Name: Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprenda a avaliar a função supressora in vitro de células T reguladoras isoladas de camundongos infectados com vírus da coriomeningite linfocítica crônica. Este método permite analisar o fenótipo e a atividade imunorreguladora.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Ciências Básicas por meio da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da Educação (2015R1A6A3A01020610 para HJP) e uma bolsa do Projeto de P&D de Tecnologia de Saúde da Coreia, Ministério da Saúde, Bem-Estar e Assuntos da Família, República da Coreia (HI15C0493 para SJH).

Neste estudo, os ratos foram mantidos em uma instalação livre de patógenos específicos do Centro de Pesquisa Animal Yonsei Laboratory da Universidade de Yonsei. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes Korean Food and Drug Administration usando protocolos aprovados pelo Comitê Internacional Animal Care e Uso do Centro de Pesquisa Animal Yonsei Laboratory da Universidade de Yonsei. 1. Preparação de Soluções <ol><li> Preparar 2% de meio RPMI por diluição de soro fetal de bovino (FBS) a 2% e penicilina-estreptomicina a 1% em meio RPMI </li><li> Prepare meios RPMI completo. Para RPMI meios adicionar 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de L-glutamina, e 50 uM de 2-mercaptoetanol. </li><li> Prepare activadas por fluorescência separação de células de tampão (FACS). Para o fazer de modo salina, suplemento de fosfato tamponada (PBS) com 2% de FBS. </li><li> Preparar tampão de isolamento de células T. Para fazê-lo, complementar PBS com 2% de FBS e 2 mM de ethylenediaminetetraaácido cetic. </li></ol> 2. Isolamento de Linfócitos esplénico <ol><li> Remover os baços de ratinhos ingénuos ou CL13 LCMV-infectadas, tal como descrito anteriormente 19 e colocá-los em 60 mm x 15 mm de placas de Petri contendo 10 ml de 2% de meio RPMI. Nota: Neste estudo experiências, de 5 a 6 semanas de idade C57B1L / 6J ratinhos fêmea receberam 2 x 10 6 unidades formadoras de placas (pfu) do LCMV CL13 através de injecção intravenosa através da veia da cauda. Sacrificar os ratinhos no dia 16 pós-infecção (16 d pi) 25. camundongos normais analisar ge-combinados foram no mesmo dia. </li><li> Coloque um filtro de células para um tubo de 50 ml e lavado com 2 ml de 2% de meio RPMI. Colocar o baço no filtro celular de 70 ^ m e moer usando o êmbolo de uma seringa. Lavar o filtro de células com 2 ml de 2% meio RPMI e removê-lo do tubo de 50 ml. </li><li> Encher o tubo com 2% de meio RPMI e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender osedimento celular em 1 ml de tampão de lise ACK. Incubam-se as amostras à temperatura ambiente (TA) durante 5 min. NOTA: O volume de tampão de lise ACK indicado acima é para um baço. Ampliar o volume de conformidade para as amostras de baço agrupadas. </li><li> Encher o tubo com 2% de meio RPMI e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células a uma densidade de 1 x 10 7 células / ml em meio RPMI completo. NOTA: Para a contagem de células vivas, células mancha com azul de tripano e contar apenas as células que não estão manchadas usando hemocitômetro viver. </li></ol> 3. A fenotipagem de Esplênica T convencional (T conv) e células T reg NOTA: antes do isolamento das células T reg, analisar o fenótipo dos linfócitos do baço isoladas a partir de murganhos naive ou infectadas por coloração das células com anticorpos diferentes e analisadas por citometria de fluxo. <ol><li> Transferir 50 uL das células(5 x 10 5 células) no total de linfócitos do baço em cada poço de uma nova placa de 96 poços de fundo em U e adicionar 150 ul de tampão de FACS por poço. Centrifuga-se a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante. Agita-se a pelete de células e adicionar 200 ul de tampão de FACS por poço. Centrifuga-se a 300 xg durante 2 min a 4 ° C (2 vezes). </li><li> Prepara-se o cocktail de anticorpos para marcadores de superfície celular de coloração em 50 ul de tampão de FACS por poço com os seguintes anticorpos e reagentes. corante violeta anti-CD4, anti-CD25 corante verde, anti-DP-1 de corante violeta, anti-CD8-PerCP Cy5.5 corante reagente de detecção e viabilidade celular perto do infravermelho (IR) corante reactivo fluorescente. NOTA: Para analisar melhor o fenótipo de células T ativadas reg, anti-CD103 23,25 podem ser adicionados para a coloração de superfície celular marcador. </li><li> Ressuspender o sedimento celular com 50 ul de coquetel de anticorpo por poço. Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C. Lavar as células duas vezes comtampão FACS por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. </li><li> Após o passo de lavagem final, decanta-se o sobrenadante e as células fixar durante 20 minutos no escuro a 4 ° C com 100 ul de tampão de fixação preparados de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Lavar as células duas vezes com o tampão de lavagem permeabilização (preparado de acordo com o protocolo do fabricante) por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. </li><li> Preparar a solução de anticorpos para a coloração intracelular Foxp3, e ressuspender o sedimento de células com 50 uL de solução de anticorpo anti-Foxp3. NOTA: Para analisar melhor os fenótipos dos conv T e células T reg, anti-CTLA podem ser adicionados nesta etapa. </li><li> Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C e repetir o passo 3.6. Após o passo de lavagem final, ressuspender o sedimento celular em 200 uL de tampão de SCAF e analisar o fenótipo das células por citometria de fluxo 25. </li><li> Portão da popula de células vivasção. Para a análise dos fenótipos de células T conv durante a infecção LCMV CL13, examinar a frequência de Foxp3 - PD-1 + células entre as células CD4 + ou T CD8 +. NOTA: Com base nos resultados experimentais, a percentagem de Foxp3 - PD-1 + é mais do que 50% em populações de células CD4 + e CD8 + aos 16 d pi com LCMV CL13. <ol><li> Para analisar a freqüência e fenótipos de células T reg, analisar as frequências de Foxp3 + ou Foxp3 + PD-1 + células entre as células T CD4 +. NOTA: Com base nos resultados experimentais, a percentagem de Foxp3 + ou + PD-1 + células Foxp3 é mais do que 20% da população de células T CD4 +, respectivamente. </li></ol></li></ol> 4. Isolamento de células reg CD4 + CD25 + NOTA: Os volumes de todos os reagentes indicados a seguir são para umao número inicial de células de 1 x 10 7 esplenócitos totais. <ol><li> Prepare as células como descrito na seção 2, utilizando camundongos cronicamente infectados ingênuas e LCMV. Lavam-se as células por adição de 10 ml de tampão de isolamento de células T. Centrifuga-se a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente o sedimento celular em 40 ul de tampão. </li><li> Para o enriquecimento de células T CD4 + utilizando o sistema de separação magnética de células, adicionar 10 ul de coquetel de biotina-anticorpo e misturar bem. Incubar durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 30 ul de tampão, 20 ul de anti-biotina micro-esferas para marcação das células não-T CD4 + e 10 ul de anticorpo CD25-PE para marcação fluorescente de células CD25 +. Misturar bem e incubar durante 15 min no escuro. </li><li> Adicionar 2 ml de tampão e passar as células através de um filtro de 40 | iM de células para um novo tubo de 50 mL para remover os detritos celulares. Lavam-se as células por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente o sedimento celular em 500 ul de tampão, a uma densidade de até 1,25 x 10 8 células. </li><li> Aplicar as células na coluna e recolher as células não marcadas que passam através da coluna. Lava-se a coluna por adição de 2 ml de tampão e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente as isoladas células T CD4 + em 90 ul de tampão. </li><li> Para a marcação magnética de células CD25 +, adicionar 10 ul de microesferas anti-PE, misturar bem e incubar durante 15 min no escuro a 4 ° C. </li><li> Adicionar 2 ml de tampão e lava-se as células por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente o sedimento celular em 500 ul de tampão, a uma densidade de até 1 x 10 8 células. </li><li> Para enriquecer as células reg CD4 + CD25 + T, se aplicam as células para a coluna para a selecção positiva, e lava-se a ColumN pela adição de 2 ml de tampão. Repetir a lavagem três vezes. </li><li> Quando a coluna está vazio após o passo de lavagem final, adicionar 1 ml de tampão para a coluna, e expulsar o magneticamente marcada CD4 + CD25 + usando o êmbolo. </li><li> Repita os passos de 4,8-4,9 para melhorar a pureza das células CD4 + reg CD25 + isoladas. Lavam-se