Name: Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprenda detecção de fluorescência multicolorida em microfluídica de gotas utilizando fibras ópticas. Este método simplificado e econômico permite triagem biológica de alto rendimento e identificação de fenótipos raros em pesquisa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pela concessão DARPA número 84389.01.44908, um prêmio NSF CAREER (DBI-1253293), uma bolsa de pesquisa exploratória/de desenvolvimento do NIH (CA195709) e NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01) e uma bolsa New Directions do programa de alocação de recursos da UCSF.

1. SU8 Fabricação Mestre <ol><li> Projetar as estruturas microfluídicos para fabricação de três camadas usando software de design e têm os desenhos impressos por um fornecedor em filme placa de circuito com resolução de 10 m. Os detalhes da concepção do dispositivo são dadas em uma referência em anexo 6 e as geometrias de canal são mostradas na Figura 1. As camadas deverá incluir marcas de alinhamento para ajudar a colocar características de cada camada de fabricação 8. </li><li> Coloque um wafer de silício diâmetro pré-limpeza de 3 polegadas em um revestidor de rotação e ligar o vácuo para apor-lo para o mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 no centro da bolacha e centrifugação durante 20 segundos a 500 rpm, em seguida 30 segundos a 1750 rpm, proporcionando uma espessura de camada de 80 um. </li><li> Remover a bolacha e assar em uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 30 min. Permitir que o wafer arrefecer à RT antes de passar para a próxima etapa. </li><li> Expor o wafer revestido para o st máscara 1 camada sob a colimado 190 mW, LED 365 nm durante 3 minutos. Após a exposição, colocar a pastilha em uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 1 min, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de prosseguir para o passo seguinte. </li><li> Coloque o wafer sobre o coater rotação e ligar o vácuo para apor-lo para o mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 no centro da bolacha e centrifugação durante 20 segundos a 500 rpm, em seguida 30 segundos a 5000 rpm, o que resulta em uma camada que proporciona uma espessura adicional de 40 uM. </li><li> Remover a bolacha e coza numa placa de aquecimento 135 ° C durante 30 min, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de passar para a próxima etapa. </li><li> Alinhar a camada de máscara 2 nd para a geometria modelada em 1.3 e expor a pastilha revestida a uma colimado 190 mW, a 365 nm LED durante 3 min. Após a exposição, colocar sobre uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 4 min 30 s, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de prosseguir para o passo seguinte. </li><li> Coloque o wafer sobre o coater rotação e ligar o vácuo para apor-lo para o mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 no centro da bolacha e centrifugação durante 20 segundos a 500 rpm, em seguida, 30segundos a 1000 rpm, o que resulta em uma camada que proporciona uma espessura adicional de 100 um. </li><li> Remover a bolacha e coza numa placa de aquecimento 135 ° C durante 30 min, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de passar para a próxima etapa. </li><li> Alinhar a camada de máscara 3 rd na geometria modelada em 1.3 e expor a pastilha revestida a uma colimado 190 mW, a 365 nm LED durante 3 min. Após a exposição, colocar sobre uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 9 minutos, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de prosseguir para o passo seguinte. </li><li> Desenvolver as máscaras por imersão num banho em agitação de acetato de éter propilenoglicol monometílico, durante 30 min. Lava-se a bolacha em isopropanol e coza numa placa de aquecimento 135 ° C durante 1 min. Coloque o mestre desenvolvido em uma placa de Petri de 100 mm para polidimetilsiloxano moldagem (PDMS). </li></ol> 2. PDMS fabricação de dispositivos <ol><li> Preparar 10: 1 PDMS pela combinação de 50 g de base de silicone com 5 g de agente de cura em um copo de plástico. Misture o conteúdo com uma ferramenta rotativa equipada com uma vareta. degmedida que a mistura no interior de um exsicador durante 30 minutos, ou até que todas as bolhas de ar são removidas. </li><li> Despeje o PDMS para dar uma espessura de 3 mm sobre o mestre e coloque de volta para o secador durante mais de desgaseificação. Uma vez que todas as bolhas são removidas, o dispositivo de cozer a 80 ° C durante 80 min. </li><li> Cortar o dispositivo a partir do molde utilizando um bisturi e coloque sobre uma superfície limpa com o lado estampado para cima e perfurar as entradas e saídas fluídicos com um soco biópsia 0,75 mm. O dispositivo tem de ser cortado de modo a que os 120 uM e 220 uM geometrias altos são acessíveis a partir do lado do dispositivo. </li><li> Plasma tratar o dispositivo, com o lado recurso acima, juntamente com um pré-limpas 2 polegadas por 3 polegadas lâmina de vidro a 1 mbar O 2 plasma durante 20 segundos em um aspirador de plasma 300 W. Unir o dispositivo de PDMS, colocando o lado modelado do dispositivo PDMS para o lado tratado com plasma da lâmina de vidro. Colocar o dispositivo