Name: Genoma Edição na Mexicanus Astyanax Usando Transcrição Activator-like Effector nucleases (TALENS) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda a introduzir mutações em genes específicos de Astyanax mexicanus usando TALENs. Este método permite estudar a base genética das adaptações em peixes de caverna e testar efeitos fenotípicos.

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Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Genética, Desenvolvimento e Biologia Celular e Iowa State University e pelo NIH concessão EY024941 (WJ) .dr. Jeffrey Essner fornecida comentários sobre o manuscrito.

Todos os procedimentos com animais estavam de acordo com as orientações dos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use em Iowa State University e da Universidade de Maryland. 1. TALEN projeto <ol><li> Entrada desejada sequência alvo para um site de design TALEN. (Por exemplo: <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). Entrada escolhida comprimentos de matriz espaçador / repetição. <ol><li> Copie a sequência genómica na caixa chamada &quot;seqüência&quot;. </li><li> Dentro da aba &quot;fornecer personalizado Spacer / RVD Comprimentos&quot;, selecione o comprimento do espaçador e comprimento da matriz. Nota: comprimentos de espaçador de 15 pares de bases e repetir comprimentos de matriz de 15-17 de trabalho bem e fazer a montagem menos complexo. </li></ol></li><li> Escolha um par TALEN. pares TALEN concebidos em torno de um local de enzima de restrição único para permitir a genotipagem por digestão com enzimas de restriçãoum produto de PCR. </li><li> Projeto primers para amplificar a região genômica em torno do local alvo TALEN usando um site como Primer3 30-32. Quando a genotipagem com uma enzima de restrição, de concepção iniciadores para amplificar uma região que contém o local de enzima de restrição de uma única vez. Recomenda-se que esta região é amplificado e sequenciado antes da construção TALEN para identificar quaisquer polimorfismos presentes na A. mexicanus população laboratório para ser usado para microinjecção. </li></ol> 2. Montagem TALEN (modificado a partir do Protocolo TALEN Kit) 33,34 Para obter detalhes adicionais e solução de problemas, consulte o protocolo 34. <ol><li> Preparar e sequenciar os plasmídeos necessários a partir do kit de TALEN de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Configure o # 1 Reacções para as reacções A e B. Incluir repetir-variáveis ​​diresidues (RVDS) 1-10 eo pFUS_A destino vector na Reacção A. Incluir RVDS 11- (N-1) e the destino vector pFUS_B (N-1) na Reacção B, em que N é o número total de RVDS na TALEN. <ol><li> Adicionar a cada reacção: 1 uL de cada um dos plasmídeos contendo cada RVD (100 ng / ul), o vector de destino (100 ng / uL), 1 ul Bsa I da enzima de restrição, 1 ul de Albumina de Soro Bovino (BSA) (2 mg / ml ), 1 ul de ligase, 2 ul de tampão ligase 10x e X ul de água para um volume total de 20 ul. Por exemplo, ver Tabela 1. Nota: Meio reacções também podem ser usados. </li><li> Coloque reacções num termociclador e executar o ciclo: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Incubam-se as reacções com a nuclease. Para cada reacção de adicionar 1 ul de ATP 25 mM e 1 uL de nuclease. Incubar as reacções a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Transformar reações. <ol><li> Transformação com 2,5 ul de cada reacção em 25 ul de células competentes quimicamente. Nota: caseiro c competenteells pode ser usado. No entanto, as células com competência baixa pode resultar em falta de colónias. <ol><li> Misture 2,5 ul da reacção com 25 ul de células competentes quimicamente. Incubar em gelo durante cinco min. Incubam-se as células durante 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Colocar os tubos em gelo durante 2 min. Adicionar 125 mL de Super Optimal caldo com repressão catabólica (SOC). Agitar os tubos a 37 ° C durante 1 h. </li></ol></li><li> Placa de 100 ul das células transformadas em placas de LB com espectinomicina (50 ug / ml), X-gal e isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Cresça O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Escolha 2-3 colónias brancas para cada reacção e verificar pela colônia PCR usando primers pCR8_F1 e pCR8_R1 (Tabela 2). <ol><li> Faça uma mistura mestre dos reagentes. Por exemplo, ver Tabela 3. </li><li> Escolha uma colônia e manchá-lo no fundo de um tubo PCR, e depois colocar os restos da colônia em 2 ml LB com