Name: Um Modelo de enzimas e Cultura de Células-Tronco Neural Serum-livre para EMT Investigation Adequado para Drug Discovery (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprenda a induzir migração em células-tronco neurais não migratórias para investigar a transição epitélio-mesenquimal (EMT) em câncer. Este modelo in vitro permite identificar compostos que ativam ou bloqueiam a migração celular.

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O estudo foi apoiado pela Universidade de Basel Science Foundation ea National Science Foundation suíço por uma doação para MHS e AG (SNF IZLIZ3_157230). Agradecemos: Dr. Tania Rinaldi Burkat para generosamente fornecer infra-estrutura; todos os membros do grupo Bettler para discussões e comentários. Agradecemos Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Suíça) para a instalação profissional e competente da completa câmera de vídeo HD MC170 (Leica Microsystems, Suíça).

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste estudo um sistema padronizado para análise EMT NSCs utilizando é descrito (resumido na Suplementar Figura 3). A padronização garante a reprodutibilidade (Tabela 1 e 2). As NSC são derivadas do córtex em desenvolvimento, um tecido que normalmente não sofre EMT. Isto é de vantagem para a análise dos primeiros passos no EMT. passos iniciais na EMT não pode ser adequadamente estudado em células tumorais que se acumularam mudanças genéticas e pode já adoptadas características de EMT. A...

Durante vários estágios do desenvolvimento embrionário, células epiteliais perdem a sua forte aderência entre si (por exemplo, junções apertadas) e adquirir um fenótipo migratória em um processo chamado epitelial para mesenquimal (EMT) 1. EMT é necessário para a formação de tipos de células adicionais, tais como as células da crista neural mesenquimais, uma população que segrega do neuroepitélio 2. EMT não é apenas essencial durante a fase embrionária, mas também necessária em fases posteriores da vida adulta para manter os processos fisiológicos no organismo adulto, como a cicatrização de feridas 3 e sistema nervoso central de regeneração (CNS) em lesões desmielinizantes 4. Tumores epiteliais são conhecidos para reativar EMT como uma etapa de iniciação para a migração, invasão e metástase, levando a progressão do câncer de 1,3. EMT está de facto ligado centralmente a uma forte 1,3 migração. Os passos de c celularesonditioning, iniciando, sofrendo e manutenção de EMT não são totalmente compreendidos e necessitam de uma investigação mais aprofundada. Aqui, um padronizado sistema modelo in vitro baseado em EMT NSC, com factores de crescimento definidos e meios (sem soro e sem o uso de enzima) é apresentada. Este sistema modelo é de relevância para os cientistas que trabalham em EMT. O caracol, Zeb e torção famílias de proteínas têm sido mostrados para ser crítico para EMT tanto em desenvolvimento e uma doença. O caracol, Zeb e torção famílias também estão envolvidos no sistema apresentado. O sistema baseia-se numa região específica do cérebro anterior que, normalmente, não sofre EMT proporcionando uma vantagem particular para o estudo dos acontecimentos iniciais de indução durante EMT. O sistema modelo poderia potencialmente ser aplicada ao estudo de EMT em epitélios fora do SNC, uma vez que os indutores EMT-chave, tais como o caracol, Zeb e proteínas torção, também são encontradas durante EMT em sistemas de tecido fora do SNC. Este modelo sistema permite o isolamento padronizado de NSCs a partir do córtex em desenvolvimento a estudar características de células-tronco em geral e EMT em particular. Usando este sistema, foram isoladas as NSC, EMT induzida e estudada a migração subsequente sob o efeito de FGF2 e BMP4. Observamos que FGF e interage BMP-sinalizando com TGF-sinalização para promover a migração celular, validando o sistema modelo.

