Name: Kinetic Medição e visualização em tempo real de Reprogramação Somatic (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a monitorar em tempo real a reprogramação de células somáticas em iPSCs usando citometria de fluxo e marcadores de superfície celular. Este método permite rastrear a cinética da reprogramação de fibroblastos humanos.

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Os autores agradecem Chad MacArthur para discussões úteis.

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+monitoring+of+hiPSC+generation+and+differentiation+using+differential+expression+of+endogenous+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs.</a> PLoS One. 5, e11834(2010).</li>
<li>Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+strategies+in+fluorescent+probe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Combinatorial strategies in fluorescent probe development.</a> Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
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<li>Papp, B., Plath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+to+pluripotency%3A+stepwise+resetting+of+the+epigenetic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape.</a> Cell Res. 21, 486-501 (2011).</li>
<li>Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+marker+mediated+purification+of+iPS+cell+intermediates+from+a+reprogrammable+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model.</a> J Vis Exp. , e51728(2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+fibroblast-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+support+undifferentiated+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth.</a> Stem Cells. 22, 972-980 (2004).</li>
<li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).</li>
<li>Singh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+live+alkaline+phosphatase+substrate+for+identification+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).</li>
<li>Naujok, O., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-evaluation+of+CD24-positivity+of+human+embryonic+stem+cells+differentiated+into+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors.</a> Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).</li>
<li>Ramirez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+benchmarking+human+pluripotent+stem+cell+markers+during+differentiation+into+the+three+germ+layers+unveils+a+striking+heterogeneity%3A+all+markers+are+not+equal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal.</a> Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).</li>
<li>Huang, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28EpCAM%29+complex+proteins+promote+transcription+factor-mediated+pluripotency+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming.</a> J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).</li>
<li>Kolle, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+embryonic+stem+cell+surface+markers+by+combined+membrane-polysome+translation+state+array+analysis+and+immunotranscriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling.</a> Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).</li>
<li>Thyagarajan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+engineered+human+embryonic+stem+cell+lines+using+phiC31+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase.</a> Stem Cells. 26, 119-126 (2008).</li>
</ol>

Todos os autores [RHQ, JSTA, KS, e UL] são funcionários da Thermo Fisher Scientific, que produz alguns dos reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

Este estudo fornece estratégias para monitoramento e rastreamento do processo de reprogramação usando citometria de fluxo e análise baseada em imagens em tempo real. As etapas críticas do protocolo são iniciar a reprogramação, medir a progressão da reprogramação com base na expressão do marcador e monitorar a reprogramação em tempo real. Qualquer método de reprogramação de escolha pode ser usado, mas aqui nos concentramos na reprogramação baseada em Sendai de fibroblastos humanos. A vantagem deste método é a facilidade d...

As células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de doentes (iPSCs) são ferramentas promissoras para a terapia celular e triagem de drogas. Eles fornecem uma fonte de células autólogas para terapia. Além disso, elas abrangem um amplo conjunto de origens genéticas, permitindo uma análise detalhada in vitro de doenças genéticas além do que as linhas atuais células-tronco embrionárias (ESC) permitiria. Os avanços recentes levou ao desenvolvimento de vários métodos para gerar iPSCs, incluindo reprogramação com o vírus Sendai, plasmídeos epissomais ou ARNm 1,2. Notavelmente, os diferentes métodos de reprogramação são associados com diferentes níveis de eficiência e segurança, e é provável que diferem de outras formas que influenciam a sua adequação para várias aplicações. Com a disponibilidade de uma variedade de tecnologias de reprogramação, tornou-se importante o desenvolvimento de métodos para avaliar o processo de reprogramação. A maioria dos métodos existentes contam com a inspeção qualitativa da morfologia ou coloraçãocom corantes e anticorpos específicos de células-tronco. Um método recentemente desenvolvido faz uso de repórteres de fluorescência de lentivírus que são sensíveis à miARNs específicos do CPS ou de mRNAs específicos de células diferenciadas 3. Tais métodos de monitorização facilitar a selecção e optimização de técnicas de reprogramação para diferentes situações. Por exemplo, CDy1 foi usado como uma sonda fluorescente para os primeiros iPSCs, a fim de pesquisar moduladores de reprogramação 4. A capacidade de observar e comparar diferentes experiências de reprogramação também é crítico para a obtenção de uma melhor compreensão do próprio processo. Por exemplo, sabe-se agora que alguns tipos de células somáticas são mais fáceis de reprogramar 5 do que outros, e que as células passam por estados intermédios durante a reprogramação 6-8. Infelizmente, os mecanismos subjacentes ao processo de reprogramação ainda não estão completamente esclarecidos e, consequentemente, as diferenças exatas entre métodos de reprogramação também continuam a ser defined. Assim, métodos de monitorização, avaliação e comparação de eventos de reprogramação continuar a ser crítico para o campo das células estaminais. Os métodos descritos no presente protocolo de permitir a monitorização e a avaliação do processo de reprogramação e ilustram como estas técnicas podem ser usadas para comparar diferentes conjuntos de reagentes de reprogramação. A primeira abordagem envolve a citometria de fluxo analisa utilizando combinações de anticorpos contra células-tronco pluripotentes positivo e negativo (PSC) marcadores. A segunda abordagem pares de imagens em tempo real e a medição da confluência total (área da superfície coberta por cento por as células) e confluência de sinais de marcador (por cento da área de superfície coberta pelos sinais fluorescentes).

