Kinetic Medição e visualização em tempo real de Reprogramação Somatic

O objetivo geral desses procedimentos é visualizar e rastrear a progressão da reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas ou iPSC. Este método pode ser usado para responder a questões-chave no campo iPSC, como como a cinética de reprogramação e as eficiências de reprogramação são alteradas pelos tecidos somáticos usados, as tecnologias de reprogramação aplicadas e as combinações de matriz e mídia usadas com ele. A principal vantagem desse método é que ele utiliza marcadores de superfície celular para observar as transições de células somáticas em iPSCs, de modo que você possa usar essa tecnologia para monitorar em tempo real os eventos de reprogramação.

No sétimo dia após a transdução, lave os fibroblastos com dois mililitros de DPBS por poço e adicione 0,5 mililitros de 37 graus Celsius 05% EDTA a cada poço para uma incubação de três a cinco minutos a 37 graus Celsius. Quando as células estiverem arredondadas, pare a reação com dois mililitros de meio de fibroblastos a 37 graus Celsius por poço e pipete suavemente o meio no fundo de cada poço para desalojar as células. Transfira os fibroblastos de cada poço para tubos cônicos individuais de 15 mililitros e colete-os por centrifugação.

Ressuspenda os pellets em dois mililitros de meio de fibroblastos fresco a 37 graus Celsius e conte as células de cada condição de cultura. Em seguida, semeie uma vez 10 até a quinta célula em poços condicionados independentes de alimentador pré-preparados em uma placa de cultura de tecidos de seis poços e incube as células transduzidas na incubadora de cultura de células durante a noite. No dia seguinte, substitua o meio em cada poço pelo meio apropriado para a aplicação da célula.

Em seguida, coloque a placa no gerador de imagens e configure o software para capturar contraste de fase contínuo de todo o poço e imagens fluorescentes para cada poço a cada seis a oito horas pelos próximos 14 dias. No final do experimento de reprogramação, lave os poços uma vez com dois mililitros de meio DMEM/F12 de 37 graus Celsius. Rejeitar a lavagem e rotular as células com um mililitro por alvéolo dos anticorpos primários adequados em meio DMEM/F12 fresco durante 45 minutos a 37 graus Celsius na incubadora.

No final da incubação, lave as células duas vezes com meio DMEM/F12 a 37 graus Celsius. Em seguida, descarte a lavagem e rotule as células com um mililitro dos anticorpos secundários apropriados em meio DMEM/F12 a 37 graus Celsius por 30 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, lavar as células mais duas vezes com meio DMEM/F12.

Em seguida, substitua a lavagem em cada poço por dois mililitros de meio DMEM/F12 fresco a 37 graus Celsius. Coloque a antena no gerador de imagens e abra o software de imagem. Para configurar digitalizações no software do sistema de imagem, primeiro selecione a posição da bandeja a ser usada e selecione o tipo de prato a ser digitalizado.

Em seguida, selecione Whole Well Imaging, o padrão para escanear os poços desejados e os canais fluorescentes apropriados para a identificação em tempo real dos marcadores de superfície de interesse. Em seguida, rotule o experimento a ser verificado e defina os pontos de tempo e intervalos para as amostras a serem verificadas a cada dia. Para analisar um conjunto de experimentos verificados, selecione o experimento de interesse e selecione Iniciar Novo Trabalho de Análise.

Em seguida, selecione a definição de processamento apropriada para o tipo de análise de acordo com os canais usados para a imagem, por exemplo, PSC Phase Colony Count. Nomeie o trabalho de análise. E selecione o intervalo de tempo para a análise e os poços a serem analisados.

Em seguida, inicie o trabalho de análise. Para medir os pontos de tempo de reprogramação desejados de poços individuais, lave o poço de interesse uma vez com dois mililitros de DPBS. Em seguida, substitua a lavagem por um mililitro de solução pré-aquecida a 37 graus Celsius 05% tripsina-EDTA.

Após cinco minutos de 37 graus Celsius, lave a tripsina contra o fundo do poço para dissociar as células em uma suspensão unicelular e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Usando três mililitros de DPBS, lave qualquer uma das células restantes do poço e puxe-as no tubo de 15 mililitros. Adicione mais 10 mililitros de DPBS às células e gire-as por centrifugação.

Ressuspenda o pellet em um mililitro de meio DMEM/F12 para contagem. Em seguida, diluir a suspensão celular até um décimo de cada vez a concentração de seis células por mililitro e alíquota de um mililitro de células por tubo para o número adequado de amostras. Em seguida, rotule as células com os anticorpos primários de interesse em um mililitro de meio DMEM / F12 por 30 a 45 minutos em temperatura ambiente com mistura.

No final da incubação, lave as células duas vezes em meio DMEM/F12 a 37 graus Celsius. Ressuspenda os pellets em um mililitro de DPBS e transfira as amostras para tubos FACS individuais. Adquira os perfis de citometria de fluxo das placas reprogramadas.

Em seguida, transfira os arquivos FCS para um computador e importe os arquivos para o software de análise apropriado. Abra o primeiro arquivo de controle em um gráfico de dispersão de frente para frente e lado e defina o eixo y para uma escala logarítmica. Em seguida, crie uma porta poligonal ao redor da população viva.

Em seguida, crie uma área de dispersão lateral por gráfico de altura de dispersão com as células vivas e defina uma porta retangular para excluir os dublês. Em seguida, use essas portas para analisar os arquivos de amostra experimentais sob os canais fluorescentes apropriados para identificar as populações de interesse em seus respectivos quadrantes. A reprogramação de fibroblastos BJ com vírus de reprogramação Sendai gera células SSEA4 + CD44 a uma taxa diferente da reprogramação de fibroblastos DF1, demonstrando que uma comparação inicial da porcentagem de células SSEA4 + CD44 semelhantes a células-tronco pluripotentes pode ser usada para rastrear a progressão da reprogramação.

Em um curso de tempo de citometria de fluxo, os fibroblastos CD24-CD44+ e EpCAM negativos CD44+ formam populações duplamente negativas que posteriormente fazem a transição para células semelhantes a células-tronco pluripotentes CD24+CD44 positivas e EpCAM positivas, respectivamente, delineando ainda mais a progressão da reprogramação. Imagens em tempo real das culturas de reprogramação após a ressemeadura demonstram uma formação gradual de colônias correspondendo a um aumento logarítmico em sua confluência e demonstrando a expressão final do marcador pluripotente positivo e negativo de fibroblastos na conclusão da reprogramação. Além disso, o uso de um gene repórter permite que a confluência seja medida em contraste de fase com um aumento mais gradual da confluência GFP observada em comparação com a confluência total.

De fato, neste experimento representativo, a confluência GFP no dia 19 foi menos da metade da confluência total correspondente à reprogramação completa. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para elucidar informações sobre eventos de reprogramação e rastrear a cinética da reprogramação de fibroblastos humanos. Essa técnica também pode ser usada para observar diferentes tecidos celulares somáticos iniciais, as tecnologias de reprogramação usadas e as combinações de matrizes médias para elucidar eventos de reprogramação.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como utilizar o monitoramento em tempo real e a expressão de marcadores de superfície celular, para poder rastrear a reprogramação de fibroblastos humanos em iPSCs.