Name: Promover 3-D agregação de células FACS purificada epiteliais tímicos com EAK 16-II / EAKIIH6 de auto-montagem Hidrogel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda a promover agregação 3D de células epiteliais tímicas purificadas por FACS usando hidrogel de auto-montagem EAK16-II/EAKIIH6. Este método suporta sobrevivência celular e avança a bioengenharia do timo.

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Este trabalho foi financiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R21 AI113000 (WSM) e R01 AI123392 (YF).

Todos os animais utilizados nos experimentos foram alojados no biotério do Instituto de Pesquisa Allegheny-Singer no âmbito do protocolo revisto e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do / Allegheny Instituto de Pesquisa Cantor Allegheny Health Network. 1. digerindo o Thymus com colagenase <ol><li> Colheita timo. <ol><li> Euthanize camundongos 3-5 semanas de idade C57BL6 / J em um dióxido de carbono (CO 2) da câmara para colher timo. Em detalhe, colocar os murganhos na câmara sob indução de CO 2 durante 3-5 min e confirmar a morte verificando paragem cardíaca ou respiratória. </li><li> Coloque a carcaça em suas costas e molhar o corpo com 70% de etanol. Fazer uma pequena incisão horizontal com uma afiada, tesouras de dissecação retas em seu abdômen através da pele. Puxar a pele em ambas as extremidades (cabeça e pernas) para que ele seja virado do avesso. </li><li> Faça um corte horizontal com as tesouras de dissecação pouco menosa última costela e cortar através do diafragma para os lados. Segurar o processo xifóide com uma pinça e corte a meio das nervuras procedendo-se em ambos os lados. Puxar para cima o costelas / esterno de modo a que o timo é claramente visível. Nota: timo situa-se na parte superior do coração, é composto por 2 lóbulos e é de uma cor branca translúcida. </li><li> Usando um fórceps curvos, gentilmente colher e puxe os lóbulos do timo fora do tecido conjuntivo e transferência de solução de lavagem (veja a lista de materiais). </li></ol></li><li> Preparar a solução de digestão por mistura de 9 ml de RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute forma-1640), 0,025 mg / ml de colagenase purificada, HEPES 10 mM [ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico], e 0,2 mg / ml ADNase I em um tubo de centrífuga de 50 ml. Manter a solução de digestão em 37 ° C banho de água até à sua utilização. Nota: A quantidade de solução de digestão preparada é suficiente para timos rato até cinco adulto, que pode ser incubada em conjunto em um 5 ml redonda poliestirenotubo inferior. </li><li> Transferir o timo para um prato de cultura de tecidos de 60 milímetros contendo 5-6 ml de RPMI-1640. </li><li> Dissecar o timo com 28 G agulha de insulina seringa em pedaços pequenos (cerca de 1 mm 3 quadrado) para permitir que os linfócitos fluir para fora. </li><li> Lavar as peças do timo com meio RPMI-1640 que se encontra na placa de Petri com uma pipeta de Pasteur de vidro. Incline o prato e deixar que os fragmentos do timo para liquidar o fundo. Lentamente Aspirar e desprezar o sobrenadante RPMI-1640 usando uma pipeta de vidro. Repetir esta etapa de lavagem com 5-6 ml de RPMI-1640 para 4-5 vezes com uma pipeta de vidro, até a solução é menos opaca. Nota: pipetas de vidro são recomendados nesta etapa, uma vez que fragmentos de timo tendem a se ater ao plástico, resultando em perda excessiva de tecidos do timo. Para o resto do procedimento, utilizam pipetas de plástico. </li><li> Após a lavagem final, desprezar o sobrenadante tal como descrito no passo 1.5. Adicionar solução de digestão 3 ml e transferir as peças timo e a solução em 5 ml de p de fundo redondotubo