Name: De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprenda a construir um modelo murino humanizado BLT com imunidade engenhada contra HIV usando células-tronco CD34+. Este método permite testes pré-clínicos de terapias genéticas celulares.

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Gostaríamos de agradecer à Sra. Jessica Selander por fornecer assistente artística na confecção de nossas figuras. Este trabalho foi financiado por doações do NIAID / NIH, concessão nº. RO1AI078806, o Centro de Pesquisa da AIDS da UCLA (CFAR), concessão nº. P30AI28697, o Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia, concessão nº. TR4-06845, Federação Americana para Pesquisa da AIDS (amfAR), concessão nº. # 108929-54-RGRL e o Programa e Iniciativas de Pesquisa Multi-campus da UC, Centro da Califórnia para Descoberta de Medicamentos Antivirais (CCADD)

<ol><li>Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLT+humanized+mice+as+a+small+animal+model+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection.</a> Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).</li>
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<li>Zhen, A., Kamata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+Immunity+Derived+From+Chimeric+Antigen+Receptor-engineered+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells.</a> Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).</li>
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<li>Caskey, M., Klein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viraemia+suppressed+in+HIV-1-infected+humans+by+broadly+neutralizing+antibody+3BNC117%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117.</a> Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).</li>
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<li>Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+immune+system+in+immunodeficient+mice+through+combined+human+fetal+thymus%2Fliver+and+CD34%2B+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation.</a> Blood. 108 (2), 487-492 (2006).</li>
<li>Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li>
<li>Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+for+immune+system+investigation%3A+progress%2C+promise+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges.</a> Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).</li>
<li>Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+BLT+humanized+mouse+as+a+stem+cell+based+gene+therapy+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181(2012).</li>
<li>De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+six+colors%3A+a+new+era+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond six colors: a new era in flow cytometry.</a> Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).</li>
<li>Shimizu, S., Hong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+short+hairpin+RNA+potently+down-regulates+CCR5+expression+in+systemic+lymphoid+organs+in+the+hu-BLT+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model.</a> Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).</li>
<li>Denton, P. W., Olesen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+HIV+latency+in+humanized+BLT+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Generation of HIV latency in humanized BLT mice.</a> Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).</li>
<li>Zhou, J., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies+formation+and+differentiation+from+mouse+embryonic+stem+cells+in+collagen%2FMatrigel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds.</a> Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).</li>
<li>Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Exogenous+T-cell+Receptors+Into+Human+Hematopoietic+Progenitors+Results+in+Exclusion+of+Endogenous+T-cell+Receptor+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression.</a> Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).</li>
<li>Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+humanized+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Current advances in humanized mouse models.</a> Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).</li>
<li>Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypogammaglobulinemia+in+BLT+humanized+mice--an+animal+model+of+primary+antibody+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice--an animal model of primary antibody deficiency.</a> PloS one. 9 (10), e108663(2014).</li>
<li>McCune, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+the+SCID-hu+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development and applications of the SCID-hu mouse model.</a> Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).</li>
<li>Srivastava, S., Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+CAR-T+Cells%3A+Design+Concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Engineering CAR-T Cells: Design Concepts.</a> Trends in immunology. 36 (8), (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Com CAR e baseado em HSC ganhando impulso imunidade projetado para os estudos clínicos, é importante ter um modelo animal adequado para examinar de perto a diferenciação e função destas células manipuladas. Neste protocolo, descrevemos os métodos para a construção e teste de camundongos humanizados com células-tronco geneticamente modificados projetados contra o HIV. É importante ter a transdução eficiente de células estaminais, antes do transplante. No entanto, devido à capacidade de células T a proliferar no reconheci...