as células com tampão de SCAF por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células isoladas reg CD4 + CD25 + a uma concentração de 2 X 10 6 células / ml em meio RPMI completo. </li><li> Para verificar a pureza das células isolado reg-CD4 + CD25 +, utilizar 2 x 10 5 células a partir de células totais os reg isolado-CD4 + CD25 +. Corar as células com 50 uL de tampão de SCAF contendo anti-CD4-FITC e a viabilidade celular reagente de detecção IV próximo corante reactivo fluorescente. NOTA: CD25 já foi marcado com PE durante o isolamento. </li><li> Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C. Lavam-se as células com tampão de SCAF por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Após a lavagem, ressuspender o sedimento celular em 100 uL de tampão de SCAF e verificar a pureza por citometria de fluxo. </li><li> Portão da população de células vivas. Para analisar a pureza das células T reg, confirmar a percentagem de células CD4 + CD25 +. NOTA: Com base nos resultados experimentais, a percentagem de células CD4 + CD25 + purificadas entre as células é superior a cerca de 80%. </li></ol> 5. Isolamento de células T CD8 + e marcação de células T CD8 + NOTA: Os volumes de todos os reagentes indicados a seguir são para um número de células de partida de 1 X 10 7 esplenócitos totais. <ol><li> Prepare células como descrito na seção 2, utilizando camundongos normais. Lavam-se as células por adição de 10 ml de lustre isolamento de células Ter. Centrifuga-se a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante completamente, e ressuspender o sedimento celular em 40 ul de tampão. </li><li> Para o isolamento de células T CD8 + utilizando o sistema de separação magnética de células, adicionar 10 ul de coquetel de biotina-anticorpo para a marcação de células não-T CD8 + e misturar bem. Incubar durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 30 ul de tampão e 20 ul de microesferas anti-biotina. Misturar bem e incubar durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Aplicar as células na coluna e recolher as células não marcadas que passam através da coluna. Lava-se a coluna por adição de 2 ml de tampão três vezes. </li><li> Centrifuga-se a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente os isolados de células T CD8 + em 2 ml de tampão. </li><li> Para verificar a pureza das células isoladas, preparar 50 ul de solução de anticorpo em tampão de FACS. Ressuspender as 2 x 10 5 células entre isolado CD8 + T celLS em 50 ul de solução de anticorpo. NOTA: Para preparar solução de anticorpo, adicione anti-CD8 FITC, e reagente de detecção de viabilidade celular (fluorescente near-IR corante reativo) em tampão FACS. </li><li> Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C. Lavam-se as células com tampão de SCAF por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Após a lavagem, ressuspender o sedimento celular em 100 ul de tampão de FACS, e verificar a pureza das células por citometria de fluxo. </li><li> Portão da população de células vivas. Para controlar a pureza das células T CD8 +, confirmar a percentagem de células T CD8 +. NOTA: Com base nos resultados experimentais, a percentagem de células CD8 + purificadas é entre células ao longo de cerca de 90%. </li><li> Adicionar PBS para as células T CD8 + isoladas. Centrifuga-se a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante. Ressuspender as células T CD8 + isoladas a uma concentração de 1 x 10 7 células / ml em PBS. </li><li> Para identificar o ce CD8 + Tlls para o ensaio de supressão in vitro, dilui-se a proliferação celular corante de rastreio violeta em PBS para obter uma concentração de 5 | iM à temperatura ambiente. NOTA: Os picos de excitação e de emissão aproximadas do corante de rastreio violeta proliferação de células utilizado no estudo são 405 e 450 nm, respectivamente. </li><li> Misture bem volumes iguais de proliferação celular corante de rastreio violeta (5 uM) e suspensão de células (1 x 10 7 células / ml de células T CD8 +) em um tubo de 15 ml, e incuba-se a 20 min a 37 ° C. Vortex do tubo a cada 10 min. </li><li> Encher o tubo com frio meio RPMI completo, e deixar o tubo durante 10 minutos à TA. Centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante completamente, e voltar a suspender as células a uma concentração