Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

O objetivo geral deste procedimento é visualizar os eventos dinâmicos dentro do microambiente tumoral por meio de mircrospia multifotônica intravital de alta resolução. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o microambiente tumoral, como quais eventos dinâmicos estão envolvidos na permeabilidade vascular e nas interações multicelulares. A principal vantagem dessa técnica é que a cinética dos eventos no microambiente tumoral pode ser observada e medida.

Antes de iniciar o procedimento, ligue todos os componentes do microscópio e do laser, incluindo os dois lasers de fótons e os detectores. E defina a caixa de aquecimento para 30 graus Celsius para pré-aquecer o palco. Limpe o microscópio stage e o inserto do stage com 70% de etanol.

Quando o platina estiver seco, coloque uma grande gota de água na objetiva do microscópio de 25 x 1,05 NA para manter contato óptico com a lamínula e coloque uma lamínula de cobertura de 1,5 de espessura sobre a porta de imagem da inserção. Em seguida, corte um pedaço de tubo de polietileno de 30 centímetros. Coloque a almofada de borracha em cima da lamínula.

Usando uma pinça, quebre uma agulha de calibre 31 de seu encaixe de plástico e insira a extremidade embotada do cubo da agulha no tubo. Insira e conecte uma agulha de calibre 31 na outra extremidade do tubo PE. Em seguida, encha uma seringa de um cc com PBS estéril e coloque a seringa na agulha de calibre 31.

Use o PBS para liberar todo o ar do tubo e da agulha. Em seguida, um seringa cc com 200 microlitros do rótulo vascular apropriado e outro com a proteína injetável apropriada. Antes de iniciar a cirurgia, confirme a anestesia adequada com falta de resposta ao beliscão do dedo do pé e aplique pomadas oculares no camundongo anestesiado.

Em seguida, coloque o animal em uma plataforma cirúrgica sob uma lâmpada de calor para aumentar a circulação da cauda. Após dois minutos, esterilize a cauda com etanol a 70% e insira a ponta do cateter de calibre 31, dois a três milímetros, na veia lateral da cauda. Em seguida, coloque um comprimento de um centímetro de fita adesiva no cateter para segurar a agulha paralela à veia ao longo do comprimento da cauda.

Quando o cateter estiver preso, esfregue as superfícies ventral e tumoral com etanol a 70%. Em seguida, levante a pele sobre o abdômen e use uma tesoura estéril para fazer uma incisão subcutânea de aproximadamente um centímetro ao longo da linha média ventral do abdômen, tomando cuidado para evitar perfurar o peritônio. Corte suavemente o tecido conjuntivo que prende a glândula mamária e o tumor longe do peritônio para expor o tumor.

Em seguida, usando a tesoura e a pinça, remova suavemente a fáscia e a gordura da superfície exposta do tumor. Quando o tumor tiver sido exposto, transfira o mouse para o estágio de imagem pré-aquecido. Use fitas de laboratório para prender a lamínula e, em seguida, coloque o tumor no orifício de uma almofada de borracha que cobre a lamínula sobre a objetiva do microscópio.

Quando o animal estiver em posição, encha a câmara de borracha com PBS para manter o tecido hidratado e manter contato óptico com a lamínula. Coloque um sensor de coleira de sonda de oxímetro de pulso ao redor do pescoço para monitorar os sinais vitais do animal e coloque a caixa de aquecimento sobre o animal. Em seguida, use os IPs do microscópio para focar nas células tumorais fluorescentes na superfície do tumor e na área localizada com vasos sanguíneos fluindo.

Depois que uma região de interesse for selecionada, mude o microscópio para o modo de imagem multifotônica e use o ajustador de foco para mover a objetiva para o local inicial desejado. Em seguida, clique no botão superior da posição Z para definir o limite superior da série z e visualizar a rede de fibras colágenas na superfície do tumor no canal de geração do segundo harmônico. Em seguida, mova a objetiva para a profundidade de imagem desejada e clique no botão inferior da posição z para definir o limite inferior da série z.

Em seguida, insira o valor desejado nos campos de tamanho da etapa. Em seguida, mude para o Painel de lapso de tempo e insira o tempo de lapso apropriado. Uma vez determinados os parâmetros de imagem, substituir a seringa acoplada ao cateter por uma seringa de corante de marcação vascular e administrar lentamente no máximo 200 microlitros da solução de corante, cuidando para que a solução entre na veia.

Após a injeção, retorne a seringa PBS ao cateter e inicie a imagem de lapso de tempo da etapa z. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, substitua a seringa de PBS pela seringa que contém a proteína injetável, tomando cuidado para não introduzir bolhas na linha. Em seguida, injete lentamente a suspensão de proteína no camundongo e substitua a seringa por uma seringa contendo PBS.

Os macrófagos podem ser rastreados com 70 kilodalton marcados com fluorescência e dextrana que se acumulam nos micrófagos fagocíticos. A marcação dupla das células tumorais e dos micrófagos permite que a interação direta com esses dois tipos de células seja visualizada em tempo real. Para visualizar mudanças na permeabilidade vascular do tumor, pontos quânticos também podem ser usados para rotular o espaço vascular.

Como são grandes o suficiente para não se difundirem facilmente pelos espaços interarteriais. A imagem contínua de alta resolução facilita a captura dos eventos de permeabilidade vascular e a quantificação da cinética do extravasamento e depuração do dextrano. Neste campo de visão de exemplo, o pico do di-extravasamento vacscular é observado entre 29 e 34 minutos, conforme evidenciado pelo sinal TMR extravascular.

A injeção de corantes ou proteínas vasculares adicionais para induzir a permeabilidade vascular pode fornecer informações sobre os eventos de sinalização que regulam a permeabilidade vascular. De fato, nos primeiros segundos da injeção, 10 kilodaltons de dextrano FITC podem ser observados extravasando da vasculatura, enquanto os 155 kilodalton em dextrana TMR permanecem confinados ao espaço vascular. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em uma hora se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de remover o tecido conjuntivo suavemente sem danificar a superfície do tumor e manter a superfície do tumor hidratada. Seguindo este procedimento de dinâmica celular, essa migração de células tumorais pode ser visualizada para responder a perguntas adicionais sobre a direcionalidade da migração e intravasamento de células tumorais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar eventos celulares dinâmicos em um microambiente tumoral por microscopia multifotônica intervital.