num forno de 80 ° C e assar o dispositivo montado, durante 40 min. </li><li> Tornar os canaishidrofóbica usando uma seringa para irrigar o dispositivo com um fluido de tratamento de superfície fluorado. Imediatamente cozer o dispositivo a 80 ° C durante 10 minutos para evaporar o solvente. </li></ol> 3. Preparação de componentes ópticos <ol><li> Prepara-se o laser de fibra de excitação através da remoção do isolamento a partir da última 5mm de um núcleo 105 uM, 125 uM de revestimento, NA = 0,22 fibra óptica. </li><li> Prepare a fibra de excitação laser a cores 2 nd repetindo 3.1 para uma fibra idêntica 2º. </li><li> Preparar a fibra de recolha do sinal de fluorescência pela repetição 3,1 para um núcleo de 200 um, 225 uM de revestimento, NA = 0,39 fibra óptica. </li><li> Inspecione as pontas de todas as fibras - se as dicas não terminam em uma superfície plana, re-unir as extremidades com um escriba fibra. </li><li> Anexar um acoplador de fibra de laser a um 50 mW, 405 nm do laser e anexar um dos 105 mm fibras do núcleo para o laser. Direcionar a extremidade descarnada para o sensor da potência do lasermetro, e usar os ajustes finos do acoplador laser para maximizar a potência do laser. </li><li> Repetir para 3,5 nm de um laser de 50 mW, 473. </li><li> Montar uma 446/510/581/703 filtros de banda quad nm na PMT utilizando tubos de lente para bloquear a luz do laser e transmitir fluorescência emitida. Ajustar o engate de fibra de modo que a luz viaja através dos filtros antes de bater a PMT. </li><li> Anexar a fibra de 3,3 a unidade montada em 3.7. </li></ol> 4. offline Mixed Geração Emulsion <ol><li> Obter um dispositivo de microfluidos dropmaker foco de fluxo com um orifício de 60 x 60 mm uM. </li><li> Encha uma seringa de 1 ml com HFE 7500 óleos com 2% fluorado iônica 9. </li><li> Encha uma série de seringas de 1 ml com as seguintes combinações de fluoresceína (FITC) e corantes azul de dextrano conjugado (CB) em PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM de FITC / 10 nM CB, 1 nM de FITC / 100 nM CB, e 10 nM com FITC / 100 nM CB. </li><li> Montar o dispositivo dropmaker no palco de um micros invertidaslidar e as seringas aquosos e óleo sobre bombas de seringa. Casal das seringas para os dispositivos que utilizam tubos PE-2. </li><li> Executando bombas de seringa a 500 mL / h para o óleo e 250 ul / h durante as soluções aquosas, criar uma mistura de 80 uM gotículas contendo as soluções de 4,3. Para cada tipo de amostra aquosa, utilizar um dispositivo dropmaker fresco para eliminar a contaminação cruzada. Recolhe ~ 200 ul de emulsão a partir de cada combinação de corante para uma seringa vazia. </li><li> Após os 4 tipos gotas foram coletadas em uma única seringa coleção, misturar a emulsão girando repetidamente a seringa. </li><li> Repita os passos 4,2-4,6 com soluções aquosas contendo 0,1, 1, 10, e 100 nM com FITC em PBS. </li></ol> 5. Optical Fiber Inserção <ol><li> Coloque o chip microfluídico fabricados no passo 2 no palco de um microscópio invertido acoplado com uma câmera digital capaz de &lt;100 ms velocidades do obturador. </li><li> Trabalhando com cuidado de lado, inseta a fibra acoplado ao laser de 473 nm no montante de 120 canais mais distante mm, tomando cuidado para não perfurar até o canal de fluxo principal. </li><li> Inserir a fibra acoplado ao laser de 405 nm no canal 120 uM alta lado mais distante a jusante, fornecendo o espaçamento da fibra de 300 mm. </li><li> Inserir a fibra PMT-associado no canal 220 uM de altura normal, para as duas fibras de excitação de laser. </li></ol> 6. detecção de fluorescência de emulsões mistas <ol><li> Montar uma seringa de 5 ml cheio com HFE 7500 com 2% de surfactante fluorado iónica à entrada de óleo espaçador do dispositivo de detecção com tubagem PE-2. </li><li> Monte a seringa contendo a emulsão / CB mista FITC em uma bomba de seringa orientado verticalmente e casal a entrada de gota reinjeção do dispositivo utilizando tubagem PE-2. Conectar um comprimento de tubagem PE-2 a partir da saída do dispositivo a um recipiente de resíduos. </li><li> Primeiro o dispositivo rodando cada uma das bombas em 1000 uL / ​​hr até tantoóleo e as gotas são vistos para ser combinando regularmente no dispositivo e de fluxo a jusante. </li><li> Ajustar as taxas de fluxo de modo que o óleo espaçador funciona a 6.000 l / h e as gotas a 100 l / h, proporcionando espaçamento significativa entre gotículas viajam através da região de detecção. </li><li> Ligue os lasers, iniciar o programa de aquisição de dados e ajustar o ganho de PMT para fornecer sinais que são mais de 100 vezes o ruído da linha de base. Ajustar a potência do laser de modo a que todos os picos doublet são claramente visíveis em um único timetrace, linearmente dimensionado. </li><li> Adquirir 60 seg do timetrace tensão PMT em pelo menos 20 kHz. Importe os dados em programa de computação, tais como Matlab e medir as alturas dos picos das dobletes gravados a partir do roteiro de programa de computação personalizado. NOTA: Este é fornecido como informação suplementar. </li><li> Repita os passos de 6,2-6,7 usando o FITC-only emulsão mista criada em 4.7, com o laser de 405 nm desligado. </li></ol>