de 2 X 10 6 células / ml com meio RPMI pré-aquecido completas. Incubam-se as células durante 15 minutos à TA. </li></ol> 6. Configurar o Ensaio In Vitro Supressão Usando CD4 + CD25 + T &lt;sub&gt; reg e células T CD8 + <ol><li> Para preparar anti-CD3 / esferas revestidas com CD28, transferir o volume apropriado de contas magnéticas para um tubo de 15 ml (2,5 ul / 1 x 10 5 células). Adicionar um volume igual de PBS e misturar. Lavar por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Dilui-se a contas magnéticas em meio completo (50 uL / ​​poço). </li><li> Alíquota de 50 ul de células reg CD4 + CD25 + por poço da placa de 96 poços de fundo em U (1 x 10 5 células / poço). Adicionar 50 ul de células T CD8 + como resposta T (respectivamente t) células por poço (1 x 10 5 células / poço). Adicionar 50 ul de anti-CD3 / esferas revestidas com CD28 diluído em por poço. NOTA: Nesta etapa, etiqueta e configurar poços de controlo da seguinte forma: &quot;Somente não estimulada de células CD8 + T&quot; sem anti-CD3 / esferas revestidas com CD28; &quot;Única célula T CD8 +&quot; com anti-CD3 / CD28-esferas revestidas; Apenas &quot;células T CD8 +&quot;Com anti-CD3 / esferas revestidas com CD28;&quot;. Cell Reg t apenas &quot;com anti-CD3-/ esferas revestidas com CD28 células reg T pode ser diluída por meio completo e co-cultivadas com células T resp numa proporção diferente de T células resp: células T reg (1: 0,25-1: 1). </li><li> Adicionar 50 ul ou volume adequado de suportes em todas as cavidades para o volume total de 200 ul. Cobrir a placa com uma folha e incubar numa incubadora de CO 2 a 37 ° C durante 72 h. </li></ol> 7. Análise de T CD8 + de Proliferação Celular e Produção de citocinas a partir de células T CD8 + <ol><li> Para a análise de produção de citocinas, após 3 dias de cultura, separar o sobrenadante de cada poço para outra placa e executar ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). NOTA: O sobrenadante pode ser dividido em alíquotas e armazenado a -70 ° C. Nesta experiência, placa revestida com anticorpo anti-ratinho de IFN-γ foi utilizado para detectar o IFN-γ acordo produçãoing com o protocolo do fabricante s. Para determinar a produção de IFN-γ de proliferação de células T CD8 + em um nível de uma única célula, coloração de citocinas intracelulares pode ser realizada. </li><li> Depois de separar o sobrenadante de cada poço, lavar a placa que contém as células com tampão de SCAF e centrifugar a 300 xg durante 2 min a 4 ° C (3 vezes). </li><li> Após a lavagem, desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento celular com 50 ul de mistura de anticorpos para a coloração de células T CD8 + proliferaram. Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C. NOTA: Para preparar cocktail de anticorpos, adicione anti-CD4 FITC, anti-CD8 PerCP-Cy5.5 e reagente de detecção de viabilidade celular (fluorescente near-IR corante reativo) em tampão FACS. NOTA: Os anticorpos contra vários marcadores tais como CD44 ou CD69 podem ser combinados com outros anticorpos para confirmar a activação de células T CD8 +. Lembrar que as células T CD8 + que já foram rotulados com a proliferação de células de rastreamento violet corante no Passo 5,10. </li><li> Lavar duas vezes por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Após o passo de lavagem final, desprezar o sobrenadante, e fixar as células durante 20 minutos no escuro a 4 ° C com 100 ul de tampão de fixação. </li><li> Lavar duas vezes por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Ressuspender as células com 200 uL de tampão de SCAF e medir a proliferação de células T CD8 + marcadas com corante de violeta de seguimento de proliferação celular por citometria de fluxo. <ol><li> Portão de a população de células T CD8 + entre as células vivas. Medem-se as percentagens de células divididas e não divididas de acordo com a diluição do corante de rastreio violeta a proliferação celular e a diluição de células T CD8 + de acordo com a seguinte equação. % De Inibição = [(% de células T CD8 + proliferaram na ausência de células T reg -% de células T CD8 + proliferaram na presença de células T REG) / (% de células T CD8 + em proliferarama ausência de células T REG)] x 100. Além disso analisar os dados usando o software de citometria de fluxo 25. </li></ol></li></ol>