espectinomicina(50 ug / ml). Colocar 15 ul da mistura principal para dentro do tubo com a colónia. </li><li> Executar o seguinte programa de PCR (Tabela 4) </li><li> Verifique a PCR (executado de todo o volume) num gel de agarose a 1,5% por electroforese. Os clones correctos terão uma banda com o tamanho esperado, bem como uma mancha e uma escada de bandas. Para um exemplo de o esfregaço adequado, consulte 34,33. </li><li> Cresça 2 ml de culturas dos clones correctos em meio LB O / N a 37 ° C numa incubadora com agitação. </li></ol></li><li> Miniprep os plasmídeos de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Sequência de verificar sequência TALEN com pCR8_F1 e pCR8_R1. Siga métodos previamente descritos 35. </li><li> Utilizando os clones correctos verificados por sequenciação, definir-se a reacção # 2 (TALEN kit), que irá colocar os RVDS a partir dos vectores A e B e a RVD final para o vector de destino. <ol><li> Prepare a mistura de reacção 2 (Tabela 5). Nota: Hareacções LF pode ser usado. </li><li> Coloque as reacções num termociclador e executar o seguinte programa: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Transformar reações. <ol><li> Transformação com 2,5 ul de cada reacção em 25 ul de células competentes quimicamente. <ol><li> Misture 2,5 ul da reacção com 25 ul de células competentes quimicamente. Incubar em gelo durante 5 min. Choque térmico das células durante 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Colocar os tubos em gelo. Adicionar 125 ul de SOC. Colocar os tubos em um incubador com agitação a 37 ° C durante 1 h. </li></ol></li><li> Placa de 100 ul das células transformadas em placas de LB com ampicilina (100 ug / ml), X-gal e IPTG. Crescer O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Escolha 1-3 colónias brancas para cada reacção e verificar pela colônia PCR usando primers TAL_F1 e TAL_R2 (Tabela 2). <ol><li> Adicione uma solução do mastermix polimerase, e iniciadores como águadescrita na Tabela 3. Escolher uma colónia e esfregaço-o no fundo de um tubo de PCR, e em seguida colocar os restos da colónia em 2 ml de LB com ampicilina (100 ug / ml). Colocar 15 ul da solução no tubo com a colónia. </li><li> Executar o programa de PCR (Tabela 6). </li><li> Verifique a PCR num gel de agarose a 1,5% por electroforese. Os clones correctos terão um manchas e uma escada de bandas. Para um exemplo de o esfregaço adequado, consulte 34,33. </li><li> Cresça 2 ml de culturas dos clones correctos em meio LB O / N a 37 ° C numa incubadora com agitação. </li></ol></li><li> Miniprep os plasmídeos de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Sequência de verificar sequência TALEN com TAL_F1 e TAL_R2 seguindo os métodos descritos anteriormente 35. </li></ol> 3. A transcrição de ARNm TALENS <ol><li> Digerir 4 ug do modelo verificou-sequência com 2 ul Sac I durante 2 horas a 37 ° C. </li&gt; <li> Executar 2 ul do plasmídeo Sac I digerido num gel de agarose a 1,5% por electroforese. Os plasmídeos que são correctamente digeridos irá exibir uma única banda. </li><li> Purifica-se o plasmídeo restante Sac I digerido seguindo o protocolo do kit de purificação de PCR. Lavar duas vezes com a solução de lavagem antes da eluição. Eluir em 30 mL de água livre de nuclease. </li><li> Siga o protocolo padrão para a produção de mRNA T3. <ol><li> Configurar meias reações usando 0,5 mg de modelo linearizado (preparado acima). Incubar a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Adicionar 0,5 ul de ADNase (incluído no estojo) e incubar a 37 ° C durante 15 min. </li></ol></li><li> Purifica-se o ARNm, seguindo as instruções do fabricante. Eluir em 30 de água livre de nuclease ul. </li><li> Executar um gel de agarose a 1,5% por electroforese para verificar o ARNm. <ol><li> Limpar o aparelho de gel com um produto para eliminar a contaminação com RNase e preparar um gel de 1,2%. </li><li> Mix 1 mRNA ul + 4 &amp;# 181; l livre de nuclease de água + 5 jul glioxil carga de corante. Incubar as amostras a 50 ° C durante 30 min. Centrifugar os tubos de forma breve e colocar no gelo antes de executar o gel. </li></ol></li><li> Verifique a concentração, utilizando um método de quantificação de concentrações de ácidos nucleicos e armazenar o ARN em alíquotas a -80 ° C. Escolha um tamanho de alíquota de tal forma que o RNA não está congelado / descongelado mais de uma vez. Nota: As concentrações de 500-1000 ng / nl são tipicamente obtidas. ARN com uma concentração mais baixa pode ser