Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar uma aplicação simples da detecção de fluorescência microfluídica de gotículas usando fibras ópticas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na triagem biológica de alto rendimento, como a identificação de fenótipos raros e a evolução direcionada de enzimas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite uma aplicação simples e barata de detecção de fluorescência em microfluídica de gotículas.

Para começar, coloque um wafer de silício pré-limpo de três polegadas de diâmetro no mandril a vácuo de um revestidor giratório. Em seguida, aplique um mililitro de SU-8 3050 no centro do wafer e gire o wafer para fornecer uma camada de fotorresistente com 80 micrômetros de espessura. Remova o wafer revestido do revestidor e coloque-o em uma placa de aquecimento pré-aquecida a 135 graus Celsius.

Após 30 minutos, remova o wafer e deixe-o esfriar novamente até a temperatura ambiente. Em seguida, coloque o wafer em uma superfície plana e alinhe a máscara da primeira camada no wafer. Exponha o wafer sob um LED colimado de 190 miliwatts e 365 nanômetros por três minutos.

Após a exposição, coloque o wafer em uma placa de aquecimento a 135 graus Celsius por um minuto e deixe-o esfriar novamente até a temperatura ambiente. Depois de esfriar, coloque o wafer de volta no revestidor giratório e fixe-o no mandril. Aplique um mililitro adicional de SU-8 3050 no centro do wafer e gire por 20 segundos a 500 rpm.

seguido por 30 segundos a 5.000 rpm. Em seguida, asse o wafer em uma placa de aquecimento. Deixe esfriar até a temperatura ambiente e, em seguida, coloque-o de volta na superfície de alinhamento da máscara.

Use o escopo de dissecação para alinhar manualmente a máscara de segunda camada com as marcas de alinhamento padronizadas no wafer. Uma vez devidamente alinhado, exponha o wafer revestido por 4-1 / 2 minutos usando as mesmas condições de antes. Após a exposição, coloque o wafer em uma placa de aquecimento a 135 graus Celsius por um minuto, depois resfrie o wafer e fixe-o de volta no revestidor giratório.

Aplique um mililitro de SU-8 3050 ao wafer pela terceira vez e gire para adicionar mais 100 micrômetros de fotorresistente. Retire o wafer e leve ao forno em uma placa de aquecimento a 135 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, resfrie-o à temperatura ambiente e coloque-o na superfície de alinhamento.

Alinhe a máscara da terceira camada com a geometria anterior e exponha o wafer revestido usando as condições anteriores por nove minutos. Após a exposição, coloque o wafer em uma placa de aquecimento de 135 graus Celsius por um minuto e depois resfrie-o até a temperatura ambiente. Depois de esfriar, revele as máscaras mergulhando o wafer em um banho agitado de revelador por 30 minutos.

Por fim, lave o wafer em isopropanol e leve ao forno uma última vez por um minuto em uma placa de aquecimento a 135 graus Celsius. Armazene o mestre revelado em uma placa de Petri de 100 milímetros até a moldagem. Prepare uma mistura 10:1 de PDMS combinando 50 gramas de base de silício com cinco gramas de agente de cura em um copo plástico.

Misture o conteúdo com uma ferramenta rotativa e, em seguida, desgaseifique a mistura dentro do dessecador por 30 minutos ou até que todas as bolhas de ar sejam removidas. Despeje o PDMS desgaseificado sobre o mestre preparado para obter uma espessura de três milímetros. Em seguida, coloque a placa de Petri de volta no dessecador para posterior desgaseificação.

Depois que todas as bolhas forem removidas, asse o dispositivo a 80 graus Celsius por 80 minutos. Depois de resfriado, corte o dispositivo do molde usando um bisturi para que as telegeometrias de 120 micrômetros e 220 micrômetros sejam acessíveis pela lateral do dispositivo. Em seguida, perfure as entradas e saídas fluídicas com um punção de biópsia de 0,75 mm.

Trate o dispositivo com o lado do recurso para cima, juntamente com uma lâmina de vidro pré-limpa e plasma de oxigênio de 1 milibar por 20 segundos em um limpador de plasma de 300 watts. Cole o dispositivo colocando firmemente o lado padronizado do dispositivo PDMS no lado tratado com plasma da lâmina de vidro. Em seguida, coloque o dispositivo em um forno de dispositivo de 80 graus Celsius e volte o dispositivo montado por 40 minutos.