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</ol>

S.-J.H. tem uma patente e recebe royalties de patentes relacionados à via PD-1. Os demais autores não têm conflitos de interesse financeiros.

Embora apenas um pequeno número de células T reg existir em ratos e seres humanos, é importante compreender a sua função que desempenham um papel crucial na regulação da resposta imunitária e manutenção da tolerância imunológica. Os números e supressivas funções de T reg células aumenta durante uma infecção pelo vírus crônica 15-20, bem como a progressão do câncer 13,14. Isto é provavelmente devido à estimulação com antigénio continuou. Para avaliar a células T reg ...

As células T reguladoras (T reg) expressam caixa de forkhead P3 (Foxp3) como um fator de transcrição para o seu desenvolvimento e função 1. Além disso, as células reg T expressam várias outras moléculas, tais como CD25 2, gene de linfócitos-activação 3 (LAG-3) 3, tumor do receptor do factor de necrose induzida por glucocorticóides 4, e citotóxica-T-linfócito proteína associada 4 (CTLA-4) 5 na sua superfície ou a região intracelular. Durante a infecção crónica com vários tipos de agentes patogénicos, tais como vírus, bactérias 6,7 8,9 e parasitas 10-12, ou no curso de desenvolvimento de câncer 13,14, as células T reg tornar-se diferenciado em células ativadas, exibindo função supressora reforçada As células alvo efetoras CD4 + e CD8 +. Um número de estudos sugerem que as células T reg expandido e de contribuir para os respons de células T CD8 + com deficiênciae durante amigo retrovírus (FV) infecção por 15-17. As células T-reg induzidas FV inibir IFN-γ ou expressão granzima B e reactividade citotóxica de células T CD8 + 15-17. Além disso, num modelo de infecção pelo vírus herpes simplex, foi relatado que a depleção de células T CD4 + reg CD25 + resultou na expansão das células T CD8 + específicas do vírus e lesões graves no tecido por infiltração de células T CD4 + imunopatogênicos 18-20. Os ratinhos infectados cronicamente com o clone 13 de estirpe do vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV CL13) 21-24 têm sido amplamente utilizados para caracterizar o fenótipo e função de células T efectoras (T) e células eff reg T durante a infecção crónica de vírus. Durante a infecção LCMV persistente, células eff específico do vírus T progressivamente perdem a sua função efetora e tornar-se células esgotadas T (T exh). Por outro lado, tcélulas reg reforçar a sua capacidade de suprimir a resposta de células específicas do vírus T 25. A diminuição da capacidade de funcionamento das células eff T pode ser explicada por vários factores, tais como sobre-regulação de receptores inibitórios sobre células eff T, função alterada das células apresentadoras de antigénio, da produção de citocinas imunorreguladoras, e frequência aumentada ou função aumentada de reg t As células 26. Entre os factores envolvidos na supressão de células T, a morte celular programada proteína-1 (DP-1) -expressing EXH células T e células T reg têm sido amplamente consideradas como características de persistência do antigénio e ambiente supressiva. Recentemente, relatou-se que o bloqueio da via de DP-1 e de ablação de células T reg levar a função de células T aumentada e diminuição da carga virai durante a infecção crónica por LCMV 27. Além disso, as células T reg são activadas durante a infecção crónica de ratos com LCMV 23,25 </sup&gt; e sua função supressora é reforçada 25. DP-1 é altamente expressa em células T reg, bem como células T de escape, e o nível de DP-1 expressa por células T reg correlaciona-se com a força da sua função supressora de inibir a proliferação de células T 25. Aqui, nós descrevemos um método para comparar as características de células T activadas reg isolados a partir de camundongos infectados com LCMV CL13 e as células T em repouso reg isoladas a partir de ratinhos ingénuos. Além disso, vamos explicar uma série de processos para separar as células T activadas e reg examinar o seu fenótipo ex vivo, bem como medir a sua actividade supressora in vitro.