usado, desde que a integridade de ARN é mantida (como avaliado por uma banda em vez de um esfregaço no gel). </li></ol> 4. Inject Astyanax mexicanus embriões com mRNA TALEN <ol><li> Prepare Ferramentas para injecção. <ol><li> Verter em placas de injecção por vazamento de 1,2% de agarose em peixes de água (água condicionada com bicarbonato de sódio e sal do mar para um pH de 7,4 e condutividade de 700 mS) numa placa de Petri. Coloque um molde (pedaço de plástico com as projeções para fazer poços para peixesovos) no interior do prato. Retirar o molde quando a agarose endureceu e armazenar a 4 ° C. Para mais detalhes sobre o molde ver 36. </li><li> Puxar agulhas para injecção, utilizando um extractor de agulha de acordo com as instruções do fabricante. Nota: comprimento da agulha adequada é importante para injectáveis. Agulhas que estão muito tempo vai ser muito flexível para injectáveis. O protocolo para as agulhas que puxam irá variar com o equipamento usado para puxar agulhas. Um exemplo de uma agulha apropriada é mostrado na Figura 1. Para o nosso equipamento, que puxar agulhas que são 5-6 cm de comprimento, e tem um diâmetro externo na ponta de cerca de 0,011 milímetros quando quebrado. No entanto, as agulhas devem ser calibrados (passo 4.3.4) para determinar a largura de abertura. Um programa de exemplo para puxar as agulhas podem ser encontrados na Tabela 7. </li><li> Prepare pipetas de vidro para transferência de embriões por quebrar a pipeta de modo que a abertura é grande o suficiente para um ovo para passar. Inflamar o final quebrado atéele não é mais acentuado. Nota: É importante o uso de pipetas de vidro e taças de vidro quando se trabalha com A. mexicanus ovos embriões e como eles são pegajoso e irá aderir ao plástico. </li></ol></li><li> Recolha 1 de células Stage ovos. <ol><li> Raça A. mexicanus seguindo protocolos convencionais 37. Nota: Por exemplo, se os peixes são mantidos em um 14 luz: ciclo escuro 10 e usando o tempo Zeitgerber (ZT) com ZT0 como luzes acesas e ZT14 como luzes apagadas, a desova de peixes de superfície entre ZT15 e ZT19. época de reprodução exata deve ser determinada para cada laboratório individual. </li><li> Induzir a desova por superalimentação de peixe por 3-4 dias antes do acasalamento e colocando peixe em água doce. Elevar a temperatura ° F 2. Nota: Nossa temperatura inicial da água é de aproximadamente 74 ° F. </li><li> Recolher os ovos de peixes de superfície no escuro, verificando a cada 15 min para obter ovos na fase 1 célula. Centenas de ovos pode ser obtido a partir de um único par de peixes de superfície. </li><li> coletarovos em tigelas de vidro para impedir que adere a superfícies de plástico e tipo, para isolar os embriões na fase de uma célula antes da injecção por meio da observação de ovos sob o microscópio e recolhendo ovos que são de uma única célula. Mantenha os ovos em água doce sistema (água do tanque em que os peixes adultos estão alojados, que foi tratada para pH e condutividade). </li></ol></li><li> Injetar mRNA TALEN. <ol><li> Injectar diferentes quantidades de ARNm total (quantidades iguais de cada TALEN no par) para determinar a concentração óptima para a injecção como toxicidade e eficiência variar por TALEN par. Comece por injecção de concentrações de ARNm total que são 400-800 pg. Dilui-se e combinar ARNm para as concentrações desejadas para a injecção de 1,5 nl. </li><li> Carga diluída ARNm na parte de trás da agulha e colocar a agulha uma micro-injector. </li><li> Quebrar a agulha com a pinça. </li><li> Calibrar a agulha. Por exemplo, ejectar 10 vezes e recolher a queda, resultando em um micro capilar. Para 10 100 x 1,0 descartável81; l, 32 milímetros micro capilar, a gota deve preencher o micro capilar até 0,5 mm para 1,5 nl / 1 injecção. Ajuste o tempo de injeção e pressão conforme necessário. </li><li> Insira a agulha na única célula e injetar o mRNA. Injectar o ARNm directamente para dentro da célula, não na gema. </li><li> Coletar embriões injetados em taças de vidro. Manter os embriões em 23-25 ​​° C. Remover embriões mortos (embriões que se tornam nublado e de forma irregular) regularmente para os primeiros dias após a injecção. Um número recorde de embriões mortos e deformados de controle (não injectada) e as placas injetado. Nota: O aumento da concentração de mRNA pode levar ao aumento da toxicidade e deformidade / morte de embriões. Assim, a toxicidade contra eficiência devem ser equilibradas para determinar a melhor concentração