<table><tbody><tr><td>BMP4, rhBMP4</td><td>Sistemas RnD&nbsp;</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>Insulina para pâncreas bovino</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Boyden, ensaio de invasão celular CytoSelect</td><td>Cell Biolabs</td><td>CBA-110 Sistema de</td><td>placa de 24 poços</td></tr><tr><td>Placa de cultura celular com grade</td><td>Placa Ibidi de 500 mm, 35 mm</td><td>80156</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Orange</td><td>Life Technologies</td><td>C10045</td><td>Corante de membrana plasmática, uso a 1:1.000.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>LifeTechnologies</td><td>D1306</td><td>Estoque a 5 mg/ml. Use a 1:10.000. Cancerígeno. É necessária uma proteção adequada (luvas, casaco, óculos de proteção).</td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1 garrafa média</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>FGF2, rhFGF2</td><td>RnD Systems</td><td>233-FB-01M</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina, bovino</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F4759</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento Glutamax&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Software gráfico com recurso de medição de pixels</td><td>Fiji</td><td>fiji.sc/Fiji</td><td>versão 2.0.0-rc-30/1.49s</td></tr><tr><td>HBSS media</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrina humana</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>Possível irritante pulmonar. Evite a inalação. Use proteção adequada.</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Nestin, anticorpo anti Nestin de camundongo</td><td>Genetex</td><td>GTX26142</td><td>Use a 1:100, fixação de PFA a 4%, Triton X100 a 0,1%</td></tr><tr><td>Olig2, anticorpo anti Olig2 de coelho</td><td>Fornecido por Hirohide Takebayash</td><td>Estoque pessoal</td><td>Use a 1:2.000, fixação de PFA a 4%, Triton X100 a 0,1%</td></tr> <tr><td>de penicilina/estreptomicina/fungizone</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Podoplanina, anticorpo anti Podoplanina de camundongo</td><td>Acris</td><td>DM3614P</td><td>Use a 1:250, fixação de PFA a 4%, evite Triton X100</td></tr><tr><td>Poly-L-ornitina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P5780</td><td>Irritante para a pele e os olhos. Proteção apropriada necessária.</td></tr><tr><td>Selenito de sódio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Sox10, anticorpo anti Sox10 do coelho</td><td>Millipore Chemicon</td><td>AB5774</td><td>Uso em 1:200, fixação de 4% PFA, Triton X100 em 0.1%</td></tr><tr><td>TGFb1, sistemas rhTGFb1</td><td>RnD</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri não revestidas</td><td>Falcon Corning</td><td>351029</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de enzimas e cultura de células-tronco neural serum-livre para emt investigation adequado para drug discovery

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Epitelial para mesenquimal (EMT) descreve o processo de epitélio transdifferentiating em mesênquima. EMT é um processo fundamental durante o desenvolvimento embrionário que também ocorre frequentemente em glioblastoma, o tumor cerebral maligno mais frequente. EMT também tem sido observado em vários carcinomas fora do cérebro, incluindo o cancro da mama, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro gástrico. EMT está centralmente ligada a malignidade por promoção da migração, invasão e formação de metástases. Os mecanismos de indução de EMT não são completamente compreendidos. Aqui, descrevemos um sistema in vitro para o isolamento padronizada de células estaminais neurais corticais (NCCC) e subsequente EMT-indução. Este sistema oferece a flexibilidade para usar tanto as células individuais ou cultura explante. Neste sistema, rato ou ratinho embrionárias NSC prosencéfalo são cultivadas num meio definido, isento de soro e enzimas. As NSC expressa Olig2 e SOX10, dois factores de transcrição observada em oligodendroccélulas precursoras yte (OPCs). Usando este sistema, as interacções entre FGF, BMP- e TGFp-sinalização envolvendo Zeb1, Zeb2, e Twist2 foram observados onde o TGFp-activação melhorado significativamente a migração de células, sugerindo um sinérgico / TGFp-interacção BMP-. Os resultados apontam para uma rede de FGF, BMP- e TGF-sinalização de estar envolvido na indução e manutenção EMT. Este sistema de modelo é relevante para investigar in vitro EMT. É rentável e mostra alta reprodutibilidade. Além disso, permite a comparação de diferentes compostos no que diz respeito às suas respostas de migração (medição quantitativa distância), e rastreio de alto rendimento de compostos que inibem ou aumentam EMT (medição qualitativa). O modelo é, portanto, bem adequado para testar bibliotecas de drogas para as substâncias que afectam a EMT.

Este sistema modelo de EMT baseia-se no isolamento normalizado de NSC tanto como células individuais ou como explantes a partir de uma região específica do tubo neural em desenvolvimento, o córtex central (Figuras 1 e 2). Para a avaliação quantitativa, os explantes foram semeadas à direita no centro de uma placa de cultura de 500 mm de grelha (Figura 3). Os explantes do córtex central, foram primeiro expostas a FGF2 durante dois dias, se...

A transição epitelial para mesenquimal (EMT) permite que os cânceres se tornem invasivos. Para investigar a EMT, é descrito um modelo in vitro baseado em células-tronco neurais (NSC) desprovido de soro e enzimas. Este sistema padronizado permite a avaliação quantitativa e qualitativa da migração celular, expressão gênica e proteica. O modelo é adequado para a descoberta de medicamentos.