<table><tbody><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td><td>RM4-5</td><td>BD Biosciences</td><td>553047</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td></tr><tr><td>Placas</td><td></td> de cultura de tecidos U-Bottom <td>BD Biosciences</td><td>353077</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td> de fixação <td>BD Biosciences</td><td>554655</td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD25</td><td>7D4</td><td>BD Biosciences</td><td>553072</td></tr><tr><td>Filtro de células, 70 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td></tr><tr><td>Filtro de células, 40 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)</td><td>29F.1A12</td><td>BioLegend</td><td>135217</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4</td><td>RM4-5</td><td>Biolegend</td><td>100547</td></tr><tr><td>APC Anti-Mouse/Rato Foxp3&nbsp;</td><td>FJK-16s</td><td>eBioscience</td><td>17-5773</td></tr><tr><td>Foxp3 / Conjunto de tampão de coloração de fator de transcrição</td><td>eBioscience</td><td>00-5223</td>PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081 Mouse IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606 RPMI 1640 GE Life Sciences SH30027 PBS (1x)<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30256</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td></td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td></tr><tr><td>L-Glutamina, solução de 200 mM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td>25030</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, 10.000 U/ml</td><td></td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10378-016</td></tr><tr><td>Kit de coloração de células mortas por infravermelho próximo corrigível LIVE/DEAD</td><td>Life technologies</td><td>L-34975</td>CD8a+ Kit de isolamento de células T, mouse Miltenyibiotec 130-104-075 CD4+ CD25+ Kit de isolamento de células T reguladoras, mouse Miltenyibiotec 130-091-041 Colunas de separação MACS, colunas LD <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-042-901</td></tr><tr><td>Colunas de Separação MACS, colunas</td><td></td> LS <td>Miltenyibiotec</td><td>130-042-401</td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M (pH 8.0)</td><td></td><td>Promega</td><td>V4231</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td></td><td>Sigma Life Science</td><td>M7522</td></tr><tr><td>Soro</td><td></td> Bovino Fetal <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30919.03</td></tr><tr><td>Kit de Proliferação</td> <td>de Células Violetas CellTrace</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34557</td></tr><tr><td>BD Canto II flowcytometer</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td></td><td>TreeStar</td><td></td></tr><tr><td>Hematocytomer</td><td></td><td>Marienfeld superior</td><td></td></tr></tbody></table>

fenotípica e análise funcional de células reguladoras t ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

As células T reguladoras (Treg), que expressam Foxp3 como um factor de transcrição, são subconjuntos de células T CD4 +. Células T reg desempenham um papel crucial na tolerância imunitária e a manutenção da homeostasia através da regulação da resposta imunitária. A função primária de células T REG é o de suprimir a proliferação de células T (FEP) T efectoras e a produção de citocinas tais como IFN-γ, TNF-α, e IL-2. Tem sido demonstrado que a capacidade das células T reg &#39;para inibir a função das células T ef é aumentada durante a infecção persistente de agentes patogénicos e o desenvolvimento do cancro. Para esclarecer a função das células T reg sob repouso ou inflamadas condições, uma variedade de ensaios in vitro utilizando células de supressão de reg do mouse ou T humana foram concebidas. O principal objetivo deste estudo é desenvolver um método para comparar as diferenças de fenótipo e função supressora entre descanso e reg T ativadascélulas. Para isolar as células T ativadas reg, camundongos foram infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV) clone 13 (CL13), a tensão crônica de LCMV. Células T reg isoladas a partir do baço de ratinhos infectados por LCMV-CL13 exibiu tanto o fenótipo activada e actividade supressora melhorada em comparação com as células em repouso reg T isoladas a partir de ratinhos ingénuos. Aqui, descrevemos o protocolo básico para ex vivo análise de fenótipo para distinguir células T ativadas reg de descansar células T reg. Além disso, descreve-se um protocolo para a medição da actividade supressora de células T reg totalmente activadas.

Geramos camundongos com infecção pelo vírus persistente injetando-os com 2 x 10 6 pfu de LCMV CL13 por via intravenosa. Para investigar as alterações fenotípicas em células reg T e células T conv durante a infecção crónica de vírus, linfócitos do baço obtidas a partir de ratinhos não afectados e infectados foram coradas com anticorpos diferentes e analisadas por citometria de fluxo. Aos 16 d pi, PD-1 foi regulada positivamente em ambos Foxp3 - ...

Aqui, descrevemos um protocolo para analisar o fenótipo de células T reguladoras (Treg) isoladas de camundongos infectados pelo vírus da coriomeningite linfocítica ingênua e crônica. Além disso, fornecemos um processo para avaliar a atividade supressora das células Treg.

Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a função supressora in vitro de linfócitos T reguladores isolados de camundongos infectados com vírus crônicos. Este método pode ajudar a responder perguntas sobre o fenótipo e a função supressora in vitro de linfócitos T reguladores ativados durante uma infecção crônica por vírus. Esta técnica pode avaliar o efeito direto dos linfócitos T reguladores sobre o indivíduo com resposta positiva aos linfócitos T in vitro.Essa é uma grande vantagem dessa técnica. Comece transferindo cinco vezes dez elevado à quinta linfócitos esplênicos totais em 50 µL de tampão FACS para cada poço de uma nova placa de 96 poços com fundo em U, seguido por 150 µL de tampão FACS. Centrifugue a placa e descarte o sobrenadante.Em seguida, agite os pellets celulares e lave as células mais duas vezes com 200 microlitros de tampão FACS por poço. Após a segunda lavagem, re-suspenda os pellets em 50 microlitros de coquetel de anticorpos por poço, durante 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as células duas vezes em tampão FACS e despreze o sobrenadante.Em seguida, fixe as células por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius com 100 microlitros de tampão de fixação, seguido por duas lavagens com tampão de lavagem para permeabilização. Após a segunda lavagem, re-suspenda as células em 50 microlitros de anticorpo anti-FOXP3. Para preparar as microesferas revestidas com anti-CD3 e CD28, transfira o volume apropriado de microesferas magnéticas para um tubo de 15 mililitros e adicione um volume igual de PPS.Agite suavemente a solução por pipetagem e centrifugue as microesferas magnéticas. Ao final da lavagem, descarte o sobrenatante e dilua as microesferas em 50 microlitros de meio completo por poço. Em seguida, plaque 50 microlitros de uma vez dez à quinta células T reguladoras CD4 positivas CD25 positivas por poço em uma placa de fundo redondo de 96 poços, seguido por 50 microlitros de uma vez dez à quinta células T responsivas CD8 positivas por poço.Quando todas as células tiverem sido semeadas, adicione 50 microlitros das microesferas recobertas com anti-CD3 e CD28 diluídas a cada poço e acrescente até 50 microlitros de meio para ajustar o volume total de cada poço a 200 microlitros. Em seguida, cubra a placa com papel alumínio e coloque-a a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por 72 horas. Para analisar a produção de citocinas pelas células T CD8 positivas, após três dias de cultivo, transfira os sobrenadantes para outra placa de 96 poços e analise os sobrenadantes por ELISA, de acordo com as instruções do fabricante.Para analisar a proliferação de linfócitos T CD8 positivos, lave a placa de células com tampão FACS três vezes. Em seguida, reconstitua os pellets em 50 microlitros de um coquetel de anticorpos apropriado contra linfócitos T CD8 positivos proliferados, durante 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius. Ao final da incubação, lave as células duas vezes em tampão FACS e fixe-as por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius com 100 microlitros de tampão de fixação.Por fim, lave as células mais duas vezes em tampão FACS e reconstitua os pellets em 200 microlitros de tampão FACS. Em seguida, meça a porcentagem de proliferação de células T CD8 positivas duplamente marcadas com Phylate por citometria de fluxo. Em linfócitos esplênicos obtidos de camundongos ingênuos e infectados, o PD-1 é especificamente regulado para cima tanto em células CD4 positivas convencionais FOXP3 negativas quanto em células CD8 positivas FOXP3 negativas de camundongos infectados com o clone 13 do LCMV.A frequência de células T reguladoras duplamente positivas para FOXP3 e CD4 é duas vezes maior em camundongos infectados com o clone 13 do LCMV do que em camundongos ingênuos, sendo que a maioria das células duplamente positivas para FOXP3 e CD4 também exibe um fenótipo ativado com alta expressão de PD-1. As células T efetoras CD8 positivas podem ser separadas com sucesso sem contaminação significativa por outras células imunes. Após o isolamento das células T reguladoras, pode-se obter uma população dominante de células T CD4 positivas CD25 positivas com pureza superior a 80 por cento.A estimulação de células T reguladoras e respondedoras isoladas por microesferas revestidas com anti-CD3 e CD28 resulta na inibição das células T respondedoras CD8 positivas de maneira dependente da dose. De fato, quando as células T respondedoras CD8 positivas são co-cultivadas com células T reguladoras crônicas na proporção de um para um, a proliferação das células T respondedoras CD8 positivas é significativamente inibida. A produção de interferon gama pelas células T respondedoras CD8 positivas também é significativamente inibida quando as células T respondedoras CD8 positivas são co-cultivadas com células T reguladoras ativadas de camundongos cronicamente infectados, em comparação com a co-cultura com células T reguladoras em repouso de camundongos ingênuos.Descobrimos que esta técnica pode ser concluída em 80 horas se for realizada corretamente. Enquanto você estiver realizando este procedimento, é importante lembrar de usar células T reguladoras recém-isoladas imediatamente após o seu isolamento. Após esse desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da medicina explorarem a função das células T reguladoras em doenças inflamatórias crônicas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar um procedimento de supressão in vitro de linfócitos T reguladores, utilizando um sistema de co-cultivo de linfócitos T reguladores e responsivos.

