Name: In Vivo Biosensor Tracks apoptótica não-Caspase Atividade em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Aprenda a rastrear atividade não-apoptótica de caspases em Drosophila melanogaster usando o biosensor CaspaseTracker. Este método permite detectar caspases ativas em células saudáveis, revelando funções celulares além da morte celular.

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Agradecemos Polan Santos e Darren Obbard para Drosophila ilustrações Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena para a utilização do insetário JHMRI. Este trabalho foi apoiado pela irmandade Fundação Life Science Research (HLT), University Grants Comissão do Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) e NIH concede NS096677, NS037402 e NS083373 (JMH). Ho Lam Tang é um Shurl e Kay Curci Fundação Fellow da Fundação de Pesquisa Ciências da Vida.

1. Preparação de Moscas CaspaseTracker <ol><li> Para preparar CaspaseTracker (DQVD) voa para experimentos, executar esta cruz: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi&gt; Parar&gt; GFP-NLS), através da transferência de 7-10 fêmea virgem (ou masculino) moscas que transporta o substrato da caspase-biossensor mCD8 DIAP1-Gal4 dirigido pelo promotor de ubiquitina de 35 em conjunto com o mesmo número do macho (ou fêmea) G-moscas de rastreio, que têm o segundo equilibrador cromossoma CYO para evitar letalidade da combinação homozigótica do G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, e Ubi&gt; Parar&gt; GFP-NLS) 34. Lugar voa num frasco de alimentos frescos com pasta de fermento fresco como fonte de proteína. </li><li> Incubar arquivos a 18 ° C durante 5 a 7 dias (máximo de 2 semanas) e em seguida, remover o pai voa a partir do frasco para evitar a superlotação com a nova descendência, e para configurar novos frascos de melhoramento. </li><li> Continuar a incubação a 18 ° C até que a descendência voa eclose. Seleccione a não-CYO [não cURLy asa] progênie do genótipo correto de CaspaseTracker, que são transgénicos para CaspaseTracker e G-35 oligoelementos. </li><li> Ao mesmo tempo, gerar controlo parental moscas W118 não-transgênicas e caspase-insensitive (DQVA) voa em paralelo para verificar a RFP CaspaseTracker específico e fluorescência da GFP. </li><li> Realizar genotipagem por PCR para confirmar os ficheiros com CaspaseTracker utilizando os primers: 5&#39;-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3&#39;-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, produzindo um produto de 3897 pb. Para genotipagem do loci G-Trace, use os seguintes primers para GFP (474 ​​pb), 5&#39;-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3&#39;-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; para RFP (258 pb), 5&#39;-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3&#39;-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; e para Flpase (655 pb), 5&#39;CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3&#39;-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. Para genotipagem Gal4 no vector pUWR (554 pb), 5&#39;-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3&#39;-TGG TGG AAT GGT ACG TCT AGA. </li></ol> 2. Preparação de tecidos, Coloração e montagem <ol><li> Para dissecções mosca, evitar tecidos dissecados de degola para pontas de plástico para pipetas e tubos de centrífuga, dicas revestimento e tubos com albumina 1% de soro bovino (BSA) dissolvidos na água. </li><li> Dissecar voa sobre uma almofada de silicone usando uma pinça. <ol><li> Para evitar danificar as pontas de pinça sobre uma superfície rígida quando se realiza a dissecção de tecidos, realizar dissecção sobre uma superfície de silício. Para fazer placas de silicone de dissecação, derreta o silício no kit comercial de acordo com as instruções do fabricante (lista de materiais). Depois de derreter o silicone, adicionar 3 a 4 ml de uma cultura de tecido de diâmetro prato de 60 mm. pratos de silício pode ser reutilizado. </li><li> Anestesiar uma mosca com CO 2, e transferi-lo para uma placa de silicone com 1 ml de PBS frio. Introduzir o CO 2 para um frasco contendo a mosca usando uma zarabatana, e depois transferir a mosca anestesiados toa Pad que tem uma fonte de CO 2. </li><li> Utilizar um par de pinças para segurar a cabeça da mosca, e um segundo par de fórceps para puxar o tórax na direcção oposta para desligar a cabeça mosca do corpo de cobertura, sem danificar a ligação entre a cabeça e o intestino anterior. </li><li> Use 2 pares de pinças para remover as asas e pernas do tórax. </li><li> Utilizar um par de pinças para segurar o tórax, e um outro par de fórceps para puxar o abdómen para separá-lo do tórax de novo sem danificar a ligação entre o intestino anterior e do intestino médio. </li><li> Dissecar órgãos internos incluindo cérebro, intestino, túbulos de Malpighi e os ovários como demonstrado anteriormente. 