De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

O objetivo geral deste procedimento é criar um camundongo humanizado modificado com receptor de antígeno quimérico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos do HIV e da imunologia em relação ao teste da eficácia da imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV e outras infecções crônicas e malignidades. Como um mecanismo de falha imunológica e maneiras de melhorar o sistema imunológico e desenvolver uma terapia para criar uma melhor imunidade antiviral ou antitumoral.

A principal vantagem dessa técnica é que ela é capaz de uma grande quantidade de manipulações experimentais. O modelo de camundongos BLT humanizados imita a imunidade humana e, neste caso, permite testes pré-clínicos para terapias genéticas baseadas em células contra a infecção pelo HIV. Demonstrando o procedimento estarão Valerie Rezek e Brianna Lam, elas são técnicas do meu laboratório.

Comece usando bisturis para cortar o timo em pequenos pedaços de cerca de um milímetro cúbico em um prato contendo meio RPMI suplementado. Em seguida, usou uma pinça curva romba para colocar cada pedaço de timo em um único poço em uma placa de 96 poços. Adicione 100-200 microlitros de meio a todos os poços para que o tecido não seque.

Visualize o tecido ao microscópio para eliminar qualquer tecido que não seja timo ou que tenha tecido conjuntivo anexado. Em seguida, remova os pedaços confirmados de timo e combine-os em um frasco de cultura de células T25. Adicione sete mililitros de meio RPMI suplementado com antibióticos ao frasco e agite suavemente para misturar.

Em seguida, colocar o balão na incubadora de cultura de tecidos. Esta etapa evita a contaminação bacteriana do tecido. Comece o isolamento de HSCs CD34 positivos do fígado fetal usando dois bisturis para cortar o fígado em pequenos pedaços de cerca de três milímetros cúbicos em um prato contendo IMDM.

Remova e descarte qualquer tecido conjuntivo branco. Em seguida, use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha romba de calibre 16 para retirar os pedaços de fígado e o meio e transfira para um tubo cônico de 50 mililitros. Pegue e expulse suavemente mais cinco a sete vezes para homogeneizar completamente o tecido.

Depois de preparar 10 mililitros de meio IMDM, complemente-o com colagenase, hialuronidase, antibióticos, Dnase e antifúngico. Passe a mídia por um filtro de 0,22 mícron. Em seguida, adicione o meio filtrado à suspensão hepática.

Depois de tampar o tubo cônico de 50 mililitros contendo a suspensão hepática, feche bem com filme autovedante, como parafilme, para evitar vazamentos. Gire em um rotador de tubo na incubadora de 37 graus Celsius por 90 minutos. Após a incubação, filtre a suspensão celular digerida através de um filtro de células de 100 mícrons em um tubo novo de 50 mililitros.

Adicione PBS à suspensão para aumentar o volume total para 50 mililitros. Divida isso em dois tubos de 50 mililitros, cada um contendo 25 mililitros de suspensão celular. Retardando e subjacente suavemente as células em cada tubo com 10 mililitros de um meio de centrifugação de densidade, como Ficoll.

Gire a 1200 vezes g por 20 minutos sem interrupção. Após a centrifugação, remova cuidadosamente a interface de cada tubo e transfira-a para dois tubos separados de 50 mililitros. Aumente o volume de cada tubo de interface para 50 mililitros com PBS.

Em seguida, centrifugue a 300 vezes g por sete a 10 minutos. Combine e lave os pellets celulares três vezes com 50 mililitros de PBS contendo dois por cento de FBS, girando a 300 vezes g por sete a 10 minutos de cada vez. Após a centrifugação final, suspenda novamente o pellet em 50 mililitros de mídia RPMI mais 10% de FBS.

Conte as células usando um hemocitômetro. Em seguida, classifique as células CD34 positivas imediatamente usando um kit de classificação CD34 de acordo com o protocolo do fabricante e salve a fração CD34 positiva e CD34 negativa. Despeje os pedaços de timo e o meio do frasco em um prato de 60 milímetros.

Resfrie algumas pontas de pipeta de deslocamento positivo colocando-as em tubos abertos com tampa de rosca estéril de 1,5 mililitro no gelo. Além disso, coloque os pellets de células e um volume de mistura de proteínas gelatinosas, como matrigel, no gelo. Anestesiar os camundongos receptores com um anestésico injetável de acordo com um protocolo animal aprovado.