olystyrene. </li><li> Colocar o tubo num rotor tubo e incubar a 37 ° C durante 6 min a uma velocidade de rotação de 12 rpm. </li><li> Após a incubação, os fragmentos de timo deixar assentar no fundo do tubo pela gravidade. Recolhe-se o sobrenadante com uma pipeta de Pasteur e transferir para um tubo de centrífuga de 50 ml com 10 ml de solução de lavagem. Centrifuga-se a 300 xg durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante e ressuspender as células em solução de lavagem de 10 ml. Manter em gelo. </li><li> Repita os passos 1,6-1,8 duas vezes sobre os fragmentos do timo nos 5 mL de tubo de poliestireno de fundo redondo. A piscina do sobrenadante no mesmo tubo de 50 ml. Nota: A centrifugação não é necessário que a segunda e a terceira lavagem. </li><li> Após a digestão final, pipeta cima e para baixo com uma pipeta sorológica 2 ml de plástico para quebrar quaisquer fragmentos restantes no tubo e transferência para o tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Centrifugar o tubo de 50 ml a 300 xg durante 5 min, aspirar o sobrenadante, ressuspender em 10 ml de lavagem da-manhãr e filtrar através de 100 mm filtro celular. Manter em gelo. </li></ol> 2. Enriquecimento de TEC com gradiente de densidade descontínua <ol><li> Preparar a solução de gradiente de densidade de 21% por mistura de 2,4 ml de meio de gradiente de densidade (60% w / v de iodixanol em água) e 9,6 ml de solução de lavagem. </li><li> Centrifugar as células dissociadas do timo no tubo de 50 ml de recolha a partir do passo 1.11 a 300 xg durante 5 min e ressuspender em tampão 2,5 ml de lavagem. </li><li> Adicionar meio de 20 ml de RPMI-1640 à suspensão de células. </li><li> Encha 12 ml de solução de gradiente de densidade de 21% em 10 ml pipeta sorológica com uma pipeta eletrônico. Colocar a ponta da pipeta serológica na parte inferior das células de 50 ml tubo de centrífuga contendo, e permitir que a solução do gradiente de densidade para drenar para a parte inferior do tubo por meio de gravidade. <ol><li> Suavemente expelir a solução com gradiente de densidade a partir da pipeta para terminar a geração de as duas camadas de densidades diferentes. </li></ol></li><li> Centrifugar a 600 xg foR 20 min a RT num rotor oscilante de balde. Definir a taxa de desaceleração no nível mais lento. </li><li> Transferir a camada superior e a interface para um novo tubo de 50 ml. Nota: A maior parte das TEC são retidos na interface. Linfócitos irá precipitar para o fundo do tubo após a centrifugação. Se estas células estão a ser usados ​​para outros fins, lavar o sedimento com 20 ml de solução de lavagem por três vezes. Ressuspender as células em 10 ml de tampão de lavagem. </li><li> Adicionar a solução de lavagem até 40 mL ao tubo no passo 2.6 e centrifugar a 400 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Para remover o sobrenadante, aspirado com uma pipeta. </li><li> Repetir a lavagem e a aspiração mais 2 vezes como descrito na etapa 2.7. </li><li> Ressuspender em 2 ml de solução de lavagem e contar as células com um hemocitómetro. </li></ol> 3. TEC de isolamento com FACS <ol><li> Ajustar as células do passo 2.9, na concentração de 1x10 6 células / 100 ul com solução de lavagem e transferênciaas células para um tubo de 5 ml de fundo redondo (polipropileno ou poliestireno, como recomendado pelas instruções do classificador de fluxo). </li><li> Adicionar IgG anti-receptor de Fc de 2 ul por 1x10 6 células e incubar a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Adicionar anti-CD45 (diluição 1: 150, 10 ul por cada amostra) e anti-EpCAM: anticorpos (uma diluição de 100, 10 ul por cada amostra) e incubar a 4 ° C durante mais de 20 min. </li><li> Lavam-se as