de ARNm para injectar. </li></ol></li></ol> 5. Fenótipo Peixe Fundador e avaliar a eficiência TALEN <ol><li> Sacrificar embriões acordo com o protocolo animais institucional. Nota: Nós eutanásiaembriões de arrefecimento rápido em gelo. </li><li> Coletar embriões em 0,8 ul de PCR tubos tira utilizando uma pipeta de transferência. Nota: A genotipagem pode ser realizada em embriões ou conjuntos de embriões individuais. </li><li> Extrair DNA. <ol><li> Coloque embriões em 100 ul de hidróxido de sódio 50 mM (NaOH) e incubar a 95 ° C durante 30 min, depois arrefece-se a 4 ° C. </li><li> Adicionar 1/10 volume de (10 ul) de Tris-HCl 1 M pH 8. </li></ol></li><li> Realizar uma PCR para a região utilizando os primers desenhados no passo 1.3 (ver Tabelas 8 e 9 para os protocolos de amostra). Para os embriões individuais 1 uL de ADN é suficiente para a reacção de PCR. </li><li> Digerir o produto de PCR resultante, com a enzima de restrição apropriada e correr um gel de agarose a 1,5% por electroforese. <ol><li> Por exemplo, para a genotipagem do locus albinismo oculocutâneo 2 (OCA2) em embriões injectados digerir o produto de RCP, utilizando o enzima de restrição Bsr I por adição de 0.5 Ul de Bsr I directamente a 12,5 uL da reacção de PCR concluída, incubando a 65 ° C durante 2 h. Executar o não digerido e o produto digerido num gel. Bandas resistente a enzimas de restrição (ou seja, as bandas que não digerem) indicam que as mutações induzidas TALEN estão presentes (Figura 2). </li></ol></li><li> (Opcional) Calcular a taxa de mutação percentagem por determinação da percentagem de produto não cortado através da análise de imagens de geles em Fiji 38 usando a ferramenta de análise em gel para calcular o valor de intensidade de cada banda 29, como descrito anteriormente. </li><li> Determinar a sequência de alelos mutantes de clonagem TA por a banda mutante resistente purificado em gel de enzima de restrição e sequenciação de clones. <ol><li> Gel purificar a enzima de restrição banda mutante resistente seguindo as instruções do fabricante. TA clonar a banda seguindo as instruções do fabricante. Escolha colónias e crescer em 1,5 ml de LB O / N a 37 ° C em uma agitaçãoincubadora. </li><li> culturas Miniprep seguindo as instruções do fabricante. Envia o DNA para sequenciamento. </li><li> Usando um programa como o macaco, alinhar as sequências mutantes para a sequência do tipo selvagem. <ol><li> Copiar e colar as duas seqüências em arquivos de macaco. Escolha a opção &quot;Alinhar duas sequências de&quot; ferramenta a partir do menu &quot;Ferramentas&quot;. </li><li> Especificar as duas sequências de ADN usando os menus suspensos. Nota: o complemento reverso da sequência clonada pode precisar de ser utilizado, dependendo do sentido da PCR foi para o vector de clonagem. Se as sequências não se alinham, repita os passos de marcar a caixa &quot;Rev-Com&quot; na caixa &quot;DNA Align&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Avaliar peixes fundador de fenótipos na fase adequada e utilizando métodos adequados para o fenótipo esperado 29 (Por exemplo, a Figura 3). Os métodos de fenotipagem será com base no fenótipo esperado para o gene alvo pelo investigador utilizando a PROTOCol. </li></ol> 6. Tela de transmissão germinal Nota: A. mexicanus atingem a maturidade sexual aos 4-8 meses. <ol><li> Cruzar um peixe fundador sexualmente maduros para o tipo de peixe selvagem. </li><li> Embriões de tela ou peixes adultos usando métodos em passos 5.1-5.7 (Figura 4). Para peixes adultos, um pedaço da cauda pode ser cortada seguinte anesthetization. <ol><li> Anestesiar peixe peixes por submersão numa solução de tricaina (éster etílico do ácido 3-aminobenzóico) para reduzir o stress durante recorte aleta. Seguindo recorte fin, permitir que os peixes para se recuperar em água doce. Peixe recuperar rapidamente; observar até que tenham recuperado (estão nadando normalmente). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Grandes avanços foram feitos nos últimos anos para a compreensão da base genética da evolução dos traços. Embora os genes candidatos subjacentes a evolução de um número de características tem sido identificado, manteve-se um desafio para testar estes genes in vivo, devido à falta de rastreabilidade genética de espécies evolutivamente mais interessantes. Aqui nós relatamos um método para edição genoma em A. mexicanus, espécie usada para estudar a evolução de animais das cavernas. Mapeamento genético est...