39-41 </li><li> Remova todas as peças do cutícula e os corpos gordos com uma pinça como estes tecidos produzir forte autofluorescência. Paciência e prática são necessários para preparar um sistema de órgão completo, como mostrado. </li></ol></li><li> Transferir tecidos dissecados para 1,5 tubos de centrífuga ml e corrigir tecidos with 0,5 ml de paraformaldeído a 4% em PBS (solução salina tamponada com fosfato), à TA, durante 20 a 30 minutos com rotação no escuro para evitar RFP e GFP de branqueamento em tecidos. Evite fixação prolongada que pode comprometer os resultados da coloração subsequentes. </li><li> Remover o paraformaldeído por pipetagem suave e lavagem 3 vezes com 0,5 ml de PBST (PBS + 0,1% de Triton X-100) à TA. </li><li> Permeabilizar as tecidos com 0,5 ml de PBST a 4 ° C durante a noite com agitação suave. incubações mais curtos pode causar incompletos permeabilização e coloração compromisso resultados. <ol><li> Se é necessário para reduzir a coloração de fundo, considere incubando tecidos em 0,5 ml de PBST com 1% de BSA, em vez de PBS. </li></ol></li><li> Lavar os tecidos por 3 vezes com 0,5 ml de PBST. </li><li> Para corar núcleos e actina filamentosa (F-actina), aplicam-se 0,5 ml de PBST com 10 ug / ml de Hoechst 33342 corante azul nuclear e 0,3 uM Alexa Fluor 633 faloidina F-actina mancha e incubar em simultâneo com os tecidos durante 1 h, à RT wom rotação suave no escuro. Evitar manchar prolongado como este vai aumentar o fundo. <ol><li> Para a imunocoloração, incubar fixadas e permeabilizadas tecidos com 0,1% de Triton X-100 em 0,5 mL de PBS durante a noite a 4 ° C, mancha com diluição 1: 100 de anticorpo anti-elav ou com diluição 1: 200 de anti-caspase-3 durante a noite a 4 ° C (300 mL). Seguir por o anticorpo secundário correspondente diluída 1: 100 e incubar durante 1 a 3 h à TA. Veja Lista de Materiais para obter informações anticorpo específico. </li></ol></li><li> Lavar os tecidos 3 vezes, cada uma durante 5 minutos em 0,5 ml de PBST com rotação suave. </li><li> Com uma pipeta, remover todos PBST, e, em seguida adicionar 200 uL de montagem agente anti-branqueador (ver materiais) para cobrir completamente os tecidos durante 1-3 h à TA ou a 4 ° C durante a noite. tecidos que têm óptimas totalmente absorvidas o agente de montagem irá afundar para o fundo do tubo. </li><li> Pré-limpar a lâmina de vidro com água ou com etanol a 70% e transferir os tecidos com agente de montagem para os Glass slide. </li><li> Com cuidado, coloque uma lamela de vidro sobre os tecidos. Aplique vaselina para a lâmina de vidro ea tampa de deslizamento para evitar a destruição do tecido por overcompression. Remover agente de montagem extra com papel de seda. </li><li> Selar a lamela, aplicando unha polonês ao longo das bordas da lamínula para evitar vazamento de agentes de montagem dos tecidos. </li></ol> 3. Microscopia Confocal <ol><li> Use um confocal epi-fluorescência microscópio invertido. No entanto, microscópios up-direito pode ser também utilizado. Para tecidos de imagem usando ladrilhos, manter a temperatura ambiente estável para evitar desvio de foco e deslocamento do plano xy devido à expansão e contração térmica dos componentes. sistemas de controle ambiental e sistemas de compensação foco deriva ajudar a evitar esse problema devido à perda de termo-equilíbrio do sistema de microscópio. </li><li> Coloque o slide no palco do microscópio. Tome algumas imagens de teste utilizando baixa resolução (125 x 125 pixels) de umd determinar o número apropriado de peças necessárias para cobrir toda a região de interesse (ROI). </li><li> Definir o sistema de digitalização microscópio para capturar imagens com resolução de digitalização, como 500 x 500 pixels. Selecione o objetivo, como um 20X NA 0.8 ou 63X NA 1.4 objetivo Plan-Apochromat para analisar tecidos através de lamelas de vidro, de modo que cada uma das imagens (telhas) sobrepõe-se em 20% de todos os lados. </li><li> Configurar a sequência de imagens de maior para o menor comprimento de onda de excitação, como a luz de comprimento de onda provoca menor de foto-branqueamento. A sequência de maior para o menor comprimento de onda de excitação é: (i) 633 nm para faloidina F-actina e para anticorpos para as caspases activadas, (ii) 561 nm para RFP, (III) a 488 nm para GFP, e (iv) a 405 nm durante mancha nuclear Hoechst. </li><li> Durante a gravação, minimizar a exposição das células à excitação laser fluorescente durante o processo de imagiologia para evitar a foto-branqueamento, reduzindo a intensidade do laser para obter imagens de alta qualidade dos tecidos. </li><li> Depois que eumagos são recolhidas, fundir as imagens usando o software microscópio. </li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui ilustramos da construção e interiores funcionamento do CaspaseTracker que facilitam a detecção de atividade de caspase basal generalizada nos tecidos saudáveis. Os passos críticos para detectar a actividade de caspase não apoptótica in vivo são os seguintes: 1) a geração de moscas com o transgene biossensor, 2) verificar a função repórter específicos da caspase com controlos adequados, 3) praticando técnicas de dissecação para observar todos os sistemas de órgãos internos de adulto de Drosophila, ...

