Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

O objetivo geral deste procedimento é visualizar os eventos dinâmicos dentro do microambiente tumoral por meio de microscopia intravital de múltiplos fótons com alta resolução. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o microambiente tumoral, como quais eventos dinâmicos estão envolvidos na permeabilidade vascular e nas interações multicelulares. A principal vantagem desta técnica é que a cinética dos eventos no microambiente tumoral pode ser observada e medida.

Antes de iniciar o procedimento, ligue todos os componentes do microscópio e do laser, incluindo os lasers de dois fótons e os detectores. E ajuste a caixa de aquecimento para 30 graus Celsius para pré-aquecer a platina. Limpe a platina do microscópio e o inserto da platina com etanol 70%.

Quando o estágio estiver seco, coloque uma grande gota de água sobre a objetiva microscópica 25 x 1,05 NA para manter o contato óptico com o lamínula e posicione um lamínula de espessura número 1,5 sobre a porta de imagem do inserto. Em seguida, corte um pedaço de tubo de polietileno com 30 centímetros de comprimento. Coloque a almofada de borracha sobre o lamínula.

Usando pinças, quebre uma agulha de calibre 31 do seu encaixe de plástico e insira a extremidade romba da base da agulha na tubulação. Insira e fixe uma agulha de calibre 31 na outra extremidade da tubulação de PE. Em seguida, encha uma seringa de 1 cc com PBS estéril e acople a seringa à agulha de calibre 31.

Use o PBS para remover todo o ar da tubulação e da agulha. Em seguida, prepare uma seringa de um cc com 200 microlitros do marcador vascular apropriado e outra com a proteína injetável apropriada. Antes de iniciar a cirurgia, confirme a anestesia adequada pela ausência de resposta ao aperto nos dedos dos pés e aplique pomadas oftálmicas no camundongo anestesiado.

Em seguida, coloque o animal sobre uma plataforma cirúrgica sob uma lâmpada de calor para aumentar a circulação da cauda. Após dois minutos, esterilize a cauda com etanol 70% e insira a ponta da cânula de calibre 31, de dois a três milímetros na veia lateral da cauda. Depois, coloque um pedaço de fita laboratorial de um centímetro de comprimento sobre a cânula para manter a agulha paralela à veia ao longo do comprimento da cauda.

Após fixar o cateter, limpe as superfícies ventral e do tumor com etanol 70%. Em seguida, levante a pele sobre o abdômen e use tesoura estéril para fazer uma incisão subcutânea de aproximadamente um centímetro ao longo da linha média ventral do abdômen, tomando cuidado para evitar perfurar o peritônio. Corte suavemente o tecido conjuntivo que prende a glândula mamária e o tumor ao peritônio, expondo assim o tumor.

Em seguida, utilizando a tesoura e a pinça, remova suavemente a fáscia e a gordura da superfície exposta do tumor. Quando o tumor estiver exposto, transfira o camundongo para a platina de imagem pré-aquecida. Use fita laboratorial para fixar o cubre-objeto e, então, posicione o tumor no orifício de uma almofada de borracha que recobre o cubre-objeto sobre o objetivo do microscópio.

Quando o animal estiver posicionado, preencha a câmara do coxim de borracha com PBS para manter o tecido hidratado e garantir o contato óptico com a lamínula. Coloque um sensor de oxímetro de pulso ao redor do pescoço para monitorar os sinais vitais do animal e posicione a caixa de aquecimento sobre o animal. Em seguida, utilize os IPs do microscópio para focalizar as células tumorais fluorescentes na superfície do tumor e identificar a área com vasos sanguíneos em fluxo.

Uma vez que uma região de interesse tenha sido selecionada, altere o microscópio para o modo de imagem multiphoton e use o ajustador de foco para mover a objetiva até a posição inicial desejada. Em seguida, clique no botão superior de posição Z para definir o limite superior da série z e visualize a rede de fibras de colágeno na superfície do tumor no canal de geração de segundo harmônico. Depois, mova a objetiva até a profundidade de imagem desejada e clique no botão inferior de posição z para definir o limite inferior da série z.

Em seguida, insira o valor desejado nos campos de tamanho do passo. Depois, mude para o Painel de Intervalo de Tempo e insira o tempo de intervalo apropriado. Uma vez que os parâmetros de imagem tenham sido determinados, substitua a seringa conectada ao cateter por uma seringa contendo corante para marcação vascular e administre lentamente no máximo 200 microlitros da solução de corante, tomando cuidado para que a solução entre na veia.

Após a injeção, retorne a seringa de PBS ao cateter e inicie a aquisição de imagens com lapso de tempo no eixo z. Quando todas as imagens forem obtidas, substitua a seringa de PBS pela seringa contendo a proteína injetável, tomando cuidado para não introduzir bolhas na linha. Em seguida, injete lentamente a suspensão de proteína no camundongo e substitua a seringa por outra contendo PBS.

Os macrófagos podem ser rastreados com dextrano fluorescentemente marcado de 70 quilodaltons, que se acumula nos micrófagos fagocíticos. A dupla marcação das células tumorais e dos micrófagos permite visualizar em tempo real a interação direta entre esses dois tipos celulares. Para visualizar alterações na permeabilidade vascular do tumor, pontos quânticos também podem ser utilizados para marcar o espaço vascular.

Como são grandes o suficiente para não difundir facilmente pelos espaços interarteriais. A imagem contínua de alta resolução facilita a captura dos eventos de permeabilidade vascular e a quantificação da cinética da extravasação e da eliminação de dextrano. Neste exemplo de campo de visão, o pico da dupla extravasação vascular é observado entre 29 e 34 minutos, evidenciado pelo sinal de TMR extravascular.

A injeção de corantes ou proteínas vasculares adicionais para induzir permeabilidade vascular pode fornecer informações sobre os eventos de sinalização que regulam a permeabilidade vascular. De fato, nos primeiros segundos após a injeção, pode-se observar a extravasação de dextrana marcada com FITC de 10 quilodaltons a partir da vasculatura, enquanto a dextrana marcada com TMR de 155 quilodaltons permanece confinada ao espaço vascular. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em uma hora, se realizada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de remover o tecido conjuntivo suavemente, sem danificar a superfície do tumor, e manter a superfície do tumor hidratada. Após este procedimento de dinâmica celular, pode-se visualizar a migração de células tumorais para responder a questões adicionais sobre a direcionalidade da migração celular tumoral e a intravasão. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como visualizar eventos celulares dinâmicos em um microambiente tumoral por meio de microscopia multiphoton intravitais.