A compreensão da base genética da evolução característica é uma meta pesquisa crítica dos biólogos evolutivos. Um progresso considerável foi feito na identificação de loci subjacentes à evolução dos traços e identificar genes candidatos dentro destes loci (por exemplo 1-3). No entanto, funcionalmente testar o papel destes genes manteve-se como um desafio muitos organismos utilizados para o estudo da evolução de traços não são actualmente tratável geneticamente. O advento das tecnologias de edição genoma aumentou significativamente a manipulabilidade genética de uma larga gama de organismos. Transcrição nucleases-activadores como efectoras (TALENS) e agrupados regularmente interespaçadas palindrï¿½icas repetições curtas (CRISPR) foram usadas para gerar mutações pontuais em genes em vários organismos (por exemplo, 4-11). Essas ferramentas, aplicados a um sistema evolutivamente relevantes, têm o potencial de revolucionar a forma como os biólogos evolucionistas estudar a base genética da evolução. Astyanax mexicanus é uma espécie de peixe que existe em duas formas: a. (Peixe de superfície) forma de superfície-moradia rio e múltiplas formas cavernícolas (cavefish) A. mexicanus cavefish evoluíram a partir de ancestrais peixes de superfície (revisto em 12). Populações de cavefish desenvolveram uma série de características, incluindo a perda dos olhos, diminuição ou perda da pigmentação, aumento do número de papilas gustativas e neuromasts cranianos e alterações no comportamento, como a perda do comportamento de escolaridade, aumento da agressividade, mudanças na alimentação postura e hiperfagia 13 -19. Cavefish e peixes de superfície são interférteis e experimentos de mapeamento genético foram realizados para identificar genes loci e candidatos para características caverna 1,20-26. Alguns genes candidatos foram testados para um papel funcional em contribuir para traços caverna em cultura de células 1,19, em organismos modelo de outras espécies de 21 ou pela superexpressão 27 ou knockdown transitória ucantar morpholinos 28 em A. mexicanus. No entanto, cada um destes métodos tem limitações. A capacidade para gerar alelos mutantes desses genes em A. mexicanus é fundamental para a compreensão de sua função na evolução da cavefish. Assim, A. mexicanus é um organismo candidato ideal para a aplicação de tecnologias de edição genoma. Aqui destacamos um método para edição genoma em A. mexicanus usando TALENS. Este método pode ser utilizado para avaliar mosaico injectado peixe fundador para fenótipos e para o isolamento de linhas de peixes com mutações estáveis ​​em 29 genes de interesse.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estação</td><td></td><td></td><td></td>de injeção</tr><tr><td>Aparelho</td><td></td><td></td><td></td>de gel</tr><tr><td>Extrator</td><td></td><td></td><td></td>de agulhas</tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td> Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários<</td></tr><tr><td>strong>Suprimentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nota: Até onde sabemos, suprimentos de diferentes empresas podem ser usados, salvo indicação</td><td></td><td></td><td></td>em contrário</tr><tr><td>Golden Gate TALEN e TAL Effector Kit 2.0</td><td>Addgene</td><td>Kit #1000000024</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulado)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 em 50% EtOH</td><td>Teknova (encomendado através da Fisher)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>Dicloridrato de Espectinomicina, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Ampicilina (1,000x solução)</td> <td>DNA Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Solution, pronto para uso</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (encomendado através da Fisher)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri</td><td>Fisher</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England Biolabs (encomendado através da Fisher)</td><td>50-812-203</td><td>Use BsaI, não BsaI-HF (conforme descrito no protocolo Golden Gate TALEN e TAL Effector Kit)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>fornecido com enzimas de</td><td></td>restrição</tr><tr><td>10x tampão ligase T4</td><td>Promega (encomendado pela Fisher)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master mix</td><td>Promega (encomendado pela Fisher)</td><td>PRM7123</td><td>Outro Taq pode ser usado, mas a reação deve ser ajustada de acordo</td></tr><tr><td>Kit de ligadura rápida</td><td>New England Biolabs (encomendado através da Fisher)</td><td>50-811-728</td><td>Usamos Quick Ligase para todas as reações de montagem TALEN</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 E.coli quimicamente competente</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>Outras células quimicamente competentes ou células competentes caseiras podem ser usadas</td></tr><tr><td>Esp 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Encomendado através da Fisher)</td><td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>Epicentro DNase dependente de ATP seguro para plasmídeo</td><td>(encomendado através da Fisher)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparação de rotação QIAprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>O kit Qiagen deve ser usado para a preparação inicial do plasmídeo (conforme descrito no protocolo Golden Gate TALEN e TAL Effector Kit)</td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Agaraose de dissolução rápida</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>Sac I</td><td>Promega (Encomendado através da Fisher)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Transcrição mMESSAGE mMACHINE T3</td> Kit de Limpeza <td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly Corante de Carregamento de Amostra&nbsp;</td><td>Ambion (encomendado através da Fisher)</td> <td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (encomendado através da Fisher)</td> <td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur de Vidro Soda-Cal Descartáveis Fisherbrand</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de Vidro Padrão</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Microcarregador Eppendorf Femtotips para Microinjetor Femtojet</td><td>Eppendorf (encomendado através da Fisher)</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

