Totalmente dispositivo automático centrífugo microfluídicos para a detecção de proteínas Ultrasensitive de Sangue Total
16 de abril de 2016
Este protocolo demonstra como atingir a sensibilidade de detecção femto molar de proteínas em 10 μL de sangue total em 30 min. Isso pode ser alcançado usando esteiras nanofibrosas eletrofiadas integradas em um lab-on-a-disc, que oferece alta área de superfície, bem como mistura e lavagem eficazes para melhorar a relação sinal-ruído.
O objetivo geral deste procedimento é melhorar a sensibilidade de detecção de ELISA usando nanofibras fiadas naturais. Este vídeo demonstra como obter a sensibilidade de detecção femtomolar de proteínas em 10 microlitros de amostras de sangue total em 30 minutos. Em uma plataforma lab-on-a-disc, a força centrífuga é usada para transferir o líquido através das câmaras, e o processo total é totalmente automatizado.
A sensibilidade de detecção pode ser altamente aprimorada pela integração de nanofibras. No entanto, o problema era que a nanofibra é muito frágil e difícil de manusear. Neste vídeo, apresentamos um processo simples para anexar tapetes de nanofibra de dióxido de titânio frágeis em um disco de plástico.
Para fabricar tapetes de nanofibra de dióxido de titânio em substrato de silicone por eletrofiação, o substrato de silicone é primeiro silanizado, revestido com PDMS e pré-curado. Um tapete de nanofibra é então transferido para este PDMS pré-moldado e este produto é perfurado para produzir uma peça circular para fixação. Cubra a câmara de reação com uma gota de PDMS como adesivo e prenda a peça circular no fundo da câmara.
Em seguida, catalise o PDMS no forno. Por fim, monte as camadas do disco em um dispositivo completo para ELISA. Esta técnica de transferência de nanofibras nos permite utilizar a alta área de superfície das nanofibras para bioanálise.
O dispositivo microfilítico centrífugo oferece a integração e automação total de todo o processo necessário no ELISA. A principal vantagem dessa técnica sobre outros métodos existentes é que ela pode detectar concentrações femtomolares de proteínas de apenas 10 microlitros de sangue total. Preparar as soluções precursoras conforme descrito no protocolo de ensaio que acompanha a presente comunicação.
Em seguida, carregue a solução no eletrospinner e fabrique as nanofibras por eletrofiação, usando as condições ideais. Quando as esteiras de nanofibra de polímero forem preparadas, calcine-as em um forno sob vácuo. Após a calcinação, os tapetes de nanofibra de dióxido de titânio são finalmente preparados.
Prepare o layout microfilítico usando um software de projeto 3D, como o SOLIDWORKS, e transfira o projeto para a fresadora CNC. Opere a fresadora CNC para fabricar o disco com canais e câmaras. O disco e o tapete de nanofibra agora estão prontos para serem integrados.
Prepare uma câmara de vácuo, substrato de silicone e fluorosilano. Silanize o substrato de silicone com fluorosilano sob vácuo por 30 minutos. Prepare o PDMS convidado preparando o pré-polímero com um agente de cura na proporção de 10 para um e gire a camada sobre o substrato de silicone silanizado a 650 RPM por 60 segundos.
Catalise o PDMS revestido com o wafer silanizado a 65 graus Celsius por 10 minutos para torná-lo adesivo. Agora transfira esses tapetes de nanofibra para o silicone revestido com PDMS, aplicando a pressão apropriada usando um objeto plano, como uma lâmina de vidro. Asse a amostra a 80 graus Celsius por uma hora para curar completamente o adesivo PDMS.
Dispense algumas gotas de etanol nas esteiras de nanofibra presas na camada PDMS e faça um furo de seis milímetros de diâmetro usando um PunchIt. Em seguida, retire os tapetes de nanofibra perfurados presos no PDMS do substrato de silicone. Em seguida, cubra a câmara de reação de ligação no disco com cerca de 20 microlitros de mistura de PDMS e coloque as nanofibras presas no PDMS nas câmaras.
Em seguida, incube o disco integrado de nanofibra a 80 graus Celsius por uma hora. Preparar 1% de volume por volume de solução de GPDES em etanol. Em seguida, trate as nanofibras do disco com plasma de oxigênio.
Dispense 100 microlitros de solução GPDES em cada tapete de nanofibra e incube em temperatura ambiente por duas horas em um recipiente lacrado. Após a incubação, remova a solução GPDES batendo no disco em um limpador. Lave com etanol, retire e leve ao forno a 80 graus Celsius por uma hora.