células com solução de lavagem de 2 ml e centrifugar a 400 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta. </li><li> Ressuspender as células em uma solução salina tamponada com fosfato mL 1x (PBS). </li><li> Filtrar através de filtro de 100 um. </li><li> Aplicar as células para o instrumento de triagem. Selecione o linfócito e da população TEC excluindo as menores células na luz dispersa-lateral (SSC) / light forward-espalhados (FSC) painel (células mortas), então portão à população selecionada para CD45- EpCAM + para classificar 13. </li></ol> 4. Generation da TEC / EAK Agregados Nota: Execute preparação de reagentes e as etapas que envolvem células misturando sob a capa laminar. <ol><li> Preparar complexos de adaptador de pA / L por mistura de 4 ul de anti-His-tag IgG, 8 ul de anti-EpCAM IgG e 2,6 ul de pA / L em 1,5 ml de um tubo de microcentrífuga estéril, e incubar à TA durante 5 min. </li><li> Ajustar as TEC ordenados do passo 3.7 a 5x10 4 culas / ml com solução de lavagem, e pipeta de 100 uL para um poço de uma evaporação baixa, de 96 poços de fundo redondo com placa de cultura de tecido. Adicionar 14.6 ul de adaptadores complexos pA / L para as células. Colocar a placa sobre uma plataforma oscilante durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Lavar uma vez com 200 ul de solução de lavagem. Centrifugar a placa a 400 x g durante 6 min. Descartar o sobrenadante com uma micropipeta. </li><li> Lavar uma vez com solução de sacarose de 200 jil de 10%. Centrifugar a 400 xg durante 6 minutos. Descartar o sobrenadante com uma micropipeta. </li><li> Ressuspender as células em 30 ul de 10% ssolução de sacarose terile por poço. </li><li> Adicionar 10 ul de EAKIIH6 (7,5 mg / ml) e incubar durante 5 min à TA. </li><li> Adicionar 20 ul de EAK16-II (10 mg / ml) para a mistura do TCE. </li><li> Adicionar 100 ul de meio completo para o sistema para iniciar a gelificação. Colocar a placa num agitador de plataforma durante 15-20 min à temperatura ambiente. </li><li> Colocar a placa na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. Após 2-4 h, adicionar mais 100 ul de meio completo. </li><li> Mudança de meio todos os outros dias até à sua utilização. <ol><li> Aspirar 100 ul do meio a partir da superfície sem perturbar o gel utilizando uma micropipeta e suavemente adicionar 100 uL de meio de pré-aquecido, colocando a ponta da pipeta para a parede do poço. </li></ol></li></ol> 5. Caracterização do TCE / EAK Agregados <ol><li> Para examinar a função dos agregados TCE / EAK in vivo, recolher o TCE / EAK hidrogel após a cultura D / N e transplante sob a cápsula renal de um nu atímicosrato, usando anteriormente procedimento descrito 11,14. </li><li> Acompanhar o desenvolvimento de células T na periferia colhendo amostras de sangue 50-100 ul para dentro do tubo de recolha de sangue com EDTA do ratinhos nus 4-6 semanas após o transplante e mancha com um coquetel de anti-CD4, -CD8, -CD45 e -CD3 anticorpos 12. </li><li> Analisar as percentagens de linfócitos T nos leucócitos do sangue periférico com citometria de fluxo (FCM), usando software de análise de uma única célula 12. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Enquanto TEC são a população predominante do estroma tímico e desempenham papéis essenciais para a estrutura e a função das glândulas de timo, eles representam apenas cerca de 0,1-0,5% da celularidade do timo total. Eles também são células frágeis como elevadas percentagens de morte celular são ocasionalmente observados após a digestão de colagenase, ou seja, o tratamento de TEC dissociar a partir da matriz extracelular (ECM). Sua raridade (~ 200.000 por timo mouse) e fragilidade tornou uma tarefa desafiadora p...