Depois de cozido, use uma seringa para lavar o dispositivo com um fluido de tratamento de superfície fluorado para tornar os canais hidrofóbicos. Em seguida, asse imediatamente o dispositivo a 80 graus Celsius por 10 minutos para evaporar o solvente. Prepare duas fibras de excitação a laser removendo o isolamento dos últimos cinco milímetros das fibras ópticas.

Além disso, prepare a fibra para coletar o sinal fluorescente removendo o isolamento dos últimos cinco milímetros de uma fibra óptica maior. Inspecione as pontas de todas as fibras ao microscópio. Se as pontas não terminarem em uma superfície plana, prenda as extremidades com um escriba de fibra.

Em seguida, conecte um acoplador de fibra de laser a um laser de 50 miliwatts e 405 nanômetros e conecte uma das fibras do núcleo de 105 micrômetros ao laser. Direcione a extremidade descascada do sensor de um medidor de potência do laser e use os ajustes finos do acoplador do laser para maximizar a potência do laser. Execute o mesmo processo para ajustar a outra fibra usando um laser de 50 miliwatts e 473 nanômetros.

Em seguida, monte um filtro passa-banda quádruplo no tubo fotomultiplicador usando tubos de lente para bloquear a luz do laser e transmitir a fluorescência emitida. Conecte um acoplador de fibra para que a luz viaje pelos filtros antes de atingir o tubo fotomultiplicador. Em seguida, conecte a fibra coletora ao acoplador de fibra.

Coloque o chip microfluídico fabricado no palco de um microscópio invertido acoplado a uma câmera digital capaz de velocidades do obturador de pelo menos 100 microssegundos. Trabalhando cuidadosamente pelos lados, insira a fibra acoplada ao laser de 473 nanômetros no canal de 120 micrômetros mais distante a montante. Tome cuidado para não perfurar o canal de fluxo principal.

Em seguida, insira a fibra acoplada ao laser de 405 nanômetros no canal lateral de 120 micrômetros de altura mais distante a jusante, fornecendo espaçamento de fibra de 300 micrômetros. Por fim, insira a fibra acoplada ao tubo fotomultiplicador maior no canal de 220 micrômetros de altura normal às duas fibras de excitação do laser. Encha uma seringa de cinco mililitros cheia de HFE 7500 contendo fluorosurfactante 2% iônico e monte-a na entrada de óleo espaçador do dispositivo de detecção usando tubo PE2.

Em seguida, encha uma seringa com uma emulsão mista de FITC e corante azul e monte-a em uma bomba de seringa orientada verticalmente acoplada ao dispositivo como entrada de reinjeção de gotículas usando tubo PE2. Conecte um pedaço de tubo PE da saída do dispositivo a um recipiente de resíduos. Em seguida, prepare o dispositivo operando cada uma das bombas a 1.000 microlitros por hora até que o óleo e as gotículas se combinem regularmente no dispositivo e fluam rio abaixo.

Ajuste as taxas de fluxo de modo que o óleo espaçador funcione a 6.000 microlitros por hora e as gotículas a 100 microlitros por hora, proporcionando um espaçamento significativo entre as gotículas que viajam pela região de detecção. Em seguida, ligue os lasers e inicie o programa de aquisição de dados. Em seguida, ajuste o ganho do tubo do multiplicador de fotos para fornecer sinais que são mais de 100 vezes o nível de ruído da linha de base.

Finalmente, ajuste a potência do laser para que todos os picos duplos sejam claramente visíveis em um único traço de tempo em escala linear. Uma gotícula que flui através do canal de detecção encontra regiões de excitação discretas na frente de cada uma das fibras ópticas acopladas ao laser. A fibra de detecção registra a fluorescência emitida com um deslocamento temporal com uma separação de pico que se correlaciona com o tempo que uma gota leva para se mover de uma região de excitação para outra.

Isso elimina a necessidade de mais filtragem de luz e tubos multiplicadores de fotos separados. A eficácia do esquema de detecção foi testada pela detecção de uma emulsão mista de gotículas contendo corantes que excitam a 405 nanômetros e a 473 nanômetros. Este gráfico mostra uma separação clara entre os quatro tipos de gotículas reinjetadas quando fluídas a aproximadamente 50 hertz.

A faixa dinâmica e a sensibilidade absoluta do detector foram investigadas medindo as gotículas apenas de fluoresceína. Os dados mostram a capacidade do sistema de detectar concentrações de corantes que variam de 0,1 a 100 nanomolares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como implementar um sistema de detecção de fluorescência simples e compacto, utilizando uma variedade de fibras ópticas inseridas e um único detector de fotos.