As caspases são proteases de cisteína que medeiam a morte celular por apoptose por clivagem de muitas proteínas intracelulares após resíduos aspartato-chave. Por exemplo, caspases iniciadoras activar as caspases efectoras, as nucleases de ADN desreprimir, componentes do citoesqueleto e clivam alterar a composição lipídica das membranas celulares para desmantelar rapidamente as células e estimular o seu reconhecimento por células e imersão que eliminam os cadáveres célula vizinha. Estima-se 4/1 que milhares de milhões de células morrem por dia no corpo humano, e a apoptose é um importante mecanismo de morte de células tumorais induzida por quimioterapia. 5 um conjunto diferente de caspases podem causar morte celular por processos não apoptóticas distintas para estimular a imunidade inata. 6 Portanto, maioria das pesquisas sobre caspases tem se concentrado em suas funções pró-extermínio. Curiosamente, os primeiros indícios no campo revelou que os mesmos caspases responsáveis ​​pela morte celular promovendo também têm não-morte funções. Estudos pioneiros demonstraram que as caspases estão envolvidas em diversas funções celulares em células saudáveis, incluindo a regulação da proliferação e migração celular durante o desenvolvimento embrionário. 7-9 As caspases são necessários para a individualização espermátide em Drosophila 10,11, para o bloqueio de uma via de morte celular alternativa necroptotic em ratinhos 12,13, e para o processamento de microARN em C. elegans. 14,15 Em talvez o mais longevo células, neurônios, caspases e outra maquinaria apoptótica estão implicados na regulação da actividade neuronal pela poda terminações sinápticas, um processo que se acredita ser essencial reforçar outras sinapses de aprendizagem e memória. 16- 18 é possível que as caspases facilitar poda sináptica por um tipo de mini-apoptose de pequenas projecções neuronais sem morte de células inteiras. 19 No entanto, as caspases podem ter funções alternativas não relacionados com acontecimentos de apoptose semelhante. 20,21 papel duplos na vida e morte não são exclusivos para caspases; BCL-2 proteínas da família e citocromo c têm papéis em energetics celulares em células saudáveis, mas também são parte da via apoptótica núcleo que é ativado por muitos tipos de stress celular. 22-25 Embora não esteja provado, parece lógico que a evolução tem ligado dia -jobs to death-empregos dentro das mesmas moléculas para assegurar a eliminação atempada das células impróprias ou indesejáveis. Actualmente, os mecanismos moleculares da actividade de caspase não apoptóticas não são compreendidas, e o grau de actividade de caspase não apoptótica, durante o desenvolvimento embrionário e em tecidos adultos, também não é conhecido. Um grande desafio é a dificuldade em distinguir dia-empregos da morte-empregos de caspases. Em contraste com a apoptose e pyroptosis, quando a actividade de caspase é amplificada por uma cascata proteolítica, é esperado que os trabalhos de dia-caspases para ocorrer a níveis muito mais baixos de actividade enzimática, provavelmente abaixo de detecção disponível por muitos Technologies. Antes do trabalho aqui apresentado, outros desenvolveram uma variedade de biossensores de caspase para fins diferentes. Os biossensores SCAT (por exemplo, ECFP-DEVD-Vénus) detectar rapidamente a actividade da caspase em tempo real e em células em cultura de tecidos animais usando FRET 26,27. Após a clivagem de caspase, a porção da GFP dirigido ao núcleo de Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) sofre relocalização subcelular em poucos minutos quando o seu plasma membrana de tirante é clivada por caspases. 