<table><tbody><tr><td>DMEM, glicose alta, GlutaMAXSupplement, piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, qualificado para células-tronco embrionárias, origem americana</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16141-061</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo (ICR) Fibroblastos Embrionários Inativados</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A24903</td><td></td></tr><tr><td>Proteína do Fator de Fixação (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-006-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Substituição do Soro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10828010</tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Colgenase, Tipo IV, pó</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Select (1x), sem vermelho de fenol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free, qualificado para hESC, fator de crescimento reduzido Matriz de membrana basal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) Proteína humana recombinante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bovina Fração V (solução a 7,5%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reprogramação CytoTune-iPS Sendai</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Kit de reprogramação</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>Condessa II Contador de células automatizado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Lâminas de câmara de contagem de células</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>BJ ATCC Fibroblastos Humanos do Prepúcio, Neonatal</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Fibroblasto Dérmico Humano Adulto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>BG01V / hOG Células Variante hESC hOct4-GFP Células Repórter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R7799-105</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Anticorpo, Alexa Fluor 647 conjugado (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SSEA421</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Anticorpo, Alexa Fluor 488 conjugado (eBioMC-813-70 (MC-813-70))</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14810</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Anticorpo (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-4000</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Anticorpo (cl.A)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 41-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Rato Anti-Humano/Rato mAb (clone IM7), conjugado PE-Cy5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27094</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Alexa Fluor 488 Kit de Conjugado para Imagem de Células Vivas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25528</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Rato Anti-Humano/Rato mAb (Clone IM7)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-5700 (não está mais disponível)</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-camundongo IgG (H+L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário IgG (H+L) Anticorpo Secundário Anti-Rato de Cabra, Conjugado Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11007</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase Alcalina Mancha Viva</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Kit de Conjugado para Imagem de Células Vivas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25618</td><td></td></tr><tr><td>CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), conjugado FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD2401</td><td></td></tr><tr><td>beta-2 Microglobulina Anticorpo, conjugado FITC (B2M-01)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15737</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM / CD326 Anticorpo, conjugado FITC (VU-1D9)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15755</td><td></td></tr><tr><td>CD73 / NT5E Anticorpo (7G2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-0200</td><td></td></tr><tr><td>VECTOR Kit de Substrato de Fosfatase Alcalina Vermelha (AP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.Microscópio Z1&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491912-0003-000</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software de Análise de Dados</td><td>FLOJO, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Attune Citômetro de Foco Acústico, Laser Azul/Vermelho</td><td>Thermo Fisher Uso Científico</td><td>Attune NXT&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>S3e\ Classificador de células (488/561 nm)</td><td>BIO-RAD</td><td>1451006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm Tubo com tampa do filtro de células</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml, alta clareza, tampa de rosca com vedação em cúpula</td><td>Frasco Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-75 Frasco</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-175</td><td>Corning</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 6 poços</td><td>Falcon Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Heracell CO2 Incubadora Rolling</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51013669</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microfuge Antiaderentes, sem RNase, 1,5 ml</td><td></td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr>Misturador <td></td> de<td>Amostras HulaMixer</td><td>15920D</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetic medição e visualização em tempo real de reprogramação somatic

