250, em solução de anticorpo primário.Em seguida, aspire o tampão de bloqueio e adicione 50 microlitros, por poço, de solução de anticorpo primário a cada poço, antes de incubar por 60 minutos em temperatura ambiente, no escuro. Dilua o anticorpo anti-camundongo, um a 500, em anticorpo secundário e solução nuclear. Além disso, dilua o corante nuclear, um a 1.000, em anticorpo secundário e solução nuclear.Após aspirar a Solução Primária de Anticorpos, lave a placa três vezes com 100 microlitros, por poço, de tampão de lavagem, usando a lavadora de placas. Aspire o tampão de lavagem e adicione 50 microlitros, por poço, de anticorpo secundário e solução nuclear a cada poço da placa. Agora, incube a placa por 60 minutos em temperatura ambiente, no escuro.Após a aspiração do Anticorpo Secundário e da Solução Nuclear, lave a placa três vezes com 100 microlitros de, por poço, de tampão de lavagem usando a lavadora de placas. Em seguida, adicione 100 microlitros, por poço, de tampão de lavagem. A placa está agora pronta para ser avaliada no instrumento HCS e a aquisição é iniciada.São apresentados resultados representativos da viabilidade celular RTCA do tratamento com a substância em estudo. Um efeito tóxico dependente da dose é obtido ao longo de 24 horas de exposição apenas com 1-aminonaftaleno, arsênico, cromo e crotonaldeído, pois todos exibiram um LD50 calculado inferior a 20 milimolares. Nenhum efeito tóxico foi obtido com os outros compostos.Aqui são apresentados resultados representativos do HCS apenas para o tratamento com 1-aminonaftaleno. O efeito tóxico do 1-aminonaftaleno está induzindo um dano grave da membrana celular, o que leva a um aumento da permeabilidade da membrana celular de maneira dose-dependente, após quatro horas de exposição. O composto também está afetando as mitocôndrias, induzindo um aumento de massa após quatro horas de exposição, juntamente com a liberação do citocromo C, que é então detectável nos núcleos após quatro e 24 horas de exposição.Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada dentro de dois a três dias, pois a maioria delas requer cerca de uma hora por dia de tempo prático para configuração e dosagem. Dependendo do protocolo selecionado, a triagem de alto teor requer no máximo três horas e meia para a execução de todo o procedimento de coloração. Ao tentar este procedimento, lembre-se de que, embora a seleção de uma gama mais ampla de endpoints adicione complexidade ao fluxo de trabalho, ela não aumentará substancialmente o tempo.Com um fluxo de trabalho ideal, de fato, várias placas podem ser avaliadas em paralelo. O desenvolvimento contínuo da plataforma de triagem de alto conteúdo, incluindo configuração de células totalmente automatizada, diluição de compostos, dosagem e coloração, e a adição de um novo ponto final, expandirá ainda mais a capacidade da plataforma de triagem de alto conteúdo como uma ferramenta poderosa para perfis toxicológicos. Além disso, a combinação de múltiplos parâmetros toxicológicos únicos com um rendimento tão elevado levar-nos-á um passo em frente no nosso esforço para reduzir os ensaios químicos em animais.

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