28 do mesmo modo, ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes a partir do citosol para o núcleo por clivagem de caspase. 29,30 Mais recentemente, o cromóforo em iCasper foi habilmente manipulada para fluorescência quando clivada por caspases, que permite a detecção da actividade de biossensor em tempo real, nos neurónios de embriões de Drosophila, mas principalmente em associação com o desenvolvimento da morte celular. morte 31 de caspase-dependente de neurónios olfactivos durante o envelhecimento estava demonstavaliado por imuno-detecção da forma clivada da caspase-biossensores de CPV (por exemplo, mCD8-PARP-Vénus). 32,33 modo importante, a forma activada da caspase-3 foi detectada na ausência de morte celular por imunocoloração sensível nas espinhas de neurónios em cultura, e no soma utilizar a fluorescência dependente da caspase do corante repórter CellEvent nuclear, mas foram encontradas dificuldades devido a foto-toxicidade, embora a morte celular foi atrasada até depois da eliminação da coluna. 19 Assim, novos biossensores caspases são necessários para detectar e rastrear células com atividade caspase basal in vivo. Para superar essas dificuldades, geramos um romance dupla biossensor cor caspase, designado CaspaseTracker. Esta estratégia combina uma versão modificada da Drosophila sensível caspase-Apoliner biossensor 28 de Drosophila com o G-rastreio do sistema de recombinase FRT 34 para etiquetar de forma permanente e acompanhar as células in vivo. &lt;sup&gt; 35 O sistema G-TRACE Gal4-activado permite níveis muito baixos de caspases para ativar CaspaseTracker, resultando na expressão RFP no citoplasma e permanente expressão GFP nuclear-alvo em qualquer célula que já experimentou a atividade da caspase 35 Este sistema pode rotular. células ao longo da vida em animais inteiros utilizando Drosophila melanogaster, um sistema modelo tratável e amplamente usados para o estudo de caspases e morte celular 36-38.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Consumíveis e Reagentes</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Meio de montagem</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Pinça Dumont grau de biologia, aço inoxidável</td></tr><tr><td>Slides de gota suspensa</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Slides de vidro</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sondas moleculares</td><td>Coloração de DNA H1399</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>A22284</td><td>Coloração de actina</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-elav Rat-Elav-7E8A10</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma (DSHB)</td> <td>ID de Registro de Anticorpos:&nbsp; AB_528218&nbsp;</td><td>Coloração para ELAV pan-neuronal de Drosophla</td></tr><tr><td>Anticorpo clivado caspase-3 (Asp175)</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>#9661</td><td>Mancha para fragmento ativo de caspase-3</td></tr><tr><td>ProLong Gold reagente antifade</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>para preservar fluoróforos&nbsp;</td></tr><tr><td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td>para preservar fluoróforos&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de Elastômero de Silicone SylGard 182</td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>Código do produto: 0001023934</td><td>para placas de dissecação</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LSM780 microscópio confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila dissecção</td></tr><tr><td>Iluminador de Microscópio de Fibra Óptica Dupla Gooseneck AmScope, 150&nbsp; W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316</td><td>Fonte de luz</td></tr></tbody></table>

