Remoção de materiais exógenos da parte exterior dos núcleos congelados para investigar a antiga comunidades biológicas abrigava Dentro

A criosfera oferece acesso a organismos preservados que persistiram sob condições ambientais passadas. O objetivo geral deste procedimento é revelar a diversidade oculta ao coletar com sucesso e remover materiais exógenos de testemunhos congelados. Este método pode ajudar a responder perguntas históricas valiosas sobre períodos de tempo específicos, identificando organismos recuperados de gelo glacial e permafrost.

A coleta de um testemunho asséptico no campo é desafiadora devido à alta probabilidade de introdução de contaminantes. Portanto, a principal vantagem desta técnica é que a remoção de contaminantes ocorre em um ambiente laboratorial controlado. A demonstração visual deste protocolo é fundamental, pois as etapas de raspagem e descontaminação podem ser um pouco difíceis de aprender.

Na verdade, é um trabalho para duas pessoas, que exige muita paciência e, especialmente, trabalho em equipe. Demonstrarão este procedimento duas cientistas de apoio do meu laboratório, Karen Foley e Robert Jones. Este protocolo exige limpeza meticulosa.

Use um forno ajustado em 450 graus Celsius para esterilizar os seguintes itens por quatro horas: suportes metálicos estéreis livres de ácidos nucleicos, vidraria, pinças metálicas e lã de vidro. Utilize uma embalagem de folha grossa para prevenir recontaminação.

Em seguida, filtre e esterilize o etanol a 85% e a água ultra-pura utilizando filtros de 0,22 mícrons. Esses líquidos devem permanecer a quatro graus Celsius ou abaixo, pois caso contrário poderão rachar a amostra, facilitando a contaminação. Armazene o etanol a menos 20 graus Celsius.

E armazene a água a quatro graus Celsius. Em seguida, esterilize uma régua de plástico com etanol 70%, seguido pela solução de descontaminação de DNA e pela solução de descontaminação de RNase. Limpe imediatamente cada solução logo após sua aplicação.

Em seguida, guarde a régua em um saco Whirl-Pak estéril e livre de ácidos nucleicos. A seguir, prepare o espaço da câmara fria limpando as paredes, pisos e uma bancada de metal com água sanitária a 1%. Em seguida, ajuste a temperatura da sala para aproximadamente menos 11 graus Celsius.

Uma vez preparado, use trajes leves, luvas de nitrila e máscaras ao entrar na câmara fria para reduzir ao máximo qualquer possibilidade de contaminação do ambiente ou das amostras. Este procedimento exige que duas pessoas trabalhem em conjunto, o que pode ser desafiador considerando as muitas oportunidades de recontaminação.

Para garantir o sucesso, monitoramos uns aos outros, comunicamo-nos e trocamos as luvas com frequência. Com tudo preparado, leve os materiais esterilizados e as amostras para a câmara fria e organize-os sobre a mesa limpa com água sanitária. Isso inclui culturas preparadas de S. marcescens.

Primeiro, o testemunho de permafrost é colocado sobre uma folha de alumínio preparada. Em seguida, a superfície externa do testemunho é levemente inoculada com uma cultura diluída de S. marcescens utilizando uma espuma estéril. Depois, coloque o testemunho sobre uma grade metálica estéril posicionada acima de uma bandeja.

Agora, a lâmina de microtomo de aço é limpa de forma estéril com etanol 70%, solução de descontaminação de DNA e solução de descontaminação de RNase. Em seguida, o pesquisador A limpa suas luvas de nitrila da mesma maneira. Então, A segura o núcleo em um ângulo de 45 graus acima da bandeja.

B raspa suavemente cerca de cinco milímetros da parte externa de todo o núcleo, incluindo as extremidades, utilizando a lâmina estéril, enquanto A gira o núcleo após cada raspagem. Conforme necessário, a lâmina deve ser reesterilizada com as três soluções. Em seguida, B despeja rapidamente e com cuidado etanol a 95% filtrado e esterilizado sobre o núcleo enquanto A o gira.

Em seguida, o núcleo é rapidamente enxaguado com água. A grade de metal sobre a bandeja é agora substituída, e o núcleo é colocado sobre a nova grade. A pessoa agora limpa suas luvas de nitrila e, então, coloca o núcleo sobre uma grade limpa acima da bandeja.

Enquanto isso, B pulveriza todo o núcleo com solução de descontaminação de DNA, seguido por uma lavagem com água filtrada e esterilizada. Em seguida, B pulveriza todo o núcleo com solução de descontaminação de RNase, seguida por outra lavagem com a água. Por fim, o núcleo é colocado em um saco Whirl-Pak estéril.

Inicie colocando uma grade de metal sobre um recipiente de vidro em uma cabine de fluxo laminar. Em seguida, coloque o fragmento na grade de metal. Deixe de dois a cinco milímetros da superfície externa do fragmento descongelar por cerca de 10 minutos.

Durante esse período, gire o núcleo 90 graus a cada dois minutos. Após o descongelamento, segure um pouco de lã de vidro com pinça e passe sobre toda a superfície do núcleo para coletar as bactérias. Em seguida, inocular as duas placas utilizando a lã de vidro.

Em seguida, meça as dimensões externas do núcleo utilizando a régua, mas não toque o núcleo. Além disso, inocule duas placas adicionais com a cultura original previamente utilizada para contaminar a superfície externa do núcleo, a fim de verificar se o inóculo estava viável. Em seguida, transfira o núcleo para um saco estéril grande e armazene-o a menos 80 graus Celsius.

Incube as placas inoculadas a 23 graus Celsius durante uma semana e, em seguida, examine-as quanto a colônias de S. marcescens, que ficam vermelhas nesta temperatura. Embora este protocolo tenha uma série de etapas críticas, uma das mais importantes é verificar o crescimento de Serratia marcescens. Se não houver colônias visíveis de S. marcescens, prossiga com a próxima fase de descongelamento.

SE houver colônias de S. marcescens, raspe mais cinco milímetros do núcleo e repita o procedimento. Verifique se S. marcescens cresceu a partir do cultivo original exposto às temperaturas frias da câmara fria. As amostras foram coletadas de gelo e permafrost de um túnel de 110 metros localizado em Fox, Alasca.

O túnel permitiu o acesso a silte e aluvião ricos em gelo. As amostras foram coletadas em triplicata. Em instalações em New Hampshire, os protocolos descritos foram realizados.

O gene do RNA ribossômico 16S foi sequenciado a partir de bactérias cultivadas a partir dos núcleos. Espécies de Pseudomonas predominaram, mas também estavam presentes membros relacionados à Planctomycetia. E, de particular interesse, foi a ausência de espécies de Serratia, o que mostra que o protocolo de descontaminação removeu suficientemente o DNA exógeno.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como descontaminar com sucesso amostras de gelo e núcleos de permafrost. Uma vez dominados, os passos do processamento em câmara fria podem ser realizados em 30 a 45 minutos, se executados corretamente. Ao tentar este procedimento, é fundamental estar atento a tudo e a todos os locais que você toca.

Em caso de dúvida, basta trocar as luvas e reesterilizar. Após este procedimento, outros métodos, como sequenciamento de amplicons e metagenômica em shotgun, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como qual foi a composição de espécies nesse período ou quais atributos funcionais predominaram sob aquelas condições ambientais.