O timo é o órgão linfóide primário responsável pela geração de uma população diversa de células, T auto-tolerante patógeno-reactivo que é essencial à função do sistema imune adquirida. Ele é um órgão dinâmico onde timócitos em desenvolvimento, emigraram da medula óssea como células de linfócitos progenitoras, migram através da tridimensional (3-D) de matriz semelhante a esponja do estroma tímico, submeter a linhagem de especificação e diferenciação, e, eventualmente, emigrar quanto madura T-células. O êxito deste processo bem programado depende em grande parte da conversa cruzada entre os timócitos migram e as células epiteliais tímicas residenciais (TEC), a população predominante do estroma tímico que são essenciais para o estabelecimento e a manutenção da integridade do microambiente timo. Com base na sua localização anatômica e função original, TEC pode ser dividido em dois subconjuntos: os TEC no córtex (CTECs), que são responsável por selecionando auto-MHC (complexo principal de histocompatibilidade) restringiu as células T (seleção positiva), e os TEC na medula (mTECs) que são essenciais para a eliminação de células T auto-reativas (seleção negativa) 1,2. Muitos fatores (por exemplo, envelhecimento, infecção, irradiação, tratamentos de drogas) pode causar danos irreversíveis ao epitélio do timo, resultando na imunidade adaptativa comprometida. Apesar de numerosas tentativas, restaurando a função do timo tem sido difícil devido à dificuldade em reproduzir o microambiente do timo. Notavelmente, a configuração do timo tridimensional (3-D) é crítico para a sobrevivência e função de TEC, enquanto TEC cultivadas num ambiente de 2-D diminuir rapidamente a expressão de genes críticos para a timopoiese 3,4. EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) e o seu análogo histidinylated C-terminal EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) são de baixo peso molecular, oligopéptidos anfifílicas que são solúveis até o final desionizadaR, mas que são submetidos a gelificação para formar p-fibrilas quando expostos à força iónica mais elevada do que 20 mM de NaCl (concentração normal de sal no fluido corporal humano é de 154 mM). Esta propriedade responsiva ambiental torna-os blocos de construção versáteis para formar estruturas 3D. A His-tag em EAKII-H6 proporciona um mecanismo de encaixe, pelo que os anti-His IgG / Fc-proteína de ligação recombinante A / G (αH6: PA / g) complexos podem servir como um adaptador para ancorar fármacos de proteína e outras biomoléculas ( por exemplo, anticorpos) no composto 5-8 hidrogel. Foi anteriormente demonstrado que as moléculas de IgG marcado com fluorescentes ancoradas no hidrogel pode ser mantida no local de injecção para até 13 dias 9. Além disso, quando os αH6: adaptadores pA / G ancorados com anti-CD4 IgG foram adicionados ao hidrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK), células T CD4 + foram especificamente capturado 10. Utilizando uma técnica semelhante, temos demonstrado recentemente que o 3-D agregação de TEC could ser promovida em EAK hidrogel com complexos de adaptadores que transportam os anticorpos anti-EpCAM específico-TEC (αH6: PA / G: αEpCAM). Quando transplantadas sob as cápsulas dos rins de ratinhos nude, os aglomerados TEC incorporados no hidrogel EAK pode efectivamente suportar o desenvolvimento de células T funcionais in vivo 11,12. Aqui, ilustramos nosso método para purificar rapidamente e eficazmente com TEC de células activadas por fluorescência (FACS) e gerar 3-D agregados TEC com o sistema de EAK hidrogel.

