Criação de Sub-50 nm nanofluidic Junções em PDMS Microfluidic Chip via processo de automontagem de coloidal Particles

Este protocolo demonstra uma técnica nova e simples de automontagem de nanopartículas de sílica coloidal para criar uma junção nanofluídica entre dois microcanais em polidimetilsiloxano. A membrana do grânulo com um tamanho de poro de aproximadamente 45 nanômetros, atuando como uma membrana seletiva de cátions, pode ser usada para a concentração eletrocinética de amostras de DNA e proteínas. Visão geral:Na primeira etapa, o dispositivo PDMS com nanoarmadilhas é fundido por meio de um processo de moldagem dupla.

Após a ligação do dispositivo a um substrato de vidro, esferas de sílica funcionalizadas na superfície são injetadas nos microcanais para formar a membrana coloidal de automontagem. Por fim, uma tensão é aplicada através da membrana usando um medidor de fonte e um divisor de tensão. A depleção de íons e o aumento da concentração são observados usando um microscópio de epifluorescência invertida, com uma câmera CCD.

Preparação das suspensões de partículas coloidais de sílica: Começando com os grânulos de sílica de 300 nanômetros; coronha de contas de vórtice por 30 segundos; retire a suspensão de 600 microlitros em um tubo Eppendorf e centrifugue por um minuto a 2.600g. Após centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda as esferas com 400 microlitros de tampão fosfato de sódio de um milimolar, para atingir uma concentração de trabalho de 15%.

Vórtice para alcançar uma suspensão homogênea. Repita as mesmas etapas para preparar esferas de sílica de 500 nanômetros. Para contas de sílica carboxílica de 500 nanômetros, pese 100 miligramas em um tubo Falcon de 15 mililitros.

Em seguida, transfira 9,8 mililitros de cloreto de sódio de um molar para ressuspender as contas. Vortex o tubo vigorosamente. Inverta o tubo várias vezes para deslocar as contas impactadas na parte inferior.

Para modificar a carga superficial nos grânulos, preparamos dois polieletrólitos: PAH e PSS. O PSS a 0,9% é preparado dissolvendo 180 miligramas de PSS com 200 mililitros, cloreto de sódio monomolar. O 0,4% PAH é preparado iludindo 300 microlitros da solução estoque em 15 mililitros de cloreto de sódio monomolar.

Vortex ambas as soluções para garantir que estejam totalmente dissolvidas. Para depositar uma camada de PAH carregada positivamente, adicione 200 microlitros da solução de PAH à suspensão do grânulo. Vortex por um minuto e incubar a suspensão em um rotador por uma hora em temperatura ambiente.

Para lavar o HAP não ligado, centrifugue a suspensão a 1.801 g durante um minuto, para precipitar os grânulos. Remova o sobrenadante. Pipete de um a dois mililitros de água no tubo para romper as contas.

Adicione os oito mililitros restantes de água e, em seguida, vórtice. Repita o procedimento de lavagem mais quatro vezes. Após a quinta lavagem e centrifugação, descarte o sobrenadante e restaure as esferas com 9,8 mililitros de cloreto de sódio monomolar.

Para depositar a camada de PSS carregada negativamente, adicione 200 microlitros da solução de PSS à suspensão do cordão. Vortex por um minuto e incubar a suspensão no rotador por uma hora à temperatura ambiente. Lave os grânulos cinco vezes com água DI, como feito para o revestimento de HAP.

Após a última lavagem, descarte o sobrenadante e ressuspenda as esferas com 650 microlitros de tampão fosfato de sódio de um milimolar com 0,05% Tween 20. Transfira a suspensão do talão para um tubo eppendorf. Para a preparação dos grânulos de sílica amina de 500 nanômetros, repita o mesmo procedimento para depositar uma única camada de PSS carregada negativamente.

Fabricação do chip microfluídico PDMS: Para fabricar o mestre de silício, primeiro gire um fotorresistente de um micrômetro de espessura a 4.000 RPM em um wafer de silício. Em seguida, use a litografia de projeção e a gravação de íons reativos para criar nanocanais planares de 700 nanômetros de profundidade e dois micrômetros de largura como nanoarmadilhas para as contas. Em seguida, gire a camada de fotorresistência da 2ª camada a 2.000 RPM e execute um alinhamento com as nanoarmadilhas padronizadas anteriormente.

Adicione os microcanais por litografia de contato e por gravação de íons de reação profunda do silício. Para criar a camada de liberação, silane o mestre de silício em um frasco a vácuo com 50 microlitros de triclorossilano, durante a noite. Para fundir o molde PDMS, misture a base PDMS com agente de cura na proporção de 10:1.