genoma edição na<em&gt; mexicanus astyanax</em&gt; usando transcrição activator-like effector nucleases (talens)

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identificar alelos de genes subjacentes à mudança evolutiva é essencial para entender como e por que a evolução ocorre. Para esse fim, muitos trabalhos recentes se concentraram na identificação de genes candidatos para a evolução de características em uma variedade de espécies. No entanto, até recentemente, tem sido um desafio validar funcionalmente genes candidatos interessantes. Ferramentas recentemente desenvolvidas para engenharia genética tornam possível manipular genes específicos em uma ampla gama de organismos. A aplicação dessa tecnologia em organismos evolutivamente relevantes permitirá uma visão sem precedentes do papel dos genes candidatos na evolução. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) é uma espécie de peixe com formas que vivem na superfície e em cavernas. Múltiplas linhagens independentes de formas que vivem em cavernas evoluíram de peixes ancestrais da superfície, que são interférteis entre si e com peixes da superfície, permitindo a elucidação da base genética das características das cavernas. A. mexicanus tem sido usado para uma série de estudos evolutivos, incluindo análise de ligação para identificar genes candidatos responsáveis por uma série de características. Assim, A. mexicanus é um sistema ideal para a aplicação da edição do genoma para testar o papel de genes candidatos. Aqui, relatamos um método para usar nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs) para mutar genes na superfície de A. mexicanus. A edição do genoma usando TALENs em A. mexicanus tem sido utilizada para gerar mutações em genes de pigmentação. Essa técnica também pode ser utilizada para avaliar o papel de genes candidatos para uma série de outras características que evoluíram em formas cavernícolas de A. mexicanus.