Apesar do sucesso da terapia anti-retroviral combinada, a infecção por HIV é ainda uma doença ao longo da vida. A resposta imune celular contra o HIV desempenha um papel muito importante no controlo da replicação do HIV. Os recentes avanços na manipulação de células-tronco tem permitido para o rápido desenvolvimento da terapia genética abordagens para HIV tratamento 1-3. Como resultado, é importante dispor de um modelo animal apropriado que permita estudo in vivo da eficácia de terapias à base de células contra o HIV. Trabalhando com HIV em modelos animais é complicada pelo facto de o vírus infecta apenas células humanas. Para contornar essa limitação, os cientistas recorreram ao uso de modelos de doenças como o vírus Simian Immunodeficiency (SIV) em macacos Rhesus 4,5. Infelizmente, há grandes limitações neste modelo devido às diferenças inerentes entre as espécies e as diferenças entre SIV e HIV. Além disso, apenas as instalações altamente especializados são capable de apoiar o trabalho com primatas não-humanos e cada macaque requer um grande investimento. Assim, existe uma necessidade premente de um modelo que utiliza o sistema imunitário humano, que seja susceptível a infecção por HIV / patogénese, e é financeiramente menos proibitivo. O não-obesos diabéticos (NOD) -severe imunodeficientes combinados (SCID) de cadeia knockout gamma -Common (c γ - / -) (ou NSG) Blood / Fígado / Thymus (BLT) modelo de rato humanizado é cada vez mais provado ser uma ferramenta importante para estudar a infecção pelo HIV. Por implantação de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) e timo fetal, os ratinhos são capazes de recapitular o desenvolvimento e um sistema imune humano 1-3. Um tipo de terapia genética baseada em células estaminais envolve &#39;reorientação das células T periféricas de alvo do VIH através da reprogramação de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) de se diferenciar em células T específicas para o antigénio. Nós temos mostrado previamente que HSCs de engenharia com um clonado anti-HIV re específica molecular das células TCeptor (TCR) contra o epitopo SL9 (aminoácidos 77-85; SLYNTVATL) do HIV-1 Gag pode redireccionar células estaminais em células T maduras formando que suprimem a replicação do HIV no modelo de ratinho humanizado BLT NSG-6. A advertência do uso de um TCR clonado molecular é de que seja limitado a um subtipo específico de antigénio de leucócitos humanos (HLA) que vai limitar a aplicação desta terapia. receptores de antigénios quiméricos (CAR), por outro lado, pode ser universalmente aplicado para todos os subtipos de HLA. Os estudos iniciais foram realizados utilizando um CARRO construído com os domínios extracelular e transmembranar de CD4 humano fundidos com o domínio intracelular de ζ CD3 sinalização (denominado a CD4ζCAR). CD4ζCAR expressa em células T CD8 podem reconhecer do envelope de HIV e desencadear uma resposta de células T citotóxicas que é semelhante à que mediada por um receptor de células T 7. Nós demonstramos recentemente que hsc humanas podem ser modificados com CD4ζCAR, que pode então diferenciam-se em múltiplos Li hematopoiéticasneages, incluindo células T funcionais capazes de suprimir a replicação do HIV no modelo de ratinho humanizado 8. Com o rápido avanço em terapias de receptores de antigénios quiméricos para o cancro 9, e a caracterização permanente de anticorpos neutralizantes amplos 10-12 potentes contra o HIV que permitem a construção de veículos de anticorpo de cadeia simples, é perceptível que muitas novas construções de candidatos, além de CD4ζCAR , irão ser gerados e testados para a terapia genética baseada em células estaminais de doenças do HIV e outras doenças. Além disso, o modelo de rato NSG-BLT humanizado contendo estes carros antígeno-específicas também pode fornecer uma ferramenta útil para examinar de perto as respostas das células T humanas in vivo. Importante, a nossa protocolo difere dos métodos descritos anteriormente para a construção de murganhos humanizado de BLT 13-15 em que a mistura proteica em HSCs gelatinosa é usado em lugar de troncos de fígado fetal 16. Este protocolo descreve: 1) construção de humanicamundongos BLT zed projetados com CD4ζCAR; e 2) a caracterização da diferenciação das células geneticamente modificadas; e 3) a caracterização da funcionalidade das células geneticamente modificadas.

