Stencil micropatterning de células-tronco pluripotentes humana para sondar organização espacial de diferenciação Fates

O objetivo geral deste método de micropadronização baseado em estêncil, para células-tronco pluripotentes humanas, é fornecer um meio simples e robusto de gerar gradientes ambientais espaciais que controlam os padrões de diferenciação de células-tronco. Este método pode ajudá-lo a responder a perguntas-chave na padronização de tecidos usando um modelo de células-tronco humanas, como como gradientes espaciais nas forças de adesão célula-célula e matriz celular podem ajudar a organizar os destinos de diferenciação das células-tronco. A vantagem desse método é que ele não requer modificação adicional da superfície para gerar padrões de ECM adesivos celulares para as células se fixarem.

Isso significa que o método é compatível com várias configurações de ECM e substrato, específicas para cada linha celular. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de micropadronização são difíceis de aprender. Porque requer um manuseio preciso e cuidadoso do estêncil e das células.

Para este procedimento, os estênceis PTMS já devem ser projetados e fabricados. Da mesma forma, tenha células EFC humanas crescendo na matriz da membrana basal, de modo que as colônias estejam prontas para a semeadura mais tarde no procedimento. Para começar, carregue um prato com 700 microlitros de etanol de grau analítico a 70%, em água ultrapura.

Em seguida, coloque o estêncil PDMS na solução e coloque o prato em um armário de biossegurança para secar durante a noite. No dia seguinte, verifique se nenhuma bolha se formou sob o estêncil. Em seguida, coloque o prato em campo até que as células possam ser semeadas no estêncil.

Prepare uma alíquota de matriz de membrana basal de qualidade ESC humana adicionando 16,7 mililitros de DMF12, para fazer uma solução 1,5x e mantê-la no gelo. Trate o substrato com 100 watts de plasma de oxigênio por 90 segundos. Não abra o prato até que esteja dentro da câmara de plasma e cubra-o rapidamente após o tratamento.

Este tratamento evitará a formação de bolhas quando o substrato for imerso em solução. Agora, cubra o estêncil com 450 microlitros de solução preparada de matriz de membrana basal 1,5x. Em seguida, feche o prato com parafilme e incube-o por cinco horas.

Antes de prosseguir, verifique as seis placas de poços das colônias HESC preparadas. Identifique e aspire colônias de células diferenciadas que perderam sua morfologia HESC típica. Todos eles devem parecer arredondados, ter uma morfologia epitelial compacta e ter uma alta relação núcleo-citoplasma com nucléolos proeminentes.

Em seguida, lave cada poço de células plaqueadas com dois mililitros de DMF12 duas vezes. Após a segunda lavagem, adicione um mililitro de enzimas digestivas a cada poço, como a accutase, e incube a placa por oito minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, bata suavemente na placa para separar todas as colônias do substrato.

Em seguida, enxágue cada poço com pelo menos quatro mililitros de meio para cada mililitro de enzima digestiva aplicada ao poço e colete as suspensões celulares em um único tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar as células a 200 g durante três minutos à temperatura ambiente para formar um sedimento de células. Em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 400 microlitros de meios de manutenção HESC, suplementados com 10 micromolares de inibidor de rocha.

Triture as células suavemente três vezes para quebrar os aglomerados. Em seguida, corrija a densidade das suspensões. Misture bem e faça uma diluição de 200 microlitros 1:20 em meio.

Conte as células na diluição usando um hemocitômetro. Em seguida, dilua a suspensão principal conforme necessário, usando meio com inibidor de rocha. Para continuar, adicione o número necessário de células a cada estêncil preparado.

Apenas uma monocamada de células deve ser depositada, portanto, espalhe-as uniformemente. Deixe o estêncil descansar por cinco minutos, para que as células possam assentar. Em seguida, transfira cuidadosamente os estênceis carregados para uma incubadora, mantendo os pratos nivelados durante toda a transferência.

Deixe as células se prenderem aos estênceis durante uma incubação de uma hora. Depois que as células puderem se fixar, examine-as ao microscópio para garantir que o fizeram corretamente. Transfira o estêncil de volta para o capô e aspire as células soltas do estêncil.

Em seguida, adicione dois mililitros de surfactante não iônico compatível com 0,5% em DMF12 à área ao redor do estêncil. Gire a solução para cobrir o estêncil. Em seguida, use uma pinça autoclavada para retirar suavemente o estêncil do prato.

Depois de remover o estêncil, inspecione as células do micropadrão ao microscópio. O surfactante não iônico evita que essas células sequem. Deixe as células micropatterend incubarem na solução de meio suplementado com surfactante por 10 minutos a 37 graus Celsius.

Após 10 minutos, aspire a solução e lave a placa com dois mililitros de meio DMF12 normal, três vezes. Após as lavagens, adicione dois mililitros de meio de manutenção HESC com inibidor de rocha. Mais uma vez, inspecione as células para verificar se os micropadrões se formaram corretamente.

Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, aspire o meio, lave as células uma vez com DMF12 e, em seguida, adicione dois mililitros de meio de diferenciação suplementado, para induzir as células a sofrerem diferenciação do mesoendoderme. Posteriormente, analise os resultados.

A fabricação do estêncil de célula usando um cortador a laser forneceu recursos de 1000 mícrons. O estêncil era composto por uma folha de estêncil fina com orifícios micropadronizados e uma junta PDMS usada para conter as células. Usando esta ferramenta, HESCs micropatterizadas foram investigadas durante a diferenciação do mesoendoderma.

As periferias das colônias H9-HESC têm aderências de integrina mais altas do que as células no interior da colônia. Assim, as células se diferenciam em células mesoendodermas T positivas para braquiário, quando induzidas com activan, BMP4 e FGF2. Quando essas células foram padronizadas em monocamadas de diferentes geometrias, ângulos retos geométricos e isotropiados e em curvaturas convexas, levaram a uma concentração local de forças de tração mediadas por integrina e resultaram em maior diferenciação do mesoendoderme.

A intensidade da expressão de T em diferentes localidades dentro de uma única colônia mostrou que a extensão da indução do meso endoderma foi de fato maior em cantos agudos de colônias quadradas e retangulares e nas curvaturas convexas de um arco semicircular. Isso demonstra que as forças mecânicas mediadas pela adesão celular podem ser moduladas usando o método descrito. Antes de tentar o procedimento, é importante otimizar o tempo de revestimento da matriz, o tempo de digestão celular e o tempo de fixação, para a linhagem específica de células-tronco pluripotentes humanas com as quais você está trabalhando.