in vivo biosensor tracks apoptótica não-caspase atividade em drosophila

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

As caspases são os principais mediadores da morte celular apoptótica por meio de sua atividade proteolítica. Quando as caspases são ativadas nas células a níveis detectáveis pelas tecnologias disponíveis, geralmente se supõe que a apoptose ocorra logo em seguida. As caspases podem clivar muitos componentes funcionais e estruturais para causar destruição celular rápida e completa em poucos minutos. No entanto, evidências acumuladas indicam que em células saudáveis normais as mesmas caspases têm outras funções, presumivelmente em níveis enzimáticos mais baixos. Estudos de atividade de caspase não apoptótica foram dificultados por dificuldades em detectar baixos níveis de atividade de caspase e em rastrear o destino celular final in vivo. Aqui, ilustramos o uso de um repórter de caspase ultrassensível, CaspaseTracker, que rotula permanentemente células que sofreram atividade de caspase em animais inteiros. Este biossensor CaspaseTracker de duas cores in vivo para Drosophila melanogaster expressa transitoriamente a proteína fluorescente vermelha (RFP) para indicar a atividade recente ou contínua da caspase e expressa permanentemente a proteína fluorescente verde (GFP) em células que experimentaram atividade de caspase a qualquer momento no passado, mas não morreram. É importante ressaltar que este biossensor in vivo dependente de caspase revela prontamente a presença de atividade de caspase não apoptótica nos tecidos dos sistemas de órgãos em toda a mosca adulta. Isso é demonstrado usando dissecações de montagem inteira de moscas individuais para detectar a atividade do biossensor em células saudáveis em todo o cérebro, intestino, túbulos de Malpighi, cárdia, ductos ovarianos e outros tecidos. O CaspaseTracker detecta a atividade da caspase não apoptótica em células de vida longa, pois a atividade do biossensor é detectada em neurônios adultos e em outros tecidos pelo menos 10 dias após a ativação da caspase. Este biossensor serve como uma ferramenta importante para descobrir os papéis e mecanismos moleculares da atividade da caspase não apoptótica em animais vivos.

Existem dois componentes principais que permitem CaspaseTracker para detectar a actividade da caspase em células saudáveis normais (Figura 1A). O primeiro deles é um polipéptido de caspase-clivável 146 aminoácidos modelada após a caspase biossensor Apoliner (Figura 1b) 28 Este polipéptido é derivado de DIAP1 (inibidor de Drosophila de apoptose), contendo um único local de caspase de ocorrência natural que é clivado durante a apoptose ...

Para detectar células saudáveis em animais inteiros que contêm baixos níveis de actividade de caspase, o biossensor altamente sensível designado CaspaseTracker foi gerado para Drosophila. biossensor actividade dependente de caspase é detectado em células saudáveis ​​de vida longa ao longo dos órgãos internos dos animais adultos criados em condições optimizadas na ausência de estímulos de morte.

In Vivo Biosensor Tracks apoptótica não-Caspase Atividade em Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