<table><tbody><tr><td>Kit de microesferas CD34</td><td>Miltenyi</td><td>130-046-702</td><td>Para classificar células progenitoras humanas CD34+</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Wako</td><td>302-14681</td><td>Para congelar células</td></tr><tr><td>QIAamp Kit de RNA Viral&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>Para medir a carga viral no soro</td></tr><tr><td>MACSQuant Flow Cytometer</td><td>Miltenyi</td><td></td><td>Para análise de fluxo</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&trade;</td><td>BD biosciences</td><td></td><td>Para análise de fluxo</td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Sigma</td><td>H6254-500MG&nbsp;</td><td>Para digestão de tecidos</td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Worthington</td><td>LS002006&nbsp;</td><td>para digestão de tecidos</td></tr><tr><td>Tecnologia Collagenase</td><td>Life</td><td>17104-019&nbsp;</td><td>para digestão de tecidos</td></tr><tr><td>CFX Sistema de detecção de PCR em tempo real</td><td>Biorad</td><td></td><td>Para medir a carga viral e a expressão gênica</td></tr><tr><td>Camundongos, cepa NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>Para construir os camundongos humanizados</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina (Pen Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td>Para cultivar células</td></tr><tr><td>Piperacilina/tazobactam</td><td>Pfizer</td><td>Zosyn</td><td>Anti-fúngico</td></tr><tr><td>Anfotericina B (Fungizone antimicótico)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290-018</td><td>Anti-fúngico</td></tr><tr><td>Clipes de Ferida Autoclip, 9 mm - 1.000 unidades</td><td>Becton Dickinson</td><td>427631&nbsp;</td><td>Para cirurgia</td></tr><tr><td>Batas Cirúrgicas Aurora Poli-Reforçadas Estéreis, 30 por caso&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Medline</td><td>DYNJP2707&nbsp;</td><td>Para cirurgia</td></tr><tr><td>Suturas, 4-0, vicryl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Owens and Minor</td><td>23000J304H&nbsp; &nbsp;</td><td>Para cirurgia</td></tr><tr><td>Almofadas de preparação de álcool&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Owens e Minor</td><td>3583006818</td><td>Para cirurgia</td></tr><tr><td>Luvas, cirúrgicas, 6 1/2</td><td>Owens e Minor</td><td>4075711102</td><td>Para cirurgia</td></tr><tr><td>Yssel' s Meio de Células T Sem</td><td>Soro Gemini Bio-products</td><td>400-102</td><td>Para transdução de células CD34+</td></tr><tr><td>Albumina Sérica Humana&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9511</td><td>para transdução de células CD34 +</td></tr></tbody></table>

de células-tronco baseado imunidade engineered contra infecção por hiv no modelo humanizado mouse

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

Com o rápido desenvolvimento de terapias baseadas em genes de células estaminais contra o HIV, não é requisito para pressionar um modelo animal para estudar a diferenciação hematopoiética e a função imunológica das células geneticamente modificadas. A medula humanizado / fígado / timo (BLT) modelo do rato permite a total reconstituição de um sistema imune humano na periferia, que inclui células T, células B, células NK e monócitos. O implante de timo humano também permite a selecção tímica de células T em tecido tímico autólogo. Em adição ao estudo da infecção por HIV, o modelo fica como uma ferramenta poderosa para estudar diferenciação, desenvolvimento e funcionalidade de células derivadas de células estaminais hematopoiéticas (HSCs). Aqui destacamos a construção de humanizada não-obesos diabéticos (NOD) -severe imunodeficientes combinados (SCID) de cadeia knockout gamma -Common (c γ - / -) ratos -Bone de medula / Fígado / Thymus (NSG-BLT) com HSCs transduzidas com o receptor do antigénio quimérico de CD4 (CD4CAR)vetor lentivírus. Nós mostramos que o CD4CAR HSCs podem diferenciar com sucesso em múltiplas linhagens e têm actividade anti-HIV. O objetivo do estudo é demonstrar a utilização do modelo de rato NSG-BLT como um modelo in vivo para a imunidade projetados contra o HIV. Vale a pena notar que, devido lentivírus e tecido humano é usado, as experiências e cirurgias devem ser realizadas em uma cabine de segurança biológica Classe II em um Nível de Biossegurança 2 (BSL2) com precauções especiais (BSL2 +) instalações.

A Figura 1 mostra um esboço da construção de ratinhos humanizados BLT com células estaminais modificado. 10 semanas após a cirurgia de implante, os ratinhos foram sacrificados para avaliar a diferenciação e desenvolvimento de células do gene modificado. Como mostrado na Figura 2, vários tecidos linfóides (sangue, baço, timo e medula óssea) foram colhidas a partir de um rato que foi modificado com CD4ζCAR. O CD4ζCAR utilizados no presente protocolo contém...