<ol><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li>
<li>Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).</li>
<li>Hindson, B. J., Ness, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).</li>
<li>Agresti, J. J., Antipov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004(2010).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoinjection+Enables+Digital+Detection+of+RNA+with+Droplet+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR.</a> PLOS ONE. 8 (4), (2013).</li>
<li>Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+and+modular+multicolour+fluorescence+detector+for+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).</li>
<li>Guo, F., Lapsley, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+droplet-based%2C+optofluidic+device+for+high-throughput%2C+quantitative+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis.</a> Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).</li>
<li>Lithography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html">https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html</a> (2015).</li>
<li>DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Biocompatible+Oil-Water+Interfaces+without+Synthesis%3A+Direct+Interactions+between+Primary+Amines+and+Carboxylated+Perfluorocarbon+Surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants.</a> Anal Chem. 85 (21), (2013).</li>
<li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab Chip. 12, 882(2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-Throughput+Mammalian+Single-Cell+Reverse-Transcriptase+Polymerase+Chain+Reaction+in+Microfluidic+Drops%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops.</a> Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).</li>
<li>Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+encoded+multicolor+fluorescence+detection+in+a+microfluidic+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer.</a> Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).</li>
<li>Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fabrication+of+a+microfluidic+device+with+integrated+optical+waveguides+for+DNA+fragment+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis.</a> Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).</li>
<li>Martinez Vazquez, R., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensing+in+microfluidic+lab-on-a-chip+by+femtosecond-laser-written+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides.</a> Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).</li>
<li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

detecção de fibra óptica requer o alinhamento das fibras ópticas com respeito a canais de fluido. Uma vez que o nosso dispositivo utiliza canais de guia fabricadas com fotolitografia multicamada, a colocação de máscaras com relação um ao outro é de grande importância. Se os canais de guia de fibra são demasiado perto do canal de fluido, existe um potencial para a fuga de fluido; Se os canais de guia estão localizados muito longe ou desalinhado, o sinal de fluorescência recolhida pela fibra de detecção pode ser significa...