TALEN injecções par resultar na ligação dos RVDS aos nucleótidos de ADN específicas e, assim, a dimerização dos domínios FokI, resultando em quebras de cadeia dupla 39, que podem ser reparados através da extremidade não-homóloga de união (NHEJ). NHEJ frequentemente introduz erros que resultam em inserções ou deleções (indels). Indels podem ser identificados através da amplificação da região em torno do local alvo TALEN e digestão do fragmento amplificado resultante co...

mutagénese de direccionamento de genes é agora possível em uma ampla gama de microrganismos utilizando técnicas de edição genoma. Aqui, nós demonstramos um protocolo para mutagénese gene alvo usando ativador de transcrição como nucleases efetoras (TALENS) em Astyanax mexicanus, uma espécie de peixe que inclui peixes de superfície e cavefish.

Genoma Edição na<em&gt; Mexicanus Astyanax</em&gt; Usando Transcrição Activator-like Effector nucleases (TALENS)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

O objetivo geral deste procedimento é introduzir mutações em genes específicos no peixe de caverna Astyanax mexicanus. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de biologia evolutiva sobre a base genética da evolução de características de caverna. A principal vantagem desta técnica é que o efeito da perda do gene específico pode agora ser testado em Astyanax mexicanus.Após projetar e montar nucleases ativadoras de fator de transcrição do tipo TALEN, ou TALENs, conforme o protocolo descrito, utilize dois microlitros de Sac1 para digerir quatro microgramas de molde com sequência verificada a 37 graus Celsius por duas horas. Execute dois microlitros do plasmídeo digerido com Sac1 em um gel de agarose a um ponto cinco por cento e verifique a presença de uma única banda para confirmar a digestão. Para realizar a produção de mRNA T três, utilize zero vírgula cinco microgramas de molde linearizado para montar reações pela metade, seguindo um protocolo padrão.Incube a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, adicione zero vírgula quatro microlitros de DNase e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após a purificação do mRNA, para verificar a qualidade, utilize um produto que elimina contaminação por RNase para limpar o equipamento de eletroforese em gel.Em seguida, prepare um gel a um vírgula dois por cento. Misture um microlitro do mRNA, quatro microlitros de água livre de nucleases e cinco microlitros de corante de carga com glioxal. Incube as amostras a 50 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, centrifugue brevemente os tubos e coloque-os no gelo antes de realizar a eletroforese em gel. Após verificar a concentração do mRNA, prepare alíquotas antes de armazenar a menos 80 graus Celsius. Consulte o protocolo descrito no texto para obter detalhes adicionais.Após preparar as agulhas de injeção e as placas de acordo com o protocolo descrito, induza a desova em A.mexicanus superalimentando os peixes por três a quatro dias antes da reprodução e coloque os peixes em água fresca. Aumente a temperatura da água em dois graus Fahrenheit, até aproximadamente 76 graus Celsius. A cada 15 minutos, verifique a presença de ovos de peixes na superfície em ambiente escuro e transfira-os para tigelas de vidro para evitar que adiram à superfície.Centenas de ovos podem ser obtidos a partir de um único par de peixes de superfície. Sob microscópio, separe os ovos isolados e transfira aqueles na fase de uma célula para água fresca do sistema. Carregue o mRNA diluído na parte traseira da agulha e desconecte a agulha para um microinjetor.Em seguida, utilizando pinças, quebre a agulha. Para calibrar a agulha, injete dez vezes e colete a gota resultante em um microcapilar. A gota deve preencher um microcapilar descartável de um microlitro, 10 por 100, 32 milímetros até meio milímetro por injeção de um ponto cinco nanolitros.Agora, insira a agulha na célula única e injete o mRNA. Colete os embriões injetados em recipientes de vidro e incube-os a 23 a 25 graus Celsius. Remova os embriões mortos regularmente durante os primeiros dias após a injeção.Registre o número de embriões mortos e deformados das placas controle não injetadas e das placas injetadas. Consulte o protocolo descrito no texto para obter detalhes adicionais. Após a eutanásia dos peixes de acordo com o protocolo do seu comitê institucional IACUC, para extrair o DNA, colete os embriões em 100 microlitros de hidróxido de sódio 50 milimolar e incube a 95 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, resfrie a quatro graus Celsius. Adicione um volume igual a um décimo de tris HCl 1 M, pH 8, aos embriões resfriados. Em seguida, realize a PCR usando primers, por exemplo, para o gene oculocutâneo de albinismo 2 ou OCA2.Para embriões individuais, um microlitro de DNA é suficiente para a reação de PCR. Para genotipar o locus OCA2, utilize a enzima de restrição DSR1 para digerir o produto de PCR resultante, adicionando diretamente zero vírgula cinco microlitros da enzima a doze vírgula cinco microlitros da reação de PCR concluída. Após incubação a 65 graus Celsius por duas horas, execute a reação e uma amostra do produto de PCR não digerido em um gel de agarose a um vírgula cinco por cento.Realize análises adicionais de acordo com o protocolo descrito no texto. As injeções de TALEN podem resultar em quebras de dupla fita no DNA que podem ser reparadas por junção de extremidades não homólogas, mas que também podem introduzir inserções ou deleções, ou INDELs. Usando digestão com enzima de restrição no extremo da PCR para direcionar a região espaçadora do TALEN, os INDELs podem ser identificados pela presença de uma banda resistente à enzima de restrição.As injeções de TALEN podem produzir mutações gênicas bialélicas em A.mexicanus e, assim, alguns fenótipos podem ser avaliados em peixes fundadores. Por exemplo, OCA2, o gene hipotetizado como responsável pela albinismo em peixes de caverna, foi avaliado. Como mostrado aqui, manchas albinas em peixes injetados com TALEN direcionados ao OCA2 foram identificadas, as quais não estavam presentes em peixes não injetados.Nesta imagem de gel, produtos de PCR de 306 pares de bases do éxon nove de OCA2 de A.mexicanus foram analisados quanto à perda do sítio da enzima de restrição em pools de 10 peixes F1 provenientes de um peixe fundador injetado. O amplicon de um embrião controle foi digerido, enquanto uma parte do amplicon mostrou resistência à digestão de restrição em embriões F1 de peixes injetados. Além disso, demonstrou-se que as bandas resistentes à digestão de restrição contêm INDELs.Uma vez dominadas, essas injeções podem ser realizadas em menos de algumas horas, se forem feitas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular cuidadosamente o RNA para evitar sua degradação e realizar as injeções durante o estágio de uma célula. Após este procedimento, pode-se realizar uma análise fenotípica para responder perguntas adicionais, como se um determinado gene subjaz a um fenótipo chave em peixes quando mutado em peixes de superfície.Essa técnica abrirá caminho para pesquisadores na área de biologia evolutiva caracterizarem o papel de genes candidatos na evolução do peixe-caverna Astyanax mexicanus. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como injetar embriões de Astyanax mexicanus com mRNA de TALEN.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra uma técnica de edição de genoma baseada em nuclease de dedo de zinco em células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Como as hPSCs podem ser potencialmente diferenciadas em vários tipos de células, essa tecnologia é útil para estudos patológicos e farmacológicos in vitro de maneira específica do paciente.