Este protocolo descreve os métodos na construção de um modelo humanizado de camundongo medula óssea/fígado/timo com imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

O objetivo geral deste procedimento é criar um camundongo humanizado modificado com receptor de antígeno quimérico. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de HIV e imunologia, especialmente em relação à avaliação da eficácia da imunidade projetada com base em células-tronco contra infecção por HIV e outras infecções crônicas e neoplasias, como os mecanismos de falha imunológica e formas de potencializar o sistema imunológico e desenvolver terapias para criar uma imunidade antiviral ou antitumoral mais eficaz.A principal vantagem desta técnica é que ela é capaz de realizar uma grande quantidade de manipulações experimentais. O modelo de camundongos BLT humanizados mimetiza a imunidade humana e, neste caso, permite testes pré-clínicos de terapias gênicas baseadas em células contra a infecção pelo HIV. Demonstrarão o procedimento Valerie Rezek e Brianna Lam, que são técnicas do meu laboratório.Inicie utilizando bisturis para cortar o timo em pequenos pedaços de aproximadamente um milímetro cúbico em uma placa contendo meio RPMI suplementado. Em seguida, use pinças curvas rombudas para colocar cada pedaço individual do timo em um único poço de uma placa de 96 poços. Adicione 100–200 microlitros de meio a todos os poços para que o tecido não seque.Visualize o tecido ao microscópio para eliminar qualquer tecido que possa não ser timo ou que tenha tecido conjuntivo aderido. Em seguida, remova os fragmentos confirmados de timo e reúna-os em um frasco de cultura celular T25. Adicione sete mililitros de meio RPMI suplementado com antibiótico ao frasco e agite suavemente para misturar.Em seguida, coloque o frasco no incubador de cultura de tecidos. Esta etapa evita a contaminação bacteriana do tecido. Inicie o isolamento de HSCs positivas para CD34 a partir do fígado fetal utilizando dois bisturis para cortar o fígado em pequenos pedaços de aproximadamente três milímetros cúbicos em uma placa contendo IMDM.Remova e descarte qualquer tecido conjuntivo branco. Em seguida, utilize uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha romba de calibre 16 para retirar os pedaços de fígado e o meio e transfira para um tubo cônico de 50 mililitros. Aspire e expulse suavemente por mais cinco a sete vezes para homogeneizar completamente o tecido.Após preparar 10 mililitros de meio IMDM, suplemente-o com colagenase, hialuronidase, antibióticos, DNase e antifúngico. Passe o meio por um filtro de 0,22 mícron. Em seguida, adicione o meio filtrado à suspensão de fígado.Após tampar o tubo cônico de 50 mililitros contendo a suspensão hepática, feche firmemente com filme autoadesivo, como parafilm, para evitar vazamentos. Incube em rotação no incubador a 37 graus celsius por 90 minutos. Após a incubação, filtre a suspensão celular digerida através de uma peneira celular de 100 mícrons para um tubo de 50 mililitros novo.Adicione PBS à suspensão para completar o volume total até 50 mililitros. Divida esta suspensão em dois tubos de 50 mililitros, cada um contendo 25 mililitros de suspensão celular. Lentamente e com cuidado, sobrepõe-se às células em cada tubo 10 mililitros de um meio de centrifugação de densidade, como o Ficoll.Centrifugar a 1200 vezes g durante 20 minutos sem interrupção. Após a centrifugação, remover cuidadosamente a interface de cada tubo e transferi-la para dois tubos separados de 50 mililitros. Completar o volume de cada tubo de interface até 50 mililitros com PBS.Em seguida, centrifugue a 300 × g por sete a 10 minutos. Combine e lave os pellets celulares três vezes com 50 mililitros de PBS contendo 2% de FBS, centrifugando a 300 × g por sete a 10 minutos a cada vez. Após a última centrifugação, re-suspenda o pellet em 50 mililitros de meio RPMI acrescido de 10% de FBS.Conte as células utilizando um hemocitômetro. Em seguida, separe imediatamente as células positivas para CD34 utilizando um kit de separação para CD34 conforme o protocolo do fabricante, e conserve tanto a fração positiva quanto a negativa para CD34. Despeje os fragmentos de timo e o meio do frasco em uma placa de 60 milímetros.Resfrie algumas ponteiras de pipeta de deslocamento positivo colocando-as em tubos estéreis de 1,5 mililitro com tampa de rosca abertos sobre gelo. Além disso, coloque os pellets celulares e um volume de mistura proteica gelatinosa, como matrigel, sobre gelo. Anestesie os camundongos receptores com um anestésico injetável de acordo com um protocolo animal aprovado.Verifique o nível de anestesia do camundongo apertando uma pata. A ausência de reação ao aperto indica