Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a função supressora in vitro de células T reguladoras, isoladas de camundongos infectados por vírus crônicos. Este método pode ajudar a responder a perguntas sobre o fenótipo e a função supressora in vitro das células T reguladoras ativadas durante uma infecção viral crônica. Esta técnica pode avaliar o efeito direto das células T reguladoras no indivíduo com uma resposta positiva às células T in vitro.

Esta é uma grande vantagem desta técnica. Comece transferindo cinco vezes dez para o quinto total de linfócitos esplênicos em 50 microlitros de tampão facs para cada poço de uma nova placa de poço U inferior 96, seguido por 150 microlitros de tampão facs. Centrifugue a placa e descarte o sobrenadante.

Em seguida, agite os pellets de células e lave as células mais duas vezes em 200 microlitros de tampão facs por poço. Após a segunda lavagem, ressuspenda os pellets em 50 microlitros de coquetel de anticorpos por poço, por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as células duas vezes em tampão facs e decanta o sobrenadante.

Em seguida, fixe as células por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius com 100 microlitros de tampão de fixação, seguido de duas lavagens com tampão de lavagem de permeabilização. Após a segunda lavagem, ressuspenda as células em 50 microlitros de anticorpo anti-FOXP3. Para preparar os grânulos revestidos anti-CD3 CD28, transfira o volume apropriado de grânulos magnéticos para um tubo de 15 mililitros e adicione um volume igual de PPS.

Misture suavemente a solução pipetando e centrifugue as esferas magnéticas. Ao final da lavagem, descarte o sobrenadante e dilua as esferas em 50 microlitros de meio completo por poço. Em seguida, semeie 50 microlitros de uma vez dez elevado ao quinto CD4 positivo CD25 células T reguladoras positivas por poço em uma placa inferior U de 96 poços, seguido por 50 microlitros de um vezes dez elevado ao quinto CD8 positivo

Quando todas as células tiverem sido plaqueadas, adicione 50 microlitros de esferas revestidas anti-CD3 CD28 diluídas a cada poço e adicione até 50 microlitros de meio para elevar o volume total de cada poço até 200 microlitros. Em seguida, cubra a placa com papel alumínio e coloque-a a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por 72 horas. Para analisar a produção de citocinas de células T CD8 positivas, após três dias de cultivo, transferir os sobrenadantes para outra placa de 96 poços e analisar os sobrenadantes por ELISA, de acordo com as instruções do fabricante.

Para analisar a proliferação das células T CD8 positivas, lave a placa de células com tampão facs três vezes. Em seguida, ressuspenda os pellets em 50 microlitros de um coquetel de anticorpos apropriado contra células T CD8 positivas proliferadas por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave as células duas vezes em tampão facs e fixe-as por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius com 100 microlitros de tampão de fixação.

Finalmente, lave as células mais duas vezes em tampão facs e ressuspenda os pellets em 200 microlitros de tampão facs. Em seguida, medir a porcentagem de proliferação de células T CD8 positivas desmarcadas com filato por citometria de fluxo. Em linfócitos esplênicos obtidos de camundongos virgens e infectados, o PD-1 é especificamente regulado positivamente em células CD4 positivas positivas para FOXP3 negativas convencionais e CD8 positivas negativas para FOXP3 de camundongos infectados com o clone 13 do LCMV.

A frequência de células T reguladoras CD4 positivas para FOXP3 é duas vezes maior em camundongos infectados com o clone 13 do LCMV do que em camundongos virgens, com a maioria das células CD4 positivas para FOXP3 também exibindo um fenótipo alto de PD-1 ativado. As células T CD8 positivas podem ser separadas com sucesso sem contaminação significativa por outras células imunes. Após o isolamento regulatório de células T, uma população dominante de células T CD25 positivas para CD4 positivas com mais de 80% de pureza pode ser obtida.

A estimulação de células T reguladoras e respondedoras isoladas por esferas revestidas com anti CD3 CD28 resulta na inibição de células T CD8 positivas de maneira dependente da dose. De fato, quando as células T CD8 positivas são co-cultivadas com células T reguladoras crônicas na proporção de um para um, a proliferação de células T CD8 positivas é significativamente inibida. A produção de gamainterferon por células respondedoras CD8 positivas também é significativamente inibida quando as células T CD8 positivas são co-cultivadas com células T reguladoras ativadas de camundongos cronicamente infectados, em comparação com a co-cultura com células T reguladoras em repouso de camundongos virgens.

Descobrimos que essa técnica pode ser concluída em 80 horas se for executada corretamente. Enquanto você estiver tentando este procedimento, é importante lembrar de usar células T reguladoras recém-isoladas imediatamente após seu isolamento. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de medicina explorarem a função das células T reguladoras em uma doença inflamatória crônica.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar um procedimento de supressão de células T reguladoras in vitro, usando um sistema de co-cultura de células T reguladoras e respondedoras.