Microfluídica gotículas fornecer uma plataforma em alta biologia rendimento por compartimentar experimentos em um grande número de gotículas aquosas suspensas em uma transportadora de petróleo 1. Gotas têm sido utilizados para aplicações tão variadas como a análise de células individuais 2, reacção em cadeia da polimerase digitais (PCR), 3, e 4 evolução da enzima. ensaios fluorescentes são o modo padrão de detecção para microfluídica gota, como os seus sinais luminosos e tempo de resposta rápido são compatíveis com a detecção de volumes de gotículas sub-nanolitros a taxas kilohertz. Muitas aplicações exigem a detecção de fluorescência de pelo menos duas cores em simultâneo. Por exemplo, o nosso laboratório vulgarmente PCR realiza-activada de gotículas triagem experiências que utilizam um canal de detecção para o resultado de um ensaio, e utiliza um corante de fundo secundário para fazer gota-ensaio negativo contáveis ​​5. estações de detecção típicos para microfluídica gotículas são based em microscópios de epifluorescência, e exigem complicados esquemas de manipulações de luz para introduzir luz de excitação de lasers de espaço livre no microscópio a ser focada na amostra. Depois de fluorescência é emitida a partir de uma gotícula, a luz de fluorescência emitida é filtrada de modo a que cada canal de detecção utiliza um tubo fotomultiplicador (PMT) centrada sobre uma banda de comprimento de onda. sistemas de detecção óptica de epifluorescência baseado em microscópio fornecer uma barreira à entrada devido à sua custa, a complexidade ea manutenção necessária. As fibras ópticas dispõem de meios para construir um esquema de detecção simplificada e robusto, uma vez que as fibras podem ser inseridas manualmente em dispositivos de microfluidos, eliminando a necessidade de encaminhamento de luz à base de espelho, e permitindo caminhos de luz para ser interligado através de conectores de fibra óptica. Neste trabalho, nós descrevemos a montagem e validação de um sistema compacto e modular para realizar detecção de fluorescência multicolor, utilizando uma rede de fibras ópticas de umda fotodetector única 6. As fibras ópticas são acoplados aos lasers individuais e são inseridos normal a um canal de escoamento em forma de L em deslocamentos espaciais regulares. Uma fibra de recolha de fluorescência é orientada paralelamente às regiões de excitação e é ligado a um único PMT. Uma vez que uma gotícula passa através dos feixes de laser em momentos diferentes, os dados registados pelo PMT mostra um deslocamento temporal, que permite ao utilizador fazer a distinção entre a fluorescência emitida após a gotícula é excitada por cada feixe de laser distinta. Este deslocamento temporal, elimina a necessidade de separar a luz emitida PMTs separadas utilizando uma série de espelhos dicróicos e filtros passa-banda. Para validar a eficácia do detector, que quantificar fluorescência em populações de gotículas de encapsulação de corantes de cor diferente e concentração. A sensibilidade do sistema é investigada para detecção de cor única fluoresceína, e mostra a capacidade de detectar gotículas com concentrações de até 0,1 nm, uma sensibilidade impr 200xovement quando comparado a uma fibra baseada recentes relatados na literatura 7.

<table><tbody><tr><td>Photomasks</td><td>CadArt Servcies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3" wafers de silício, tipo P, grau de teste virgem</td><td>University Wafers</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3035</td><td>Microchem</td><td>Y311074</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Microchem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit de elastômero de silicone</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>seringas de 1 ml</td><td>BD</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>seringas de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>27 agulhas de gauge</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>PE 2 tubo de polietileno</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>Fisher Scientific</td><td>98-0212-2928-5</td><td>Comumente conhecido como HFE 7500</td></tr><tr><td>Surfactante</td><td></td><td></td> Iônico Krytox <td>Instruções de síntese na ref #10</td></tr><tr><td>Corante azul cascata conjugado com dextrana</td><td>Life Technologies</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio fluoresceína</td><td>Sigma</td><td>28803</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td> <td>passa-banda quádruploSemrock</td><td>FF01-446/510/581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMM02</td><td></td></tr><tr><td>Porta de fibra</td><td>Thorlabs</td><td>PAFA-X-4-A</td><td></td></tr> tubo de <tr><td>lente</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de remendo com 200 &#956; m núcleo / 225 &#956; m revestimento de fibra óptica com uma extremidade descascada e um conector FC/PC</td><td>Cabo Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Patch com 105 &#956; m núcleo / 125 &#956; m revestimento de fibra óptica com uma extremidade descascada e um conector FC/PC</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>125 &#956; ferramenta de decapagem de fibra m</td><td>Thorlabs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>225 &#956; m ferramenta de decapagem de fibra</td><td>Thorlabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>adaptador de fibra laser</td><td>OptoEngine</td><td>FC/PC Adapter</td><td></td></tr><tr><td>405 nm CW laser a 50&nbsp; mW</td><td>OptoEngine</td><td>MDL-III-405</td><td>Distribuidor para lasers CNI</td></tr><tr><td>473 nm CW laser a 50&nbsp; mW</td><td>OptoEngine</td><td>MLL-FN-473-50</td><td></td></tr></tbody></table>