Edição do genoma baseada em nuclease de dedo de zinco: uma técnica para modificar o genoma em células-tronco pluripotentes humanas por mecanismo de reparo dependente de homologia de fita dupla

Nucleases designers, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e activadores de transcrição, tal como nucleases efectoras (TALENS) pode ser utilizado para modificar o genoma de embriões préimplantação de ratinho por desencadear tanto a extremidade não homóloga de união (NHEJ) e recombinação homóloga (HR) vias. Estes avanços permitir a rápida geração de ratinhos com modificações genéticas precisas.

Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer

Manipulações transgénicas e edição genoma são críticos para testar funcionalmente o papel dos genes e elementos -regulatory cis. Aqui, um protocolo detalhado para microinjecção a geração de modificações genómicas (incluindo construções Tol2 mediadas repórter fluorescentes transgene, TALENS, e CRISPR) é apresentada para o peixe modelo emergente, a Gasterosteus aculeatus.

Microinjeção para Transgénese e Genoma Edição na Threespine Sticklebacks

Utilizando um Cas9 preassembled ribonucleoprotein complexo (RNP) é um método poderoso para edição de genoma preciso e eficiente. Aqui, destacamos a sua utilidade em uma ampla variedade de células e organismos, incluindo células humanas primárias e os dois clássicos e emergentes organismos modelo.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

Descrevemos abordagens para a manipulação de genes no sistema modelo evolucionista Astyanax mexicanus. São descritas três técnicas diferentes: transgênese mediada por Tol2, alvo de manipulação do genoma usando CRISPR/Cas9 e nocaute de expressão usando morpholinos. Essas ferramentas devem facilitar a investigação direta de genes subjacentes a variação entre as formas de superfície - e caverna-moradia.

Manipulação de função do Gene em Cavefish mexicano

É apresentado aqui um protocolo para executar a batida-para fora do gene tempo-e espaço-restrito em cordas espinais do Axolotl injetando o complexo de CAS9-gRNA no canal central da medula espinal seguido pelo Electroporation.

Gene direto knock-out de células-tronco neurais da medula espinhal Axolotl via eletroporação de complexos de proteína-gRNA CAS9

O objetivo deste protocolo é permitir a edição perfeita do genoma C. elegans usando complexos de ribonucleoproteína montados e o marcador co-CRISPR dpy-10 para triagem. Este protocolo pode ser usado para fazer uma variedade de modificações genéticas em C. elegans incluindo inserções, exclusões, substituições genéticas e substituições de codon.

CRISPR/Cas9 Edição do Gene C. elegans rbm-3.2 utilizando o marcador de triagem co-CRISPR dpy-10 e complexos de ribonucleoproteína montados.

Este protocolo descreve como realizar uma edição eficiente da base de adenina sem limitação de PAM para construir um modelo preciso de doença do peixe-zebra usando zSpRY-ABE8e.

Edição de Base Eficiente sem PAM para Modelagem de Zebrafish de Doenças Genéticas Humanas com zSpRY-ABE8e

A eficiência do método de Edição Aprimorada do Genoma via Entrega de Ácidos Nucléicos Ovidutais (I-GONAD) é comparável à microinjeção tradicional, que requer coleta de zigoto de fêmeas doadoras e transferência para fêmeas pseudo-grávidas. Este protocolo demonstra sua eficácia introduzindo mutações induzidas por CRISPR/Cas9 no locus ROSA26 no cromossomo 6.

Edição de genoma aprimorada por meio de técnica de eletroporação in vivo baseada em entrega de ácidos nucléicos ovidutais para geração de camundongos knockout

A entrega de editores genômicos como RNAs é um meio particularmente potente de modificar os genomas das células primárias e linhagens celulares de mamíferos. O objetivo desse protocolo é entregar editores genômicos como mRNA em células e linhagens celulares primárias de mamíferos, seguido por sequenciamento e análise direcionados da Illumina para quantificar os resultados da edição.

Edição do Genoma em Células Primárias de Mamíferos por Eletroporação do RNA Editor

Aprenda a introduzir mutações em genes específicos de Astyanax mexicanus usando TALENs. Este método permite estudar a base genética das adaptações em peixes de caverna e testar efeitos fenotípicos.

Genoma Edição na

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