Verifique o nível de anestesia do mouse apertando uma pata. A ausência de reação ao pinçamento indica um plano cirúrgico de anestesia. Raspe o lado esquerdo de cada rato do quadril ao ombro entre o centro das costas e o estômago.

Injete subcutaneamente seis miligramas por quilograma de carprofeno diluído no ombro ou triângulo inguinal do animal. Lave a cânula do trocarte com PBS em um prato de 60 milímetros. Usando uma pinça curva romba, coloque um pedaço de timo da antena de 60 milímetros dentro da abertura da cânula e, em seguida, puxe o trocarte para aspirar o tecido para dentro da cânula.

Em seguida, use uma pipeta de deslocamento positivo e uma ponta gelada para adicionar cinco microlitros de mistura de proteína gelatinosa fria no tubo com o pellet celular. E mexa suavemente para gerar a suspensão celular. Pipete a suspensão celular na abertura da cânula e puxe lentamente o trocarte para carregar a agulha.

Limpe a área raspada do camundongo com iodo de povidona seguido de isopropenil três vezes. Determine o ponto mais escuro sob a pele que indica a localização do baço. O rim é aproximadamente cinco milímetros dorsal ao baço.

Depois de garantir um nível adequado de anestesia pela ausência de reação do beliscão da pata, use uma pinça curva para levantar a pele e use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão de 15 milímetros na pele paralela ao baço. Em seguida, faça um corte semelhante na camada de peritônio abaixo. Nos machos, o rim é facilmente visível, portanto, extrudado simplesmente pressionando o abdômen.

Apoie o rim com um hemostático ou um par de pinças curvas rombas. Nas mulheres, os ovários tendem a bloquear o rim de fácil extração. Usando um hemostático, pegue o ovário e exponha cuidadosamente o rim.

Use uma pinça com ponta de agulha para arrancar um pequeno orifício na extremidade posterior da cápsula renal. Deslize o trocarte neste orifício e ao longo do rim até que a abertura da cânula esteja completamente coberta pela cápsula renal. Expulse suavemente o tecido sob a cápsula renal e puxe o trocarte de volta para fora.

Use a pinça curva para garantir que o pedaço de timo não saia com a agulha. Em seguida, levante o peritônio com a pinça e use suavemente o hemostático para empurrar o rim de volta ao lugar. Amarre um ponto com nó duplo com sutura cirúrgica no peritônio.

Coloque também dois clipes de ferida Autoclips para fechar a pele. Agora misture as células CD34 positivas transduzidas e aspire 0,5 vezes 10 para as seis células em um volume de 100 microlitros em uma seringa de insulina. Injete essas células no camundongo por meio de injeção de veia retroorbital.

Após a injeção, esfregue uma pequena gota de lubrificante ocular em cada olho e coloque o mouse de lado em uma gaiola. Depois de implantar todos os camundongos, confirme se os animais recuperaram a consciência e estão ambulatoriais antes de devolvê-los à sala de alojamento. Os camundongos foram sacrificados 10 semanas após a cirurgia e sangue, baço, timo e medula óssea foram colhidos.

As células resultantes foram coradas com anticorpos anti-CD45 humano e anti-CD4 humano e analisadas por citometria de fluxo. Como visto aqui, as células modificadas do receptor de antígeno quimérico CD4 podem ser detectadas em vários tecidos linfóides por citometria de fluxo. As células modificadas do receptor de antígeno quimérico CD4 podem se diferenciar em múltiplas linhagens.

Aqui, esplenócitos de camundongos modificados com receptor de antígeno quimérico CD4 foram colhidos e corados para marcadores de células T e B. As células negativas para marcadores de células T e B foram positivas para marcadores de monócitos e macrófagos e para células natural killer. Esplenócitos de camundongos receptores de antígenos quiméricos CD4 infectados pelo HIV foram estimulados com células T um infectadas ou não infectadas e sua produção intracelular de citocinas é mostrada.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir camundongos BLT humanizados modificados com receptores de antígenos quiméricos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 48 horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar em um ritmo constante e prestar muita atenção ao estado do mouse que está sendo operado.

Para iniciantes, é importante praticar cirurgia e injeções oculares antes de trabalhar com tecidos e células-tronco que são mais preciosos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do HIV e outras doenças infecciosas explorarem a patogênese da doença e terapias imunológicas no modelo de camundongo humanizado.