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

A reprogramação somática permitiu a conversão de células adultas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) de diversas origens genéticas e fenótipos de doenças. Avanços recentes identificaram métodos mais eficientes e seguros para a introdução de fatores de reprogramação. No entanto, existem poucas ferramentas para monitorar e acompanhar a progressão da reprogramação. Os métodos atuais para monitorar a reprogramação dependem da inspeção qualitativa da morfologia ou coloração com corantes e anticorpos específicos para células-tronco. Ferramentas para dissecar a progressão da geração de iPSC podem ajudar a entender melhor o processo sob diferentes condições de diversas fontes celulares. 
Este estudo apresenta as principais abordagens para a medição cinética da progressão da reprogramação usando citometria de fluxo, bem como monitoramento em tempo real por meio de imagens. Para medir a cinética de reprogramação, a análise de fluxo foi realizada em pontos de tempo discretos usando anticorpos contra marcadores de células-tronco pluripotentes positivas e negativas. A combinação de visualização em tempo real e análise de fluxo permite o estudo quantitativo da reprogramação em diferentes estágios e fornece uma comparação mais precisa de diferentes sistemas e métodos. A análise baseada em imagens em tempo real foi usada para o monitoramento contínuo dos fibroblastos à medida que são reprogramados em um sistema de meio sem alimentador. A cinética de formação de colônias foi medida com base na confluência nos canais de contraste de fase ou fluorescência após a coloração com corante de fosfatase alcalina viva ou anticorpos contra SSEA4 ou TRA-1-60. Os resultados indicaram que a medição da confluência fornece métricas semiquantitativas para monitorar a progressão da reprogramação.

Monitoramento Kinetics reprogramação utilizando citometria de fluxo CD44 é um marcador de fibroblastos enquanto SSEA4 é um marcador PSC 6,10. Como esperado a partir deste padrão de expressão, a citometria de fluxo de fibroblastos BJ mostra um SSEA4 - CD44 + da população que facilita a criação de portas de quadrante em combinação com a amostra não corado. Durante a reprogramação de fibr...

O protocolo apresentado no presente estudo descreve métodos para a monitorização em tempo real da progressão reprogramação através da medição da cinética de marcadores de células estaminais pluripotentes positivos e negativos utilizando análise de citometria de fluxo. O protocolo também inclui a avaliação baseada em imagens da morfologia, e marcador ou expressão repórter durante a geração da IPSC.

Kinetic Medição e visualização em tempo real de Reprogramação Somatic

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

O objetivo geral desses procedimentos é visualizar e acompanhar a progressão da reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas ou iPSC. Este método pode ser usado para responder perguntas fundamentais na área de iPSC, como a forma pela qual a cinética de reprogramação e as eficiências de reprogramação são alteradas pelos tecidos somáticos utilizados, pelas tecnologias de reprogramação aplicadas e pelas combinações de matriz e meios empregados. A principal vantagem deste método é que ele utiliza marcadores de superfície celular para observar as transições de células somáticas para iPSCs, permitindo monitorar em tempo real os eventos de reprogramação.No sétimo dia após a transdução, lave os fibroblastos com dois mililitros de DPBS por poço e adicione 0,5 mililitros de EDTA a 05% a 37 graus Celsius a cada poço, incubando por três a cinco minutos a 37 graus Celsius. Quando as células estiverem arredondadas, interrompa a reação com dois mililitros de meio para fibroblastos a 37 graus Celsius por poço e pipete suavemente o meio sobre o fundo de cada poço para desprender as células. Transfira os fibroblastos de cada poço para tubos cónicos individuais de 15 m

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

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Setup Multifuncional de Estudos de Controle Motor Humano Utilizando Estimulação Magnética Transcraniana, Eletromiografia, Captura de Movimento, e Realidade Virtual

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Aprenda a monitorar em tempo real a reprogramação de células somáticas em iPSCs usando citometria de fluxo e marcadores de superfície celular. Este método permite rastrear a cinética da reprogramação de fibroblastos humanos.

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