phenotypic-functional-analysis-activated-regulatory-t-cells-isolated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um protocolo rápido, simples e de baixo custo para a geração de doador-derivado multivirus específico CTLs (rctl) para infusão de células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH) destinatários em risco de desenvolver infecções CMV, EBV ou Adv. Este processo de fabricação é compatível com GMP e deve garantir a mais ampla implementação de T-cell imunoterapia além de centros especializados.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Adenoviral de transferência do gene em células T CD4 naive com a expressão transgénica do receptor de adenovirus Coxsackie possibilita a análise molecular da diferenciação de células T...

Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Foi desenvolvido um ensaio in vitro para investigar o papel das vias de imunorreguladores na regulação da secreção de citoquinas por células T CD4 + específicas para o HIV.

In Vitro Ensaio para avaliar o impacto da imunorreguladora Pathways on específica para o HIV CD4 T efetoras celular Função

Os macrófagos são células plasmáticas do sistema hematopoiético que desempenham um papel crucial na imunidade protetora e na homeostase. Neste relatório , descrevemos técnicas otimizadas in vitro para caracterizar fenotípica e funcionalmente macrófagos reguladores infiltrantes de enxerto que se acumulam no órgão transplantado em condições tolerogênicas.

Caracterização funcional de macrófagos regulatórios que inibem a imunidade reativa ao enxerto

Os linfócitos são os principais atores nas respostas imunes adaptativas. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação de linfócitos para determinar as funções fisiológicas das moléculas desejadas na ativação de linfócitos in vitro e in vivo. Os procedimentos experimentais descritos são adequados para comparar as capacidades funcionais entre linfócitos controle e geneticamente modificados.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

Muitos sistemas experimentais foram utilizados para compreender os mecanismos de regulação do desenvolvimento e função de células T numa resposta imunitária. Aqui uma abordagem genética utilizando transdução retroviral é descrito, que é económico, eficiente tempo, e, o mais importante, altamente informativos na identificação de vias reguladoras.

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

Este artigo descreve protocolos de avaliação da resposta Tfh e GC B no modelo de camundongos de infecção por vírus influenza.

Avaliação de células auxiliares tolas e resposta do centro germinal durante a infecção pelo vírus da influenza A em camundongos

Este artigo apresenta dois protocolos otimizados para examinar células imunes residentes e derivadas periféricas dentro do sistema nervoso central, incluindo cérebro, medula espinhal e meninges. Cada um desses protocolos ajuda a determinar a função e a composição das células que ocupam esses compartimentos em condições de estado estacionário e inflamatório.

Isolando Tecidos do Sistema Nervoso Central e Meninges Associadas para Análise a Jusante de Células Imunes

O presente estudo apresenta protocolos para avaliar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus e manipular a expressão gênica nessas células.

Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

O estudo demonstra o papel da pele na modulação das respostas imunes em camundongos por meio da imunização epicutânea (EC). A imunização contra CE com um antígeno proteico pode suprimir as respostas imunes na hipersensibilidade de contato ou reverter a supressão induzida pela pele quando combinada com padrões moleculares associados a patógenos. A imunização contra a CE mostra-se promissora como uma abordagem eficaz e sem agulha para a imunoterapia.

Modelo Murino de Imunomodulação Induzida por Epicutâneo

Esse protocolo fornece uma estratégia de co-cultura in vitro para investigar os efeitos das células T reguladoras na proliferação e diferenciação das células T efetoras.

In Vitro Análise Funcional de Células T Reguladoras: Foco na Proliferação e Diferenciação

Aprenda a avaliar a função supressora in vitro de células T reguladoras isoladas de camundongos infectados com vírus da coriomeningite linfocítica crônica. Este método permite analisar o fenótipo e a atividade imunorreguladora.

Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica (Vídeo) | JoVE Journal

Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

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