Detecção de proteínas de ligação a ARN pela In Vitro RNA Pull-down em Cultura adipócito

O objetivo geral deste experimento é recuperar proteínas de ligação ao RNA de um transcrito de RNA do tecido adiposo marrom. Este método pode ajudar a responder a questões-chave neste campo, tais como, quais são os mecanismos regulatórios do RNA codificador de longa vida e proteínas de RNA associadas. A principal vantagem dessa tática é que ela é fácil de executar.

O RNA usado para demonstrar este procedimento é um fragmento da Região Não Traduzida do Receptor de Antígeno 3-Prime, doravante denominada AR 3-Prime UTR. Comece amplificando o oligo T7 AR e a sequência parcial do DNA de luciferase do vaga-lume do plasmídeo psiCHECK-2. Os primers e parâmetros usados são detalhados no documento anexo.

Após a amplificação, use os produtos de PCR como modelos para sintetizar RNAs biotinilados usando um kit de transcrição in vitro, seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, incube a mistura a 37 graus Celsius por quatro horas. Após a transcrição in vitro, adicione um microlitro de Dnase à reação e incube-o a 37 graus Celsius por 15 minutos para degradar o DNA molde.

Em seguida, aumente o volume total para 60 microlitros com água. Aplique os RNAs biotinilados em colunas de purificação para remover o sal e os nucleotídeos não incorporados. Em seguida, depois de medir a concentração de RNA, armazene a RNase a menos 80 graus Celsius para ensaios subsequentes.

No dia do ensaio, descongele o RNA biotinilado congelado no gelo. Em seguida, para garantir que o RNA de interesse tenha a estrutura secundária adequada, aqueça 50 microlitros a 90 graus Celsius por dois minutos. Leve à geladeira por dois minutos.

Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de estrutura de RNA 2X e deixe o RNA dobrar em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, ressuspenda as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina em seu frasco original, agitando-as brevemente. Em seguida, transfira 150 microlitros das contas ressuspensas para um tubo de 1,5 mililitro.

Coloque o tubo em um suporte magnético por um minuto para separar as esferas magnéticas e o sobrenadante. Use uma pipeta para remover e descartar o sobrenadante. Guarde o pellet de contas.

Lave os grânulos uma vez, ressuspendendo o pellet do grânulo em um mililitro do tampão de ligação e lavagem 1X recomendado pelo fabricante e, em seguida, coloque o tubo em um rotador por cinco minutos em temperatura ambiente. Lave com tampão A e tampão B duas vezes. Após a incubação, descarte o sobrenadante e guarde o grânulo de contas.

Em seguida, ressuspenda o pellet do grânulo em 300 microlitros de tampão de lavagem e ligação 2X. Divida as contas igualmente em três tubos de 1,5 mililitro com 100 microlitros de contas por tubo. Adicione 100 microlitros de água livre de RNase, 100 microlitros de RNA de luciferase de vaga-lume biotinilado e 100 microlitros de RNA UTR AR 3-Prime biotinilado.

Incube cada mistura de grânulos por uma hora em temperatura ambiente com rotação. Em seguida, coloque os tubos no ímã por um minuto. Remova e descarte o sobrenadante.

Guarde os pellets de contas. Em seguida, lave os grânulos duas vezes, cada vez ressuspendendo os grânulos com 400 microlitros de tampão de lavagem e ligação 1X e, em seguida, colocando-os no rotador por cinco minutos em temperatura ambiente. Coloque os tubos em um ímã por um minuto.

Em seguida, remova e descarte todo o sobrenadante. Ressuspenda cada grânulo em 50 microlitros de tampão de isolamento nuclear. Em preparação para a próxima parte do protocolo, certifique-se de que todos os tampões, bem como os homogeneizadores de vidro dounce, sejam resfriados com gelo.

A preparação do lisado celular deve prosseguir com gelo. Para cada ensaio de RNA a ser realizado, prepare uma placa de 15 centímetros de pré-adipócitos diferenciados de camundongos C57 Black Six de três semanas de idade. Quatro a cinco dias depois, para colher as células, adicione 10 a 15 mililitros de PBF e, em seguida, use um raspador de células para remover as células do prato.

Transfira-os para um tubo de 50 mililitros e, em seguida, pelete-os por centrifugação a 200 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente. Após a centrifugação, use uma pipeta de um mililitro para aspirar e descartar o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em dois mililitros de tampão hipotônico e incube as células no gelo por quinze minutos.