multicolor detecção de fluorescência para gota microfluídica utilizando fibras Ópticas

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Os ensaios de fluorescência são as leituras mais comuns usadas em microfluídica de gotículas devido aos seus sinais brilhantes e resposta rápida. Aplicações como ensaios multiplex, evolução enzimática e classificação celular aprimorada por biologia molecular requerem a detecção de duas ou mais cores de fluorescência. Os sistemas de detecção multicoloridos padrão que acoplam lasers de espaço livre a microscópios de epifluorescência são volumosos, caros e difíceis de manter. Neste artigo, descrevemos um esquema para realizar a detecção multicolorida por excitação de regiões discretas de um canal microfluídico com lasers acoplados a fibras ópticas. A luz emitida é coletada por uma fibra óptica acoplada a um único fotodetector. Como a excitação ocorre em diferentes locais espaciais, a identidade da luz emitida pode ser codificada como uma mudança temporal, eliminando a necessidade de esquemas de filtragem de luz mais complicados. O sistema tem sido usado para detectar populações de gotículas contendo quatro combinações únicas de corantes e para detectar concentrações subnanomolares de fluoresceína.

A fabricação de um dispositivo de PDMS que permite a inserção de fibras ópticas exige um processo de passos múltiplos a fotolitografia para criar canais de altura variável (Figura 1). Em primeiro lugar, uma camada de 80 um de altura de SU-8 é girada sobre uma bolacha de silício e modelado utilizando uma máscara para criar a geometria de manipulação de fluidos. Em seguida, um 40 um camada adicional de SU-8 é girado para a bolacha, e modelado usando uma segunda máscara par...

A detecção de fluorescência multicolorida em microfluídica de gotículas normalmente envolve sistemas de detecção baseados em microscópio de epifluorescência volumosos e complexos. Aqui descrevemos um esquema de detecção multicolorido compacto e modular que utiliza uma matriz de fibras ópticas para codificar temporariamente dados multicoloridos coletados por um único fotodetector.