Após o cozimento, lave com etanol e bata para remover. Repita este processo e seque com um jato de nitrogênio. Para imobilização de anticorpos, dispense a solução diluída de anticorpos capturados.
Mantenha os discos em uma câmara umidificada e incube a 37 graus por quatro horas. Lave a solução restante com tampão de lavagem. Agora, monte o disco usando uma fita adesiva dupla face.
Aplique uma pressão razoável para montar as camadas em um disco completo. Encha as câmaras de reação de ligação com tampão de bloqueio e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Lave duas vezes com tampão de lavagem e guarde o disco a 40 graus Celsius até o uso.
Carregar os reagentes, os tampões de lavagem e 10 microlitros de sangue total nas câmaras de reagentes e amostras. Coloque o disco em uma máquina de visualização personalizada para imunoensaio automatizado. O sistema de visualização contém um rotor conectado a um computador para operação automatizada do disco, juntamente com uma luz estroboscópica e uma câmera CCD para tirar imagens.
Gire o disco a 3.600 RPM por 60 segundos para separar os glóbulos vermelhos. Misture o plasma com os anticorpos de detecção. Transfira a mistura para a câmara de reação integrada com tapete de nanofibra de dióxido de titânio.
Após a imunorreação, lave as nanofibras transferindo o tampão de lavagem para a câmara de reação. Em seguida, transfira a solução de substrato quimioluminescente para a câmara de reação de ligação e incube em modo de mistura por um minuto. Por fim, transferir a solução de substrato reagida para a câmara de detecção.
Quando toda a reação terminar, transfira o disco para um sistema de detecção e leia o sinal quimioluminescente usando um software personalizado. A operação do disco e o sistema de detecção podem ser integrados em uma única plataforma. Ao otimizar a voltagem e o fluorato, foram obtidos tapetes de nanofibras uniformes, conforme mostrado nesta imagem de MEV.
Para otimizar o tempo de cura do PDMS, a força de adesão foi medida. Se fosse muito curto, o tapete de nanofibra era embutido no PDMS ou descascado se fosse muito longo. Após a otimização, o tapete de nanofibra foi fixado de forma estável no PDMS.
A faixa linear para detecção de proteína C-reativa a partir de duas plataformas é mostrada neste gráfico. Usando o laboratório de integridade de nanofibras no disco, conseguimos obter uma sensibilidade de detecção altamente aprimorada da proteína C-reativa de apenas 10 microlitros de soro em 30 minutos. As tecnologias atualmente disponíveis, como o ELISA baseado em placas de 96 poços, exigem um volume de amostra maior e um tempo de detecção mais longo.
No geral, o ELISA baseado em disco integrado de nanofibra mostrou uma ampla faixa dinâmica de seis ordens de magnitude com um limite de detecção de seis femtomol de proteína C reativa. Essa sensibilidade de detecção auxiliada pela alta área de superfície fornecida pela nanofibra integrada no disco excedeu a do ELISA convencional, que foi limitada a 2.000 femtomoles. Depois de assistir a este vídeo, esperamos que você tenha uma boa compreensão de como preparar o dispositivo microfilítico centrífugo, como integrar nanofibras fasais e como realizar a detecção de proteínas usando ELISA.
Esta técnica pode ser útil para detectar proteínas de baixa ligação em uma quantidade muito pequena de amostras biológicas.
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Visão Geral
Este protocolo demonstra como obter sensibilidade de detecção em fentomolar de proteínas em 10 µL de sangue total dentro de 30 minutos. O método utiliza membranas eletrofiadas de nanofibras integradas em uma plataforma laboratório-em-um-disco, melhorando a relação sinal-ruído por meio de mistura e lavagem eficientes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biotecnologia
- Detecção de Proteínas
- Nanotecnologia
Contexto
- O ELISA é um método comum para detecção de proteínas.
- Melhorar a sensibilidade da detecção é crucial para diagnósticos precisos.
- As nanofibras naturais fiadas podem aumentar a sensibilidade, mas são frágeis.
- Sistemas automatizados tipo laboratório-em-um-disco podem agilizar o processo.
Objetivo do Estudo
- Para melhorar a sensibilidade de detecção do ELISA.
- Para demonstrar o uso de nanofibras em um sistema lab-on-a-disc.
- Para fornecer um método para manipular membranas de nanofibras frágeis.
Métodos Utilizados
- Integração de mantas de nanofibras de dióxido de titânio em um disco plástico.
- Uso da força centrífuga para transferir líquidos através das câmaras.
- Automação de todo o processo de detecção.
- Avaliação da sensibilidade de detecção em amostras de sangue total.
Resultados Principais
- Alcançou sensibilidade em nível de femtomolar para detecção de proteínas.
