Name: Medidas espaciais de Perfusão, intersticial pressão do produto e lipossomas Acumulação em tumores sólidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a mapear espacialmente a pressão intersticial, microcirculação tumoral e acumulação de lipossomas em tumores sólidos usando micro-CT e robótica. Este método avançado permite correlacionar propriedades do microambiente com a distribuição de nanoterapêuticos.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Javed Mahmood pela assistência na cultura de células MDA-MB-231 e na implantação dos xenoenxertos MDA-MB-231, Linyu Fan pela preparação dos lipossomas CT. Shawn Stapleton é grato pelo financiamento do Programa de Bolsas de Pós-Graduação em Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia e da Iniciativa Estratégica da Fundação Terry Fox para Excelência em Pesquisa de Radiação para o Século 21 (EIRR21) no CIHR. Este estudo foi apoiado por doações do Terry Fox New Frontiers Program (020005) e dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (102569).

Todas as experiências in vivo foram realizados sob um protocolo aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use a Rede Universitária de Saúde. 1. Modelo Animal <ol><li> Cultura entre 5 a 7 x 10 6 MDA-MB-231 de adenocarcinoma da mama células tumorais em DMEM junto com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 100x diluição de penicilina-estreptomicina. </li><li> Células colheita quando estão 80% confluentes utilizando uma solução de tripsina-EDTA a 0,05%. Após 3-5 min neutralizar a tripsina-EDTA com um volume de DMEM 3x. Tomar uma alíquota de 15 ul de células e contar com um hemocitômetro. Centrifugar células em um sedimento durante 5 min a 200 xg e re-suspender em HBS a uma concentração de 10 x 10 6 culas por ml. </li><li> Implante subcutânea (SC) de tumores por injecção de 1 a 2 x 10 6 células no membro posterior de cada 8 a 12 semanas de idade do sexo feminino ratinho SCID (n = 5). Use uma agulha 25 G padrão para injeção. </li><li> Monitor de tumor de crescimento utilizando pinças (volume = 0,5 x comprimento x largura 2) e iniciar as medições uma vez que os tumores SC atingiram um volume&gt; 200 mm3 (cerca de 7 a 9 dias). </li></ol> 2. CT-lipossoma Preparação e Caracterização <ol><li> lipossoma Preparação <ol><li> Dissolve-se os componentes lípidos (200 mmol / L) para a CT-lipossomas, incluindo 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), colesterol (CH), e 1,2-distearoil-sn-glicero-3 -phosphoethanolamine-N-poli (etileno-glicol) 2000 (DSPE-PEG2000) em etanol anidro a 70 ° C a uma razão molar de 55: 40: 5 de DPPC: CH: DSPE-PEG2000. </li><li> Evapora-se o etanol através da manutenção de calor a 70 ° C, e depois adicionar o agente de contraste iohexol CT (300 mg / ml de iodo) para a solução de tal modo que a concentração final de lípido é de 100 mm. </li><li> Manter a solução a 70 ° C durante 4 h, com agitação em vórtice frequente. </li><li> Para obter vesículas unilamelares, a extrusão da amostra 5 timES através de duas membranas empilhadas 200 nm de tamanho de poro, a uma pressão de 250 psi e extrudir novamente por 5 ciclos através de duas membranas de dimensão de poro de 80 nm a 400 psi empilhados usando uma extrusora de lípido de 10 ml. Pipetar um volume de 10 ml de lipossomas na extrusora no início de cada ciclo de extrusão e recolher em um tubo ou frasco de vidro cónico esterilizado depois de cada ciclo de extrusão. </li><li> Remover o iohexol encapsulado-un por 16 horas de diálise com um peso molecular de 100 kDa cortada (CMM) saco de diálise contra um volume em excesso de 250 vezes de uma solução 0,02 mM de HEPES-tamponado com solução salina (HBS, pH 7,4). Por exemplo, colocar 1 ml de solução de lipossoma para dentro do saco de diálise, com 250 ml de HBS fora do saco numa proveta. </li><li> Concentrar as CT-lipossomas utilizando um sistema de fluxo de 750.000 nomical MWC comercial tangencial de acordo com as instruções do fabricante. Concentra-se para uma concentração de iodo final de aproximadamente 55 mg ml -1. </li></ol></li><li> lipossoma Caracterização <ol><li> Medir a eficiência de encapsulação por ruptura das CT-lipossomas usando um excesso de volume de 10 vezes de etanol para libertar o ioxehol e depois dilui-se utilizando um excesso de volume de 100 vezes de água desionizada (ou seja, 10 pi de lipossomas rompido utilizando 100 ul de etanol e, em seguida, diluída para um volume final de 10 ml). </li><li> Determinar a concentração de iohexol utilizando um espectrómetro UV com detecção de comprimento de onda de 245 nm. Calcula-se a eficiência encapsulamentos tomando a quantidade proporção de agente de iohexol libertado para a quantidade de agente adicionado durante a preparação. </li><li> Medir o diâmetro hidrodinâmico