O objetivo geral deste experimento é detectar e acompanhar a atividade de caspases não apoptóticas em animais vivos, utilizando Drosophila melanogaster como modelo. As caspases são proteases que clivam diversos componentes celulares, levando à morte celular apoptótica. Assim, a presença de caspases ativas nas células é frequentemente interpretada como um sinal de morte celular iminente.No entanto, evidências crescentes indicam que as mesmas caspases que causam a morte celular também têm funções normais em células saudáveis. E essas funções cotidianas das caspases incluem a regulação da atividade neuronal, funções mitocondriais e até a supressão de vias alternativas de morte celular. Existem duas grandes dificuldades no estudo das funções cotidianas das caspases.Primeiro, os níveis basais normais de atividade de caspase geralmente estão abaixo dos limites de detecção das tecnologias disponíveis. E segundo, mesmo quando a atividade basal de caspase é detectável, é difícil distingui-la da atividade de caspase que levará à morte celular em um futuro próximo. Para resolver esse problema, desenvolvemos um rastreador de caspase: um biossensor de caspase mais sensível que pode marcar permanentemente células que sobreviveram à ativação de caspase.Este biossensor permitirá detectar e rastrear células com atividades de caspase não apoptóticas e estudar suas funções em animais vivos. O sistema de biossensor rastreador de caspase in vivo em drosófila consiste em dois componentes: o transcritor de levedura Gal4 ativável por caspase e o repórter fluorescente ativado por Gal4 conhecido como G-Trace.As moscas biossensoras de caspase são cruzadas com moscas G-Trace para gerar moscas CaspaseTracker que relatam a atividade da caspase por meio de fluorescência vermelha e verde. A atividade da caspase é detectada nas moscas descendentes quando o biossensor é clivado pelas caspases ativas na sequência DQVD, liberando Gal4 da membrana plasmática. O Gal4 liberado transloca-se para o núcleo e induz a expressão da proteína fluorescente vermelha, RFP, até que as caspases se tornem inativas.No entanto, a Gal4 também induz a expressão da recombinase FLP, levando à expressão contínua de GFP direcionada ao núcleo durante toda a vida da célula. Um biossensor controle possui uma mutação, DQVA, no sítio de clivagem da caspase. Para começar, cruze moscas transgênicas portadoras do biossensor Gal4 sensível à caspase com moscas portadoras do repórter fluorescente G-Trace.Acasale sete a 10 fêmeas virgens do biossensor com sete a 10 machos recém-emergidos de G-Trace em um tubo com alimento fresco. Um controle negativo importante é a versão insensível à caspase deste biossensor, que possui uma mutação pontual única no resíduo de aspartato necessário para clivagem pela caspase. Utilize o mesmo procedimento de acasalamento para estas moscas-controle.Após montar os cruzamentos, mantenha os frascos a 18 graus Celsius. Quando as larvas estiverem se desenvolvendo e antes que novas progênies de moscas emergem, transfira as moscas parentais para novos frascos para continuar produzindo nova prole. Quando as moscas descendentes emergirem, colete aquelas com asas lisas, não-curvadas.Esse fenótipo indica que essas moscas carregam transgenes para o biossensor de caspase e para o repórter fluorescente G-Trace. Em seguida, seguindo protocolos estabelecidos, dissecar as moscas para isolar tecidos moles internos intactos de moscas com rastreador de caspase e controles. Para começar, preparar ponteiras de pipeta e tubos de centrífuga que não aderem aos tecidos dissecados.Para fazer isso, recubra as pontas e os tubos com albúmina sérica bovina a um por cento dissolvida em água. Para fixar os tecidos dissecados, carregue os tubos transparentes recobertos com ponto cinco mililitros de paraformaldeído fresco a quatro por cento em PBS e transfira os tecidos recém-dissecados para esses tubos. Em seguida, coloque os tecidos em temperatura ambiente, no escuro, para evitar fotodesvanecimento, e incube por 20 a 30 minutos com rotação suave para banhar os tecidos com o fixador, ao mesmo tempo que evita danos aos tecidos.Fixações mais longas podem levar a uma coloração subótima dos tecidos. Para remover o paraformaldeído e iniciar a permeabilização da membrana dos tecidos fixados, remova cuidadosamente a solução de paraformaldeído com uma ponteira revestida e lave os tecidos três vezes com 0,5 mL de PBST. Para completar a permeabilização dos tecidos e bloquear a ligação não específica nos procedimentos subsequentes de coloração, incube os tecidos em 0,5 mL de PBST contendo 1% de BSA a 4 °C durante a noite, no escuro, com rotação suave.No dia seguinte, remova a solução de PBST com BSA lavando os tecidos permeabilizados três vezes com 0,5 mL de PBST. Para ajudar a visualizar diferentes estruturas teciduais, realize uma coloração simultânea do DNA nuclear e da F-actina citoplasmática incubando os tecidos preparados em 0,5 mL de PBST contendo o corante nuclear azul Hoechst 33342 e a fasmodulina marcada com Alexofluor 633 para F-actina