um plano cirúrgico de anestesia. Depile o lado esquerdo de cada camundongo, da anca ao ombro, entre o centro das costas e o abdômen.Administre subcutaneamente seis miligramas por quilograma de Carprofeno diluído na região do ombro ou do triângulo inguinal do animal. Lave a cânula do trocarte com PBS em uma placa de 60 milímetros. Usando um par de pinças curvas rombas, coloque um pedaço de timo da placa de 60 milímetros logo dentro da abertura da cânula, em seguida puxe o trocarte para trás para aspirar o tecido para dentro da cânula.Em seguida, utilize uma pipeta de deslocamento positivo e uma ponteira gelada para adicionar cinco microlitros da mistura proteica gelatinosa fria ao tubo com o pellet celular. E agite suavemente para gerar a suspensão celular. Pipete a suspensão celular na abertura da cânula e puxe lentamente o trocarte para trás a fim de carregar a agulha.Passe um cotonete com iodopovidona na área depilada do camundongo, seguido por isopropenol, três vezes. Determine o ponto mais escuro sob a pele, o que indica a localização do baço. O rim está localizado aproximadamente cinco milímetros dorsal ao baço.Após garantir um nível adequado de anestesia pela ausência de reação ao aperto na pata, use pin&ccedil;as curvas para levantar a pele e tesouras cir&uacute;rgicas para fazer uma incis&atilde;o de 15 mil&iacute;metros na pele paralela ao ba&ccedil;o. Em seguida, fa&ccedil;a um corte semelhante na camada peritoneal abaixo. Em machos, o rim &eacute; facilmente vis&iacute;vel, podendo ser extrudido simplesmente ao pressionar o abd&ocirc;men.Suporte o rim com uma pinça hemostática ou um par de pinças curvas rombas. Nas fêmeas, os ovários tendem a bloquear a extração fácil do rim. Usando uma pinça hemostática, segure o ovário e exponha cuidadosamente o rim.Use uma pinça com ponta de agulha para abrir um pequeno orifício na extremidade posterior da cápsula renal. Insira o trocarte nesse orifício e deslize-o ao longo do rim até que a abertura da cânula fique completamente coberta pela cápsula renal. Suavemente, extrude o tecido sob a cápsula renal e retire o trocarte.Use a pinça curva para garantir que o fragmento de timo não saia novamente com a agulha. Em seguida, levante o peritônio com a pinça e use suavemente o hemostato para empurrar o rim de volta ao seu lugar. Dê um ponto com nó duplo usando fio cirúrgico no peritônio.Coloque também dois clipes Autoclips para fechar a pele. Agora, misture as células positivas para CD34 transduzidas e aspire 0,5 vezes 10 à sexta potência de células em um volume de 100 microlitros em uma seringa de insulina. Injete essas células no camundongo por injeção na veia retro-orbital.Após a injeção, passe uma pequena gota de lubrificante ocular em cada olho e coloque o camundongo de lado novamente na gaiola. Após implantar todos os camundongos, confirme que os animais recuperaram a consciência e estão ambulando antes de devolvê-los à sala de alojamento. Os camundongos foram sacrificados 10 semanas após a cirurgia e o sangue, baço, timo e medula óssea foram coletados.As células resultantes foram coradas com anticorpos anti-CD45 humano e anti-CD4 humano e analisadas por citometria de fluxo. Como visto aqui, as células modificadas com receptor de antígeno quimérico CD4 podem ser detectadas em múltiplos tecidos linfoides por citometria de fluxo. As células modificadas com receptor de antígeno quimérico CD4 podem se diferenciar em múltiplas linhagens.Aqui, esplenócitos de camundongos modificados com receptor de antígeno quimérico CD4 foram coletados e marcados com marcadores de linfócitos T e B. As células negativas para marcadores de linfócitos T e B foram positivas para marcadores de monócitos e macrófagos e para células natural killer. Esplenócitos de camundongos infectados com HIV que expressam o receptor de antígeno quimérico CD4 foram estimulados com células T infectadas ou não infectadas pelo HIV, e sua produção intracelular de citocina é mostrada.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como construir camundongos BLT humanizados modificados com receptores de antígeno quiméricos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 48 horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de trabalhar em um ritmo constante e prestar muita atenção ao estado do camundongo que está sendo operado.Para iniciantes, é importante praticar cirurgias e injeções oculares antes de trabalhar com tecidos e células-tronco que são mais valiosos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de HIV e outras doenças infecciosas explorarem a patogênese da doença e terapias baseadas no sistema imunológico no modelo de camundongo humanizado.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