- Demonstrou capacidades eficazes de mistura e lavagem.
- Mos-trou a viabilidade do uso de nanofibras frágeis em uma aplicação prática.
- Validou o processo automatizado para análise rápida.
Conclusões
- A integração de nanofibras aumenta significativamente a sensibilidade da detecção.
- A tecnologia laboratório-em-um-disco oferece uma abordagem promissora para ensaios de proteínas.
- Este método pode ser adaptado para diversas aplicações diagnósticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Essa tecnologia atende à necessidade crítica de detecção ultrassensível de proteínas em amostras clínicas de baixo volume, permitindo a descoberta precoce de biomarcadores a partir de pequenas quantidades de sangue total. Ao integrar nanofibras eletrofiadas em uma plataforma microfluídica centrífuga, ela alcança sensibilidade em nível femtomolar dentro de 30 minutos, melhorando significativamente o limite de detecção em comparação com o ELISA convencional. Esse avanço apoia a validação de alvos e a identificação de compostos iniciais, reduzindo os falsos negativos na triagem de proteínas de baixa abundância, impactando diretamente decisões de desriscamento pré-clínico e de priorização de portfólios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de alvos proteicos de baixa abundância em sangue total, aumentando a confiança nas associações entre alvo e doença.
- Valor Operacional: Reduz o consumo de amostra para 10 µL, permitindo que espécimes clínicos preciosos sejam multiplexados em múltiplos ensaios.
- Valor Preditivo: Limite de detecção no nível femtomolar melhora a relação sinal-ruído, possibilitando quantificação mais confiável de biomarcadores em fluxos de trabalho de descoberta.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece uma plataforma padronizada e automatizada para o desenvolvimento de imunoensaios com manipulação e mistura de fluidos reprodutíveis.
- Valor Operacional: Elimina etapas de pipetagem manual, reduzindo a variabilidade e aumentando a produtividade em campanhas de triagem de anticorpos.
- Prontidão do Ensaio: Permite análises multiplexadas com consumo mínimo de reagentes, facilitando a validação de alvos baseada em painéis.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta e a validação pré-clínica ao permitir a quantificação consistente de proteínas em diferentes tipos e volumes de amostras.
- Redução de Riscos: A alta sensibilidade reduz a probabilidade de perda de sinais farmacocinéticos ou farmacodinâmicos precoces em modelos de doenças.
- Utilidade Pré-clínica: Compatível com volumes sanguíneos de animais pequenos, permitindo estudos longitudinais sem necessidade de amostragem terminal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial da descoberta, apoiando a validação de alvos orientada por hipóteses por meio da detecção quantitativa de proteínas em matrizes clinicamente relevantes.
- Biologia da Descoberta: Facilita a desmistificação mecanicista ao permitir a detecção de biomarcadores específicos de vias no sangue total, melhorando a confiança no alvo.
- Triagem: Oferece desempenho de imunoensaio pronto para automação com dosagem precisa de fluidos e lavagem, essencial para a validação reprodutível de hits.
- Análises: Gera leituras quantitativas quimioluminescentes em seis ordens de magnitude, permitindo comparação precisa da expressão proteica entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Apoia o alinhamento de biomarcadores pela detecção de proteínas clinicamente relevantes (por exemplo, PCR, cTnI) em sangue com processamento mínimo.
- Reutilização Corporativa: O design de laboratório-em-um-disco permite adaptação da plataforma em diferentes imunoensaios, promovendo a padronização de reagentes e fluxos de trabalho.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos por meio de limites de detecção e faixa dinâmica aprimorados.
- Valor Operacional: A automação completa reduz o tempo de manipulação e a variabilidade do usuário, melhorando a reprodutibilidade do ensaio entre diferentes locais.
- Valor Estratégico: Permite decisões de avançar/ou não com base em dados robustos de biomarcadores obtidos de amostras limitadas, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao fornecer quantificação confiável de alvos de baixa abundância já nos estágios iniciais do processo.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em eletrofiação, manipulação de nanofibras e projeto de microfluídica para a fabricação bem-sucedida.
- Depende do acesso a fresagem CNC, tratamento com plasma e equipamentos a vácuo para a preparação do disco e da malha de nanofibras.
- Necessita da padronização dos protocolos de revestimento e cura de PDMS para garantir adesão consistente das nanofibras entre diferentes lotes.
- A adaptação a alvos proteicos alternativos exige reotimização da química da superfície e das condições de incubação.
- As limitações práticas incluem a necessidade de condições ambientais controladas durante a transferência das nanofibras e a variabilidade potencial na uniformidade da malha de fibras.