durante uma hora à temperatura ambiente com rotação suave. Remova o excesso de corante lavando os tecidos três vezes com 0,3 mL de PBST.Incubar cada lavagem durante cinco minutos à temperatura ambiente com rotação suave. Remover cuidadosamente todo o líquido dos tecidos no tubo utilizando uma ponteira fina. Para preservar o sinal fluorescente durante a aquisição de imagens, adicionar 200 microlitros de agente de montagem anti-desbotamento cobrindo completamente os tecidos.Incube os tecidos por uma a três horas à temperatura ambiente ou a quatro graus Celsius durante a noite. Idealmente, os tecidos que absorveram completamente o meio de montagem afundarão até o fundo do tubo. Antes de montar os tecidos, limpe a lâmina de vidro com água ou etanol 70%.Aplicar vaselina no lâmina de vidro e na lamínula para evitar a destruição dos tecidos por supercompressão. Em seguida, transferir os tecidos com o meio de montagem para a lâmina de vidro. Remover qualquer meio de montagem em excesso utilizando papel-toalha.Por fim, selar a lamínula aplicando esmalte ao longo de todas as bordas. Para começar, coloque a lâmina sobre a platina de um microscópio invertido. E capture imagens das células utilizando uma objetiva Plan-Apocromática de 20x com uma abertura de ponto oito.Tire algumas imagens de teste em baixa resolução para verificar um plano de mosaico de imagem que cubra a região de interesse, que neste caso é o sistema de órgãos internos completo da mosca. Configure a sequência de imagens começando com o comprimento de onda de excitação mais longo e terminando com o comprimento de onda de excitação mais curto. Isso minimizará o fotodesvanecimento, que aumenta em comprimentos de onda mais curtos.Em seguida, adquira imagens com uma resolução adequadamente alta. Cada imagem deve ter uma sobreposição de 10% com a próxima para um mosaico bem-sucedido. Colete de duas a oito varreduras de imagem por mosaico para reduzir o ruído de fundo.Para eliminar a sombra entre os ladrilhos de imagem do contraste de interferência diferencial, DIC, tire uma imagem DIC de referência na região vazia. Em seguida, realize a correção de sombra na imagem ladrilhada usando a imagem DIC de referência. Esta é uma mosca dissecada recém-emergida com rastreador de caspase, contendo apêndices bucais, foregut, crop, midgut, hindgut, ânus, oviduto e ovários.Por microscopia confocal, a atividade da caspase é visualizada como fluorescência de RFP, que indica atividade recente da caspase, e por fluorescência de GFP, que indica atividade passada da caspase. Imagens ampliadas revelam atividade do biossensor RFP e GFP no lobo óptico, cárdia, intestino médio, intestino posterior e oviduto. Células específicas ao longo dos túbulos de Malpighian exibem proeminentemente tanto RFP quanto GFP, indicando atividade persistente da caspase.Em contraste, nenhuma atividade do biossensor RFP ou GFP foi expressa nos câmaras oocíticas, embora o biossensor tenha sido expresso em células musculares entre os câmaras oocíticas com base na coloração simultânea com a marcação de F-actina. No entanto, as células dos câmaras oocíticos são capazes de ativar caspases se as moscas forem tratadas com um estímulo de morte celular, como inanição ou choque térmico, o que provoca a destruição nuclear e ativação maciça de caspases com base na imunomarcação. O rastreador de caspase provavelmente aparece precocemente e é posteriormente destruído durante a morte celular.No lobo óptico do cérebro saudável de moscas com rastreamento de caspase, a atividade do biossensor é detectada em células saudáveis que parecem ser neurônios, com base na marcação conjunta com um anticorpo anti-ELAVI, marcador pan-neuronal. Isso sugere um papel para a atividade de caspase não apoptótica em neurônios. Outras estratégias podem ser utilizadas para demonstrar a sobrevivência a longo prazo de células com atividade de caspase, como desativar a expressão do biossensor usando ferramentas genéticas.Por exemplo, GalADTS que inibe Gal4. O rastreador de caspase relata especificamente a atividade da caspase, enquanto o biossensor controle não clivável, DQVA, não é ativado. O único sinal observado nos controles é devido à autofluorescência do cutículo remanescente nas peças bucais e no ânus, e do alimento ingerido, levedura, na moela e no intestino anterior.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar o biossensor de rastreamento de caspase para acompanhar a atividade de caspase não apoptótica em moscas-das-frutas. Ao tentar este procedimento, é importante incluir controles negativos para distinguir os sinais do biossensor de caspase da autofluorescência. Por exemplo, o cutículo e os corpos gordurosos produzem autofluorescência intensa em moscas com ou sem o biossensor.A versão atual do biossensor rastreador de caspase foi projetada para detectar a caspase ativa DRICE. Outras aplicações podem incluir biossensores específicos para diferentes caspases, substituindo o sítio de clivagem reconhecido pela DRICE pelo sítio de clivagem reconhecido por outras caspases.