<table><tbody><tr><td>< forte> Isolamento TEC< / forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701 (1 Galão)</td> <td>Etanol 200 Prova, água deionizada</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação, reta</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Graefe, reta</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Graefe, curva</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td> de lavagem <td>1x PBS, 0,1% BSA, 2&nbsp; mM EDTA</td></tr><tr><td>1x PBS (Solução salina tamponada com fosfato)</td> <td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Albumina de soro bovino)</td> <td>Sigma</td><td>A1470-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (ácido etilenodiaminotetracético)</td> <td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td> de digestão <td>9 ml RPMI-1640, 0.025&nbsp; mg/ml Liberase TM Grau de pesquisa, 10&nbsp; mM HEPES, 0,2&nbsp; mg/ml DNaseI</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Grau de Pesquisa</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>referido como "colagenase purificada"</td></tr><tr><td>1&nbsp; M HEPES</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; ml Tubo de centrífuga</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm placa de cultura de tecidos</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>1/2&nbsp; seringa de insulina cc U-100 28&nbsp; 1/2&nbsp; G</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml Tubo de poliestireno de fundo redondo</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml pipeta de vidro</td><td>Fisher Healthcare</td><td>13-678-27E</td><td>Use para enxaguar os fragmentos tímicos. Fragmentos tímicos tendem a grudar na parede com pipetas de plástico.</td></tr><tr><td>Rotador de tubo MACSmix</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>100&nbsp; &micro; m Filtro de células</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente de densidade médio: OptiPrep</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Sorting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml Tubo de fundo redondo</td><td>de polipropileno Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Use como não diluído, 2&nbsp; &micro; l por amostra</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45-PercpCy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-80</td><td>Use a 1:150, 10&nbsp; &micro; l por amostra</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5791-82</td><td>Use a 1:100, 10&nbsp; &micro; l por amostra</td></tr><tr><td>BD Influx</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de célula única</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EAK Gel Assembly</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-His-Tag</td><td>AnaSpec</td><td>29673</td><td>"anti-His-Tag IgG"Anti-His-Tag IgG"</td></tr><tr><td>Purificado anti-rato CD326 (EpCAM)</td><td>BioLegend</td><td>118202</td><td>"anti-EpCAM IgG"</td></tr><tr><td>Proteína recombinante A/G</td><td>Pierce Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; ml Tubos de Safe-Lock, Biopur, Estéril</td><td>Fisher Healthcare</td><td>05-402-24B</td><td>referido como "1.5&nbsp; ml tubo de microcentrífuga "</td></tr><tr><td>96 poços, placa de cultura de tecidos, fundo redondo com tampa de baixa evaporação</td><td>BD Falcon</td><td>353917</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de balanço: Nutator Mixer no.1105</td><td>BD Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% de sacarose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Prepare com água destilada estéril</td></tr><tr><td>EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)</td><td>American Peptide Company& nbsp;</td><td></td><td>sintetizado personalizado, 10&nbsp; mg/ml</td></tr><tr><td>EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)</td><td>American Peptide Company&nbsp;</td><td></td><td>sintetizado personalizado, 7.5&nbsp; mg/ml</td></tr><tr><td>Meio</td><td></td><td></td> completo <td>RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamina, 1% NEAA, 5&nbsp; mM HEPES, 50&nbsp; &micro; M 2-Mercaptoetanol</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Soro Fetal Bovino)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Inativado por calor antes do uso</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200&nbsp; mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (aminoácido não essencial) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; M HEPES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (100x)</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de plataforma: The Belly Dancer</td><td>Stovall Life Sciences Inc.</td><td>modelo: USBDbo</td><td></td></tr></tbody></table>