Despeje a mistura em cima do mestre de silício. Coloque o mestre com PDMS em uma jarra a vácuo para remover as bolhas de ar e leve ao forno a 70 graus C para reticular o PDMS. Após assar por duas horas, remova cuidadosamente a placa PDMS do mestre de silício.

Trate a superfície com plasma para criar uma ligação permanente a um wafer de silício em branco. Prenda a fita adesiva ao longo da borda para marcar uma linha de partição para a próxima etapa de fundição do PDMS. Para criar uma camada de desmoldagem, silane o molde PDMS em um frasco a vácuo durante a noite.

Funda o PDMS em cima do molde PDMS e transfira-o para um frasco a vácuo para desgaseificação. Em seguida, asse no forno. Retire a placa PDMS curada do molde PDMS ao longo da linha divisória marcada com fita adesiva.

Corte os dispositivos com cuidado e faça furos com um punção de biópsia de 1,5 milímetro nos reservatórios. Após a limpeza da superfície com fita adesiva e IPA, o plasma une o dispositivo PDMS em uma lâmina de vidro de microscópio de 25 milímetros por 75 milímetros. Imediatamente após a ligação do plasma, injete 10 microlitros da suspensão nas entradas quatro e seis dos canais de entrega do cordão.

Depois de encher os canais de entrega de contas, cubra todos os reservatórios, exceto as saídas um e nove, dos canais de entrega de contas. Seque o dispositivo ao ar por três horas em temperatura ambiente e armazene a quatro graus C antes do uso. Micrografias do dispositivo mostram que as partículas coloidais se reúnem dentro dos canais de entrega do grânulo superior e inferior.

A imagem SEM mostra partículas coloidais de sílica de 300 nanômetros automontadas presas com as matrizes de nanoarmadilhas, entre a amostra e o canal tampão. Encha as entradas três e sete dos canais tampão com 10 microlitros de tampão fosfato de sódio de um milimolar. Encha a entrada cinco do canal de amostra com 10 microlitros de amostra de DNA de 10 nanomolares.

Aplique uma pressão negativa suave com uma ponta de pipeta invertida em todas as saídas para encher os canais com as soluções sem bolhas de ar. Adicione 10 microlitros de tampão fosfato de sódio aos reservatórios dois e oito e 10 microlitros de amostra de DNA ao reservatório 10, para estabilizar a pressão por cinco minutos. Experimento para concentração eletrocinética de DNA: Conecte o chip microfluídico com um divisor de tensão conectado a um medidor de fonte.

Insira os fios PT nos reservatórios três, sete, cinco e 10. Aplique tensão em uma junção nanofluídica. Primeiro aplique 30 volts nos reservatórios cinco e 10 e aterrar nos reservatórios três e sete.

Diminua a tensão para 25 volts no reservatório 10 após aproximadamente 30 segundos. Resultados da pré-concentração eletrocinética: O canal microfluídico é preenchido com DNA, com concentração inicial em 10 nanomolares. Micrografias de lapso de tempo mostram a formação de uma região de depleção de íons, ou junções coloidais nanofluídicas.

A região de depleção de íons foi iniciada em 10 segundos. Um tampão de DNA concentrado foi gerado quando a tensão é aplicada ao canal da amostra, enquanto os canais tampão foram aterrados. As linhas pontilhadas foram usadas para destacar as paredes do canal.

Um fator de concentração de cerca de 1.700 vezes é alcançado em 15 minutos usando membrana coloidal de 300 nanômetros. A intensidade média de fluorescência do DNA está aumentando em função do tempo em um membrabe nanoporoso. As linhas pontilhadas representam o nível de sinal para DNA de 10 nanomolares, 17 micromolares, dois micromolares e 10 micromolares.

O tampão concentrado é gerado na membrana nanoporosa dos grânulos de sílica de 300 nanômetros; as contas de sílica de 500 nanômetros; os grânulos de sílica amina de 500 nanômetros, revestidos com uma única camada de PSS; e as esferas de carboxila de sílica de 500 nanômetros, revestidas com duas camadas de PAH e PSS. Conclusões: Usando a membrana de sílica coloidal auto-montada com um tamanho de poro estimado de 45 nanômetros, demonstramos a polarização da concentração de íons perto da junção nanofluídica e concentramos uma amostra de DNA em 1700 vezes em 15 minutos. Em comparação com os nanocanais à base de silício, a principal vantagem da membrana coloidal automontada é a possibilidade de realizar a funcionalização da superfície completamente fora do dispositivo microfluídico selado, em um frasco separado.

Acreditamos que essa abordagem abre a possibilidade de fabricar uma plataforma micro nanofluídica rapidamente com tamanhos de poros facilmente ajustáveis, controlando o tamanho do grânulo, a força iônica ou o valor do pH da solução tampão para estudar o transporte iônico e molecular na faixa de 10 a 100 nanômetros.