Transfira as células para um homogeneizador de vidro de 15 mililitros e corte as células mecanicamente no gelo com 20 pinceladas. Pulverizar os núcleos celulares por centrifugação a 3300 vezes G durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para tubos de 1,5 mililitro e mantenha o pellet no gelo para uso posterior.

Ao sobrenadante, adicione cloreto de potássio 3 molares para obter uma concentração final de 150 milimolares. Gire a 20.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, haverá uma camada lipídica na parte superior.

Use uma pipeta de um mililitro para removê-lo com cuidado. Em seguida, colete o sobrenadante do lisado celular citoplasmático. Em seguida, usando uma pipeta de um mililitro, ressuspenda o pellet de núcleos em um mililitro de tampão de isolamento nuclear e transfira para um homogeneizador de vidro de 15 mililitros.

Cisalhe os núcleos mecanicamente no gelo com 100 golpes. Pulverizar os detritos nucleares por centrifugação a 20.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Colete o sobrenadante como lisado celular nuclear.

Estes podem ser combinados com o lisado citoplasmático colhido anteriormente ou mantidos separados para aplicações posteriores. Aqui, as amostras são combinadas na proporção de um para um. Adicione o inibidor de RNase ao lisado de células não fracionadas para obter uma concentração final de 0,5 unidades por microlitro.

Em seguida, reserve 100 microlitros do lisado celular no gelo como um controle de entrada para western blotting. Divida o lisado celular em três alíquotas iguais com um mililitro de lisado celular em cada tubo de 1,5 mililitro e incube com RNA de luciferase de vaga-lume em branco conjugado e grânulos conjugados AR 3-Prime UTR, respectivamente, por três horas a quatro graus Celsius com rotação. Após a incubação, coloque os tubos no ímã por um minuto.

Use uma pipeta de um mililitro para coletar o sobrenadante, depois isole o RNA e avalie a integridade do RNA conforme descrito no documento anexo. Mantenha os pellets de contas no gelo. Lave as contas magnéticas seis vezes.

A cada vez, ressuspenda os grânulos em um mililitro de tampão de isolamento nuclear contendo 40 unidades de inibidor de RNase e 0,25 por cento de igepal. Gire os tubos por dois minutos em temperatura ambiente. Coloque os tubos em um suporte magnético para separar os grânulos magnéticos e o sobrenadante.

Após um minuto, aspire e descarte o sobrenadante e, em seguida, coloque as pelotas de contas no gelo. Para eluir os complexos de proteínas de RNA dos grânulos para western blotting, primeiro, ressuspenda cada grânulo em 75 microlitros de tampão de isolamento nuclear. Em seguida, adicione 25 microlitros de tampão de carregamento de western blot 4X.

contendo SDS, para obter um volume total de 100 microlitros. Por fim, ferva as esferas nesta solução de 100 microlitros a 95 graus Celsius por cinco minutos. Realize western blotting para verificação de RBP conforme descrito no documento anexo.

Neste experimento, um fragmento de RNA do receptor de antígeno foi usado como isca para capturar sua proteína de ligação, HuR. Tanto uma isca de RNA de luciferase de vaga-lume não relacionada à proteína HuR quanto uma alíquota de grânulos de estreptavidina em branco não conjugados serviram como controles negativos. As interações RNA-proteína podem ocorrer no núcleo ou no citoplasma, e este protocolo pull-down pode ser aplicado a lisados de células nucleares ou citoplasmáticas totais ou fracionadas.

A análise por western blotting mostrou a proteína HuR no lisado de células não fracionadas, ou entrada, usando o anticorpo monoclonal. A fração de elusion do RNA do receptor de antígeno também deu um resultado positivo, indicando a presença da proteína HuR no lisado de adipócitos usando as esferas conjugadas com RNA do receptor de antígeno para o ensaio de pull-down de RNA. Tanto a fração de eluição de RNA de luciferase de vaga-lume quanto a amostra de grânulos em branco deram resultados negativos, indicando que interações não específicas não foram detectáveis usando essa abordagem.

Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que a interação entre o fragmento de RNA antígeno-receptor e a proteína HuR foi específica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como recuperar proteínas de ligação ao RNA de um transcrito de RNA do tecido adiposo marrom. Uma vez dominado, isso pode ser feito em 24 horas, se for executado corretamente.