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar uma aplicação simples da detecção de fluorescência em microfluídica de gotículas utilizando fibras ópticas. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na triagem biológica de alto rendimento, como a identificação de fenótipos raros e a evolução direcionada de enzimas. A principal vantagem desta técnica é que ela permite uma aplicação simples e de baixo custo da detecção de fluorescência em microfluídica de gotículas.Para começar, coloque uma lâmina de silício com diâmetro de três polegadas previamente limpa sobre o porta-lâmina a vácuo de um espalhador por centrifugação. Em seguida, aplique um mililitro de SU-8 3050 no centro da lâmina e gire-a para obter uma camada de fotoresina com espessura de 80 micrômetros. Retire a lâmina revestida do espalhador por centrifugação e coloque-a sobre uma placa aquecedora pré-aquecida a 135 graus Celsius.Após 30 minutos, remova a pastilha e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Em seguida, coloque a pastilha sobre uma superfície plana e alinhe a máscara da primeira camada sobre a pastilha. Exponha a pastilha sob um LED colimado de 190 miliwatts e 365 nanômetros por três minutos.Após a exposição, coloque a pastilha em uma placa aquecida a 135 graus Celsius por um minuto e, em seguida, deixe esfriar até a temperatura ambiente. Quando estiver fria, coloque a pastilha novamente no spin coater e fixe-a no porta-amostras. Aplique um mililitro adicional de SU-8 3050 no centro da pastilha e gire por 20 segundos a 500 r.p.m.seguido por 30 segundos a 5.000 r.p.m. Em seguida, aqueça a pastilha em uma placa quente. Deixe esfriar até a temperatura ambiente e depois coloque-a novamente sobre a superfície de alinhamento da máscara.Use o microscópio estereoscópico para alinhar manualmente a máscara da segunda camada com as marcas de alinhamento padronizadas na pastilha. Após o alinhamento adequado, exponha a pastilha revestida por 4-1/2 minutos usando as mesmas condições que anteriormente. Após a exposição, coloque a pastilha em uma placa aquecida a 135 graus Celsius por um minuto, depois resfrie a pastilha e fixe-a novamente no coater de rotação.Aplicar um mililitro de SU-8 3050 na pastilha pela terceira vez e centrifugar para adicionar mais 100 micrômetros de fotoresina. Remover a pastilha e aquecer em uma placa aquecedora a 135 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, resfriar até a temperatura ambiente e colocá-la sobre a superfície de alinhamento.Alinhe a máscara da terceira camada com a geometria anterior e exponha a pastilha revestida utilizando as mesmas condições anteriores por nove minutos. Após a exposição, coloque a pastilha em uma placa aquecida a 135 graus Celsius por um minuto e, em seguida, resfrie até a temperatura ambiente. Quando estiver fria, desenvolva as máscaras imergindo a pastilha em um banho agitado de revelador por 30 minutos.Por fim, lave a pastilha em isopropanol e, em seguida, aqueça-a pela última vez por um minuto em uma placa aquecedora a 135 graus Celsius. Armazene o molde acabado em uma placa de Petri de 100 milímetros até a moldagem. Prepare uma mistura de PDMS na proporção de 10:1, combinando 50 gramas da base de silicone com cinco gramas do agente de cura em um copo plástico.Misture o conteúdo com uma ferramenta rotativa e, em seguida, desgaseifique a mistura dentro de um dessecador por 30 minutos, ou até que todas as bolhas de ar sejam removidas. Despeje o PDMS desgaseificado sobre o molde preparado, obtendo uma espessura de três milímetros. Em seguida, coloque a placa de Petri de volta no dessecador para desgaseificação adicional.Após a remoção de todas as bolhas, aqueça o dispositivo a 80 graus Celsius por 80 minutos. Após o resfriamento, corte o dispositivo do molde usando um bisturi, de modo que ambas as telegeometrias de 120 micrômetros e 220 micrômetros fiquem acessíveis pelo lado do dispositivo. Em seguida, perfure as entradas e saídas fluidicas com um punch de biópsia de 0,75 mm.Submeta o dispositivo a um tratamento com plasma, com o lado das estruturas voltado para cima, junto com uma lâmina de vidro previamente limpa e plasma de oxigênio a 1 milibar por 20 segundos em um limpador de plasma de 300 watts. Una o dispositivo colocando firmemente o lado padronizado do dispositivo de PDMS sobre o lado tratado com plasma da lâmina de vidro. Em seguida, coloque o dispositivo em uma estufa a 80 graus Celsius e aqueça o dispositivo montado por 40 minutos.Após assar, use uma seringa para enxaguar o dispositivo com um fluido de tratamento