A geração e caracterização de células T específicas de tumor utilizando ratinhos humanizados é descrita aqui. Tecido do timo humano e geneticamente modificadas de células-tronco hematopoiéticas são transplantadas em ratos imunocomprometidos. Isto resulta na reconstituição de um sistema imune humano permitindo engenharia para exame in vivo de anticorpos anti-tumorais respostas imunes.

Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar camundongos do sistema imunológico humano (HIS). As células-tronco hematopoiéticas CD34+ (HSCs) são isoladas de células do revestimento leucocitário do sangue do cordão umbilical humano usando esferas magnéticas revestidas com anticorpos. As HSCs CD34+ são expandidas em meio de crescimento enriquecido com citocinas e criopreservadas. Finalmente, os HSCs descongelados são injetados em um filhote de camundongo imunodeficiente para estabelecer o modelo...

Isolando células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical para gerar camundongos do sistema imunológico humano

Este vídeo demonstra um método para gerar um modelo de camundongo humanizado duplo com um sistema imunológico humano e células hepáticas. Envolve o transplante de células hepáticas humanas e células-tronco hematopoiéticas e progenitoras em um camundongo imunodeficiente transgênico por meio de injeção intraesplênica, levando ao enxerto de células hepáticas e ao desenvolvimento de células imunes humanas.

Desenvolvendo um modelo de camundongo humanizado com células hepáticas humanas e células imunológicas

O vídeo demonstra uma técnica para gerar um modelo de camundongo humanizado com imunidade projetada baseada em células-tronco contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV). O tecido do timo fetal humano e as células-tronco hematopoiéticas (HSCs) projetadas são implantados na cápsula renal de um camundongo gravemente imunocomprometido. As HSCs, que expressam receptores de antígenos quiméricos (CARs) contra o HIV, são misturadas em uma mistura de proteínas gelatinosas que promove sua...

Construindo um modelo de camundongo humanizado com imunidade projetada contra o HIV

Este protocolo fornece um método para estabelecer ratos humanizados (hu-NSG) através da injeção de colestase de células estaminais hematopoiéticas em camundongos NSG neonatais condicionada por radiação. O mouse hu-NSG é suscetível à infecção pelo HIV e terapia anti-retroviral combinatória (carrinho) e serve como um modelo fisiopatológico apropriado para investigações de latência e a replicação do HIV.

Humanizado NOD/SCID/IL2rγnula (hu-NSG) Mouse modelo para estudos de latência e a replicação do HIV

Este protocolo fornece um método confiável para estabelecer camundongos humanizados com o sistema imunológico humano e células hepáticas. Os ratos imunodeficientes reconstituídos duplos conseguidos através da injeção pseudoaneurysms de hepatócitos humanos e de pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são suscetíveis à infecção do vírus-1 da imunodeficiência humana e recapitulam dano de fígado como observado em Doentes infectados pelo VIH.

Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado

Aqui estão três abordagens experimentais para estudar a dinâmica da infecção pelo HIV em camundongos humanizados. O primeiro permite o estudo de eventos de infecção crônica, enquanto os dois últimos permitem o estudo de eventos agudos após infecção primária ou reativação viral.

Infecção por HIV crônica, aguda e reativada em modelos de camundongos imunodeficientes humanizados

Desenvolvemos um protocolo para a geração e avaliação de um modelo de camundongo NOG infectado por vírus humanizado e humano com base no transplante de células-tronco, exposição intravaginal do vírus da imunodeficiência humana e RNA PCR digital de gota digital Quantificação.

Camundongos NOG humanizados para exposição intravaginal ao HIV e tratamento da infecção pelo HIV

Este protocolo descreve um novo método para administrar medicamentos antirretrovirais combinacionais orais que suprimem com sucesso a replicação do RNA do HIV-1 em camundongos humanizados.

Tratamento Antirretroviral Combinacional Oral em Camundongos Humanizados Infectados pelo HIV-1

Este protocolo descreve a geração de camundongos do sistema imunológico humano (HIS) para estudos de imuno-oncologia. Instruções e considerações sobre o uso deste modelo para testes de imunoterápicos humanos em tumores humanos implantados neste modelo são apresentadas com ênfase na caracterização da resposta do sistema imune humano ao tumor.

Testando imunoterápicos contra o câncer em um modelo humanizado de camundongo com tumores humanos

Aprenda a construir um modelo murino humanizado BLT com imunidade engenhada contra HIV usando células-tronco CD34+. Este método permite testes pré-clínicos de terapias genéticas celulares.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

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