promover 3-d agregação de células facs purificada epiteliais tímicos com eak 16-ii / eakiih6 de auto-montagem hidrogel

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

A involução do timo, associada ao envelhecimento ou insultos patológicos, resulta em diminuição da produção de células T maduras. Restaurar a função de um timo com insuficiência é crucial para manter uma resposta imune adquirida mediada por células T eficaz contra patógenos invasores. No entanto, a regeneração e revitalização do timo provou ser desafiadora, em grande parte devido às dificuldades de reproduzir o microambiente 3D único do estroma tímico, que é crítico para a sobrevivência e função das células epiteliais tímicas (TECs). Desenvolvemos um novo sistema de hidrogel para promover a formação de agregados TEC, baseado na propriedade de automontagem dos oligopeptídeos anfifílicos EAK16-II e seu análogo histidinilado EAKIIH6. As TECs foram enriquecidas a partir de células tímicas isoladas com gradiente de densidade, classificadas com classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e marcadas com anticorpos anti-molécula de adesão celular epitelial (EpCAM) que foram ancorados, juntamente com anti-His IgGs, nos complexos adaptadores da proteína A / G. A formação de agregados celulares foi promovida pela incubação de TECs com oligopeptídeos EAKIIH6 e EAK16-II e, em seguida, pelo aumento da concentração iônica do meio para iniciar a gelificação. Os agregados TEC incorporados no hidrogel EAK podem efetivamente promover o desenvolvimento de células T funcionais in vivo quando transplantados para camundongos nus atímicos.

Para examinar a eficácia de separação usando o protocolo de gradiente de densidade para enriquecer as células estromais CD45-, células colhidas a partir da interface e as pelotas de linfócitos precipitados foram coradas com anticorpos anti-EpCAM anti-CD45 e. Tanto anti-Ulex europaeus 1 Aglutinina (UEA1) e anticorpos anti-MHC de classe II foram também incluídas no coquetel de coloração para continuar a identificar os subconjuntos CTEC e MTEC. Como mostrado na Figura 1, qu...

Este vídeo demonstra um protocolo para enriquecer células epiteliais tímicas (TECs) com gradiente de densidade para isolamento de FACS. Também mostra o uso de peptídeos EAK16-II/EAKIIH6 para promover a formação de agregados TEC. Os microambientes do hidrogel EAK16-II/EAKIIH6 fornecem a configuração 3-D necessária para manter a sobrevivência e a função dos TECs.