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Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

A epiderme embrionárias de fase muito tardia embriões de Drosophila fornece um sistema in vivo para análise da resposta punção ferida rápido e pode ser combinado com manipulações genéticas ou tratamentos químicos microinjeção para avançar os estudos na cicatrização de feridas para a tradução em modelos de mamíferos.

Microinjeção Ferida Ensaio e<em&gt; In vivo</em&gt; Localização de Epidermal Wound resposta Jornalistas em<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões.

Certas perturbações genéticas ou exposição a toxinas podem interromper os processos normais de desenvolvimento, levando à morte de tipos específicos de células. A análise da Caspase 3 ativada por imunofluorescência total em embriões de peixe-zebra revela a localização específica do estágio e do tecido de células especificamente submetidas à apoptose.

Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

O termo anastase refere-se ao fenômeno no qual as células moribundas revertem um processo de suicídio celular em um estágio tardio, se reparam e, finalmente, sobrevivem. Aqui demonstramos protocolos para detectar e rastrear células que passam por anástase.

Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

Anastasis é tecnicamente desafiador para detectar na vivo porque as células que reverteram o processo de morte celular podem ser morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais. Aqui descrevemos os protocolos para detecção e monitoramento de células que passam por anastasis em animais vivos, usando nosso sistema de biosensor recentemente desenvolvido na vivo CaspaseTracker.

Detecção de Anastasis na Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando as células embrionárias dispersas de Drosophila . Ele nos permite quantificar de forma fácil e precisa os níveis de fagocitose in vivo e identificar novas moléculas necessárias para a fagocitose das células apoptóticas.

Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em Drosophila Embriões

Aqui ilustramos como microscopia de foto-ativado localização única molécula pode ser realizada no terminal nervoso motor de um vivo Drosophila melanogaster terceiro estádio de larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

Este protocolo descreve caspase Bimolecular complementação de fluorescência (BiFC); um método baseado em imagens que pode ser usado para visualizar induzida proximidade das caspases de iniciador, que é o primeiro passo para sua ativação.

Iluminando os caminhos para a ativação de Caspase usando fluorescência Bimolecular complementação

Aqui nós apresentamos um protocolo para a reparação de ferida de geração de imagens ao vivo e a resposta inflamatória associada à alta resolução espaço-temporal na vivo. Este método utiliza o estágio de pupa de Drosophila desenvolvimento para habilitar a longo prazo de imagem e rastreamento de populações de células específicas ao longo do tempo e é compatível com a inativação de genes mediada por RNAi eficiente.

A longo prazo no Vivo controle da dinâmica celular inflamatória dentro drosófila pupas

Aqui apresentamos um protocolo para expressar e purificar Drosophila caspases recombinantes Dronc e Drice, e seu uso em ensaios de clivagem in vitro .

In vitro Ensaios de Clivagem usando Caspases de Drosophila Recombinante Purificada para Triagem de Substrato

Aprenda a rastrear atividade não-apoptótica de caspases em Drosophila melanogaster usando o biosensor CaspaseTracker. Este método permite detectar caspases ativas em células saudáveis, revelando funções celulares além da morte celular.

In Vivo Biosensor Tracks apoptótica não-Caspase Atividade em Drosophila

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