superficial fluoretado para tornar os canais hidrofóbicos. Em seguida, asse imediatamente o dispositivo a 80 graus Celsius por 10 minutos para evaporar o solvente. Prepare duas fibras de excitação a laser removendo o isolamento dos últimos cinco milímetros das fibras ópticas.Além disso, prepare a fibra para coletar o sinal fluorescente removendo o isolamento dos últimos cinco milímetros de uma fibra óptica maior. Inspecione as pontas de todas as fibras sob um microscópio. Se as pontas não terminarem em uma superfície plana, refaça o corte das extremidades com uma caneta de corte para fibras.Em seguida, conecte um acoplador de fibra laser a um laser de 50 miliwatts e 405 nanômetros e conecte uma das fibras de núcleo de 105 micrômetros ao laser. Direcione a extremidade descascada do sensor de um medidor de potência a laser e use os ajustes finos do acoplador do laser para maximizar a potência do laser. Realize o mesmo processo para ajustar a outra fibra utilizando um laser de 50 miliwatts e 473 nanômetros.Em seguida, monte um filtro de banda passante quádruplo no tubo fotomultiplicador utilizando tubos de lentes para bloquear a luz do laser e transmitir a fluorescência emitida. Fixe um acoplador de fibra para que a luz passe pelos filtros antes de atingir o tubo fotomultiplicador. A seguir, conecte a fibra coletora ao acoplador de fibra.Coloque o chip microfluídico fabricado sobre a platina de um microscópio invertido acoplado a uma câmera digital capaz de velocidades de obturador de pelo menos 100 microssegundos. Trabalhando cuidadosamente a partir dos lados, insira a fibra acoplada ao laser de 473 nanômetros no canal de 120 micrômetros mais a montante. Tenha cuidado para não perfurar até o canal de fluxo principal.Em seguida, insira a fibra acoplada ao laser de 405 nanômetros no canal lateral mais distante a jusante, com altura de 120 micrômetros, proporcionando um espaçamento entre fibras de 300 micrômetros. Por fim, insira a fibra acoplada ao tubo fotomultiplicador maior no canal com 220 micrômetros de altura, perpendicular aos dois fibras de excitação a laser. Encha uma seringa de cinco mililitros com HFE 7500 contendo 2% de fluorosurfactante iônico e monte-a na entrada de óleo espaçador do dispositivo de detecção utilizando tubo PE2.Em seguida, encha uma seringa com uma emulsão mista de FITC e corante azul e fixe-a em uma bomba de seringa orientada verticalmente acoplada ao dispositivo como entrada de reinsuflação de gotículas, utilizando tubo PE2. Conecte um trecho de tubo PE à saída do dispositivo e direcione-o a um recipiente de resíduos. Em seguida, prepare o dispositivo operando ambas as bombas a 1.000 microlitros por hora até que se observe a combinação regular do óleo e das gotículas no interior do dispositivo e seu fluxo contínuo a jusante.Ajuste as taxas de fluxo de modo que o óleo espaçador flua a 6.000 microlitros por hora e as gotículas a 100 microlitros por hora, proporcionando um espaçamento significativo entre as gotículas que atravessam a região de detecção. Em seguida, ligue os lasers e inicie o programa de aquisição de dados. Ajuste então o ganho do tubo fotomultiplicador para obter sinais superiores a 100 vezes o nível de ruído de fundo.Por fim, ajuste a potência do laser para que todos os picos em duplo sejam claramente visíveis em um único traçado temporal com escala linear. Uma gotícula que flui através do canal de detecção encontra regiões discretas de excitação diante de cada uma das fibras ópticas acopladas ao laser. A fibra de detecção registra a fluorescência emitida com um deslocamento temporal, cuja separação entre picos correlaciona-se com o tempo necessário para uma gotícula se deslocar de uma região de excitação até a próxima.Isso elimina a necessidade de filtragem adicional de luz e de tubos fotomultiplicadores separados. A eficácia do esquema de detecção foi testada detectando uma emulsão mista de gotículas contendo corantes que excitam a 405 nanômetros e a 473 nanômetros. Este gráfico mostra uma separação clara entre os quatro tipos de gotículas reinjetadas quando fluídas a aproximadamente 50 hertz.A faixa dinâmica e a sensibilidade absoluta do detector foram investigadas mediante a medição de gotículas contendo apenas fluoresceína. Os dados mostram a capacidade do sistema de detectar concentrações de corante que variam de 0,1 a 100 nanomolares. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como implementar um sistema de detecção de fluorescência simples e compacto, utilizando uma matriz de fibras ópticas inseridas e um único detector fotônico.