Promover 3-D agregação de células FACS purificada epiteliais tímicos com EAK 16-II / EAKIIH6 de auto-montagem Hidrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o uso do peptídeo EAK 16-II / EAKIIH6 na promoção da agregação de células epiteliais tímicas em uma estrutura tridimensional para apoiar a auto-sobrevivência e função epitelial tímica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da bioengenharia do timo. As principais vantagens dessa técnica é que ela utiliza o peptídeo EAK-16-II/EAKIIH6, promove a agregação de células epiteliais tímicas, é biodegradável e tem potencial para ser usada em injeções.Para colher o timo, comece colocando um camundongo C57 preto 6J de três a cinco semanas de idade na posição supina e molhe o cabelo com etanol a 70%. Usando uma tesoura de dissecação afiada e reta, faça uma pequena incisão horizontal através da pele abdominal. Em seguida, puxe a pele em ambos os lados da incisão para expor a cavidade abdominal.Em seguida, faça um corte horizontal logo abaixo da nervura mais baixa e corte lateralmente até o diafragma. Usando uma pinça, puxe o processo xifóide e corte o meio das costelas ao longo de ambos os lados do peito. Puxe as costelas e o esterno para que o timo fique claramente visível.Em seguida, usando uma pinça curva, retire suavemente os lóbulos do timo do tecido conjuntivo e coloque-os na solução de lavagem. Após o enxágue, transfira o timo para uma placa de cultura de tecidos de 16 mililitros contendo cinco a seis mililitros de RPMI 1640 e use uma agulha de insulina de calibre 28 para dissecar o tecido em pedaços quadrados de aproximadamente um milímetro cúbico. Em seguida, use uma pipeta de pasteur de vidro para enxaguar os fragmentos de tecido com o meio no prato.Em seguida, incline o prato, deixando os fragmentos assentarem no fundo. Remover lentamente o sobrenadante médio por aspiração. Em seguida, repita a lavagem mais quatro a cinco vezes com cinco a seis mililitros de meio fresco de cada vez até que a solução se torne menos opaca.Após a lavagem final, adicione três mililitros de solução de digestão ao prato e transfira os pedaços e a solução de timo para um tubo de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros. Incube os tecidos em um rotador de tubo a 37 graus Celsius por seis minutos a 12 rpm. No final da rotação, deixe os fragmentos assentarem no fundo do tubo e use uma pipeta pasteur para transferir o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de solução de lavagem.Centrifugue o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mililitros de solução de lavagem fresca no gelo. Em seguida, digerir os fragmentos tímicos mais duas vezes no rotador, como acabamos de demonstrar, puxando o sobrenadante no mesmo tubo de 50 mililitros. Após a digestão final, utilizar uma pipeta serológica de plástico de dois mililitros para triturar os fragmentos remanescentes e transferir a agitação dos tecidos para o tubo de 50 mililitros.Gire o tubo para coletar as células e ressuspender o pellet em 10 mililitros de tampão de lavagem. Em seguida, filtre as células através de um filtro de 100 mícrons enquanto o tubo é colocado no gelo. Para enriquecer as células epiteliais tímicas, gire as células novamente e ressuspenda o pellet em 2,5 mililitros de tampão de lavagem.Em seguida, adicione 20 mililitros de RPMI 1640 às células e use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para colocar cuidadosamente 12 mililitros de solução de gradiente de densidade de 21% recém-preparada sob as células por gravidade. Agora, separe as células por centrifugação em um rotor de caçamba oscilante na taxa de desaceleração mais lenta. No final da centrifugação, transfira a camada superior e a interface para um novo tubo de 50 mililitros e adicione até 40 mililitros de solução de lavagem às células.Eliminar o gradiente de densidade por centrifugação três consecutivas com uma pipeta para aspirar o sobrenadante após cada lavagem. Em seguida, ressuspenda o pellet final em dois mililitros de solução de lavagem para contagem. Para gerar os agregados EAK de células epiteliais tímicas, ajuste as células epiteliais tímicas para uma diluição de cinco vezes 10 elevado a quatro células por mililitro em solução de lavagem e semeie 100 microlitros de células por poço em uma placa de cultura de tecidos de fundo redondo de 96 poços de baixa evaporação.Em seguida, adicione 14,6 microlitros de complexos adaptadores de AG de proteína recém-preparados a cada poço e coloque a placa em uma plataforma de balanço a quatro graus Celsius. Após 20 minutos, lave as células com 200 microlitros de solução de lavagem por poço, usando uma micropipeta para remover o sobrenadante. Em seguida, lave as células novamente com 200 microlitros de solução de sacarose a 10%.Ressuspenda os pellets em 30 microlitros de solução de sacarose estéril a 10% por poço. Em seguida, incube as células em 10 microlitros de EAKIIH6 por cinco minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, adicione 20 microlitros de EAK 16-II, seguidos de 100 microlitros de meio completo e coloque a placa em uma plataforma em temperatura ambiente para iniciar a gelificação.Após 15 a 20 minutos, transfira a placa para uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas a quatro horas. Em seguida, adicione mais 100 microlitros de meio completo e retorne a placa para a incubadora. Para trocar o meio, use uma micropipeta para aspirar 100 microlitros do meio da superfície das culturas sem perturbar o gel e coloque a ponta contra as paredes de cada poço para semear as culturas com 100 microlitros de meio pré-aquecido.Usando o protocolo de separação de gradiente de densidade, conforme demonstrado, as células estromais CD45 negativas podem ser enriquecidas rotineiramente de 15 a 20 vezes, conforme ilustrado nesses gráficos de pontos representativos. Aqui, agregados de células epiteliais tímicas, preparados a partir de camundongos transgênicos com expressão fluorescente vermelha de quatro semanas, como acabamos de demonstrar, foram cultivados por dois dias in vitro e examinados por microscopia confocal. Uma vez dominadas, as células epiteliais tímicas podem ser enriquecidas para classificação de fluxo em três a quatro horas.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da engenharia de tecidos do timo desenvolverem mini unidades de timo injetáveis e funcionais para modular o sistema imunológico adaptativo.

promoting-3-d-aggregation-facs-purified-thymic-epithelial-cells-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo a preparação de 2-dGuo tratados reaggregate culturas timo é demonstrada.