Um Modelo de enzimas e Cultura de Células-Tronco Neural Serum-livre para EMT Investigation Adequado para Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

O objetivo geral deste procedimento é induzir a migração em células tipicamente não migratórias, a fim de identificar compostos específicos que ativem ou bloqueiem a migração. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de migração e invasão celular, e pode ser de particular interesse para cientistas que trabalham com células-tronco neurais. A principal vantagem desta técnica é que células não migratórias e não invasivas podem ser analisadas durante o processo de tornarem-se migratórias e invasivas.As implicações dessa técnica estendem-se à identificação de compostos novos que bloqueiam a transição epitelial para mesenquimal, ou EMT, que ocorre em gliomas humanos de alto grau acreditados derivar de células-tronco neurais. Embora este método possa fornecer informações sobre a EMT e células-tronco neurais, ele também pode ser usado para estudar outros cânceres epiteliais, como câncer de mama, pulmão ou cólon. No dia embrionário 14,5, confirme a idade correta dos embriões de rato pela presença da formação inicial dos dígitos em uma pata dianteira do rato.Em seguida, transfira os embriões para placas de Petri individuais, não revestidas, contendo PBS gelado, que

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo descreve o método utilizado para o isolamento de neuroprecursors desenvolvimento do córtex de ratos embrionárias. O procedimento para a remoção de embriões do útero, dissecando o tecido cortical, e digerindo o córtex cerebral isolado é mostrado.

Cultura de rato precursores das células-tronco neurais

Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do ensaio neurosphere para o isolamento e expansão de células-tronco neurais do eminências ganglionares do dia 14 de embriões de rato-cérebro.

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Um método simples e confiável sobre o isolamento e cultura de células-tronco neurais de tecido fetal humano descartado cortical é descrito. Derivados de culturas humanas conhecidas doenças neurológicas podem ser usados ​​para a caracterização de processos patológicos celular e molecular, bem como fornecer uma plataforma para avaliar a eficácia farmacológica.

Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

Células-tronco neurais colhidas a partir do cérebro de adultos estão aumentando utilizado em aplicações que vão desde a pesquisa básica do desenvolvimento do sistema nervoso para explorar potenciais aplicações clínicas em medicina regenerativa. Isso faz com que o controle rigoroso das condições de isolamento e cultivo utilizados para cultivar essas células críticas a soar os resultados experimentais.

Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Os protocolos descrevem dois sistemas in vitro de testes de toxicidade de desenvolvimento (UKK e UKN1) com base em células estaminais embrionárias humanas e estudos de transcriptoma. Os sistemas de teste prever risco de toxicidade para o desenvolvimento humano, e pode contribuir para reduzir os estudos em animais, dos custos e do tempo necessário para os testes de segurança química.

Human células estaminais pluripotentes Baseado Developmental Toxicity Ensaios para Química Triagem e Safety Systems Biology Data Generation

Um protocolo personalizado é descrito para diferenciar células ES de camundongos em populações definidas de neurônios altamente puros exibindo sinapses funcionais e comportamento de rede emergente. A análise eletrofisiológica demonstra a perda da transmissão sináptica após a exposição aos sorotipos de neurotoxina botulínica / A- / G e neurotoxina tetânica.

Avaliação Funcional de neurotoxinas Biológica em Culturas em Rede de Células-Tronco derivadas do Sistema Nervoso Central Neurônios

Com a intenção de caracterizar mudanças em miRNAs em células-tronco neurais humanas diferenciadas (hNSCs), descrevemos a diferenciação de hNSC em um sistema tridimensional, a avaliação de mudanças na expressão de microRNAs por matriz de PCR de miRNA e análise computacional para predição de alvos de miRNAs e sua validação por ensaio de luciferase dupla.

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

Este protocolo descreve em detalhes o método para gerar progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias usando um método de monocamada sem soro. Esses progenitores podem ser usados para derivar tipos de células neurais maduras ou para estudar o processo de especificação neural e são passíveis de escalonamento de formato multipoço para triagem de compostos.

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

Aqui, relatamos um protocolo para desenvolver um sistema tridimensional (3-D) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) chamado corpo embrionóide sem soro (SFEB). Este modelo 3-D pode ser usado como uma cultura de fatia organotípica para modelar o desenvolvimento cortical humano e para a interrogação fisiológica do desenvolvimento de circuitos neurais.

Desenvolvimento de corpos de embrióide livres de soro derivado de HiPSC para a interrogação de culturas de células estaminais 3-D usando ensaios relevantes para o fisiologismo

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Aqui, estabelecemos um método de baixo custo e fácil de operar que direciona a diferenciação rápida e eficiente das células-tronco embrionárias para os neurônios. Este método é adequado para popularização entre laboratórios e pode ser uma ferramenta útil para a pesquisa neurológica.

Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

Aprenda a induzir migração em células-tronco neurais não migratórias para investigar a transição epitélio-mesenquimal (EMT) em câncer. Este modelo in vitro permite identificar compostos que ativam ou bloqueiam a migração celular.

Um Modelo de enzimas e Cultura de Células-Tronco Neural Serum-livre para EMT Investigation Adequado para Drug Discovery

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