multicolor-fluorescence-detection-for-droplet-microfluidics-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste artigo vamos descrever como obtemos FRET traços de moléculas individuais de DNA imobilizado em uma superfície usando um microscópio de varredura confocal automatizado.

Sistema automatizado para medições única molécula de fluorescência de Superfície-imobilizada Biomoléculas

Um sem lente no chip plataforma de microscopia fluorescente é demonstrado que pode objetos de imagem fluorescente através de uma ultra-wide campo de visão de, por exemplo,&gt; 0,6-8 cm2 com &lt;4μm resolução usando uma amostra de compressão baseada algoritmo de decodificação. Como um compacto e de campo amplo modalidade de imagem fluorescente on-chip poderia ser valioso para high-throughput citometria, raro de célula de pesquisa e análise de microarray.

Microscopia fluorescente sem lente em um Chip

Gota plataformas baseadas microfluídicos são candidatos promissores para a experimentação de alto rendimento, uma vez que são capazes de gerar picolitros, auto-compartimentada vasos barata a taxas kHz. Através da integração com rápido, sensível e de alta resolução de fluorescência métodos espectroscópicos, a grande quantidade de informações geradas nesses sistemas podem ser eficientemente extraído, aproveitada e utilizada.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

Este vídeo demonstra o uso da espectroscopia de flutuação de fluorescência para detectar a interação entre as proteínas da superfície celular nos contatos célula-célula. Ao expressar o receptor de adesão transmembrana de interesse marcado com uma proteína fluorescente e misturar duas populações de células diferentes que abrigam dois marcadores fluorescentes separados espectralmente, a transinteração entre os receptores de duas células vizinhas com fluorescência de cores diferentes é avaliada...

Espectroscopia de Flutuação de Fluorescência para Estudar a Interação de Proteínas em Contatos Celulares

Os sensores fluorescentes de núcleo microcavidade empregar um alto índice de revestimento quantum dot-no canal de sílica microcapilares. As mudanças no índice de refracção dos fluidos bombeados para a causa do canal capilar se desloca no espectro de fluorescência microcavidade que pode ser utilizado para analisar o meio do canal.

Síntese e Operação de Fluorescente-core microcavidades de Sensoriamento refractométricos

Demonstramos o uso da microscopia de localização por fotoativação por fluorescência (FPALM) para obter imagens simultâneas de vários tipos de moléculas marcadas com fluorescência dentro das células. As técnicas descritas produzem a localização de milhares a centenas de milhares de proteínas individuais marcadas com fluorescência, com uma precisão de dezenas de nanômetros dentro de células individuais.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Este trabalho apresenta um método simples e visual para detectar polimorfismos multi-nucleotídeos em uma plataforma de manipulação gota pneumático. Com o método proposto, toda a experiência, incluindo gota de manipulação e de detecção de polimorfismos de vários nucleótidos, pode ser realizada próximo de 23 ° C, sem o auxílio de instrumentos avançados.

A detecção visual Colorimétrico de polimorfismos multi-nucleótidos em uma plataforma de manipulação pneumático gota

Aqui, apresentamos um protocolo para multi cor localização das proteínas de membrana única em organelas de células vivas. Para anexar fluorophores, auto rotulação de proteínas são utilizadas. Proteínas, localizadas em compartimentos diferentes membranas da organela a mesma, podem ser localizadas com precisão de ~ 18 nm.

Localização de cor multi microscopia de proteínas de membrana única em organelas de células de mamíferos vivas

Aqui nós apresentamos um guia prático de construção de um sistema integrado de microscopia, que mescla imagens de epi-fluorescente convencional, único-molécula detecção-baseado Super-resolução imagem e deteção de único-molécula multi cor, incluindo transferência de energia de ressonância de fluorescência de único-molécula de imagem, em um set-up de uma maneira custo-eficiente.

Realização de vários modos de imagem com um microscópio de fluorescência

A bioquímica visual de molécula única estudada através de câmaras microfluídicas é muito facilitada usando barril de vidro, seringas à prova de gás, conexões estáveis de tubos para células de fluxo e eliminação de bolhas colocando válvulas de comutação entre as seringas e a tubulação. O protocolo descreve armadilhas ópticas duplas que permitem a visualização de transações de DNA e interações intermoleculares.

Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única

O protocolo descreve uma plataforma microfluídica avançada para medir quantitativamente a dinâmica da secreção de citocinas de células mononucleares individuais do sangue periférico humano. A plataforma mede até três citocinas em paralelo (IL-6, TNFα e IL-1β) para cada célula individual estimulada com lipopolissacarídeo como exemplo.

Abordagem microfluídica para resolver a secreção simultânea e sequencial de citocinas de células polifuncionais individuais 

Aprenda detecção de fluorescência multicolorida em microfluídica de gotas utilizando fibras ópticas. Este método simplificado e econômico permite triagem biológica de alto rendimento e identificação de fenótipos raros em pesquisa.

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

Explorar mais vídeos