Reaggregate Culturas Thymus

Nós apresentamos os protocolos para o 3-dimensional encapsulamento (3D) de células dentro de hidrogéis sintéticos. O procedimento de encapsulamento é descrito por dois métodos comumente utilizados de reticulação (michael tipo adição e light-iniciado livre mecanismos radical), bem como uma série de técnicas para avaliar o comportamento das células encapsuladas.

O encapsulamento celular em Hidrogéis 3D para Engenharia de Tecidos

Aqui nós descrevemos o uso de uma auto-montagem 3-dimensional andaime para a cultura humana células progenitoras neurais. Nós apresentamos um protocolo para liberar as células da scaffolds a serem analisados ​​posteriormente por exemplo, por citometria de fluxo. Este protocolo pode ser adaptado para outros tipos de células para realizar estudos detalhados mecanicamente.

Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem

O protocolo a seguir fornece técnicas para encapsular as células pancreáticas β na etapa de crescimento-PEG-péptido hidrogeles formados por reacções foto-clique tiol-eno. Esta plataforma de material não só proporciona um microambiente cytocompatible para encapsulamento de células, mas também permite que controlado pelo utilizador a recuperação rápida de estruturas de células formadas dentro dos hidrogéis.

Geração e recuperação de β-esferóides de células a partir do passo de crescimento-PEG-péptido Hidrogéis

Para a criação de estruturas altamente organizadas de tecidos complexos, deve-se montar vários tipos de materiais e células em um composto integrado.  Este projeto combinatório incorpora folhas de células em camadas específicas de órgãos com dois materiais distintos derivados biologicamente contendo uma forte base de matriz fibrosa e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos.

Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

O estudo de células epiteliais tímicas medulares in vitro não teve sucesso, pois os sistemas de cultura 2D atuais não imitam o cenário in vivo. O sistema de cultura 3D aqui descrito - um modelo de cultura organotípica de pele modificada - provou ser superior na recapitulação da proliferação, diferenciação e manutenção da expressão gênica promíscua.

3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Hidrogel engenharia de proteínas recombinantes é vantajosos para cultura celular 3D, já que permitem completo pré-definido a espinha dorsal do polímero e, portanto, o microambiente celular. Aqui, descrevemos o processo de purificação de proteínas recombinantes de elastina, como e sua aplicação no encapsulamento de célula de hidrogel 3D.

Produção de elastina, como proteína hidrogel para encapsulamento e imunocoloração de células em 3D

Este protocolo demonstra o uso de um canal microfluídico com geometria variável ao longo da direção do fluxo de fluido para gerar deformação extensional (alongamento) para alinhar as fibras em um hidrogel de colágeno 3D (&lt;250 μm de espessura). O alinhamento resultante se estende por vários milímetros e é influenciado pela taxa de deformação extensional.

Microengenharia 3D Colágeno Hidrogéis com Alinhamento de Fibras de Longo Alcance

Este artigo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D para estudar o enrijecimento da matriz extracelular e a ativação de fibroblastos.

Bioimpressão 3D de hidrogéis fototáveis para estudo da ativação de fibroblastos

Aqui, descrevemos um protocolo para a formação de organoides de timo derivados de iPSC humanos cultivados em hidrogéis de fibrina 3D com o objetivo de apoiar a maturação e manutenção prolongada das células epiteliais tímicas (TEC), bem como a timopoiese in vitro.

Formação de organoides do timo humano em hidrogéis de fibrina tridimensionais

Aprenda a promover agregação 3D de células epiteliais tímicas purificadas por FACS usando hidrogel de auto-montagem EAK16-II/EAKIIH6. Este método suporta sobrevivência celular e avança a bioengenharia do timo.

Promover 3-D agregação de células FACS purificada epiteliais tímicos com EAK 16-II / EAKIIH6 de auto-montagem Hidrogel

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