e potencial zeta usando um sistema de analisador de tamanho de partícula de dispersão de luz dinâmica, de acordo com as instruções do fabricante. Dilui-se a solução de lipossomas por CT-200x (ou seja, 5 ul de lipossomas em 1 ml de volume final) em água desionizada de modo a facilitar as medições. </li></ol></li></ol> 3. CT imagem da microcirculação tumor e CT-lipossomaDistribuição NOTA: Siga as instruções do fabricante para a realização de uma verificação volumétrica se a versão de software diferente ou for utilizado equipamento. <ol><li> Anestesiar cada rato utilizando 2% de isoflurano misturado com ar medicinal ou oxigénio e confirme apertando o dedo do pé e observando nenhuma reação. Aplicar pomada para os olhos para evitar a secura e sob anestesia. Imobilizar animal em uma posição propensa gravando patas para uma placa de plástico fino. </li><li> Coloque um costume 27 G catéter, ligado a 20 cm no tubo PE10, na veia caudal lateral e prenda no lugar com vários pedaços de fita. </li><li> Prepara-se uma seringa de 1 ml para conter, pelo menos, 200 uL de CT-lipossomas. Prepara-se uma seringa de 1 ml com solução salina a ser usado para lavar o cateter. Finalmente, preparar uma seringa de 1 ml com, pelo menos, 150 uL de iohexol livre misturado com soro fisiológico (9: 1 razão em volume). </li><li> Posicione o mouse em decúbito ventral na mesa do scanner micro-CT. Use o sistema de posicionamento laser para colocar o tumor em aproximadamente a mesma orientação para cada varrimento. </li><li> Colocar a seringa de CT-lipossoma em uma bomba de seringa e fixar o cateter para a seringa. Definir a taxa de bombeamento de 10 ml por segundo. </li><li> Inicializar o sistema através da realização de uma verificação de calibração claro-escuro usando o software do console CT-scanner. Selecione a opção de digitalização claro-escuro para cada protocolo de imagem de interesse, selecione claro-escuro do menu drop-down e pressione o botão de verificação para iniciar a calibração. </li><li> Executar uma anatômica micro-CT volumétrica do tumor antes de qualquer injecção de agente de contraste. Observe o indicador de software do console do scanner CT para garantir a segurança CT scanner travas foram apagadas. No scanner CT console, selecione varredura selecionar uma energia de raios-x de 80 kV, a corrente do tubo de 70 mA, e capta 1.000 projeções de imagem ao longo do tempo 16 seg. Pressione o botão Digitalizar para iniciar a digitalização. </li><li> Utilizar a bomba de seringa para injectar um bolus de CT-lipossomas a uma concentração de 400 mg kg de iodo-1. Definir a bomba de injectar um volume de aproximadamente 150 ul (assumindo que um rato de 25 g). Pressione o botão &#39;start&#39; na bomba para injetar. descarregar manualmente o cateter com 50 ul de solução salina (duas vezes o volume do cateter) para assegurar que toda a quantidade do agente foi injectada e o cateter é clara. </li><li> Aguarde 10 minutos após a injeção de CT-lipossomas e, em seguida, executar uma segunda varredura anatômica usando o mesmo método e configurações descrito em 3.5. </li><li> Realizar uma verificação do DCE-CT, definindo a bomba de seringa para injectar um volume de 100 ul do iohexol livre misturado com soro fisiológico (9: 1 razão em volume) usando a mesma configuração da taxa de injecção descrito em 3.3. <ol><li> No console CT scanner selecione a verificação dinâmica 5 min que usa uma configuração de energia de raios-x de 80 kV, uma energia tubo de 90mA, e capta 416 imagem projeções cada segundo durante os primeiros 30 segundos e seguido de uma aquisição a cada 10 segundos . Capturar 5 segundos de dados DCE-CT e, em seguida, pressione o botão de início do injectiobomba n. </li><li> Após a verificação DCE-CT executar uma varredura anatômica micro-CT volumétrica. </li></ol></li><li> Capturar imagens anatómicas CT entre 48 e 72 h pós-injecção de CT-lipossomas, usando as mesmas definições CT volumétrica como descrito nas etapas 3.5. </li><li> Reconstruir os anatômicas dados CT e DCE-CT usando o software GPU-reconstrução. <ol><li> Carregar a imagem para o software de reconstrução. Selecione a região de interesse para ser reconstruído por desenhar uma ROI sobre a imagem usando um mouse. Definir o local para salvar e nome do arquivo para o reconstruída fotografada e selecione o tipo de arquivo de saída como &#39;.mat&#39;. NOTA: O software irá definir automaticamente o tamanho do voxel reconstruída para 0,153 x 0,153 x 0,153 mm3 para exames anátomo- 0,153 x 0,153 x 0,462 mm3 para varreduras DCE-CT. Clique no botão &quot;começar a reconstrução&quot;. </li></ol></li><li> Utilizar a pré-injecção e 10 min pós-injecção varreduras de CT-lipossoma para calcular ofracção do volume do plasma como descrito anteriormente 3. Além disso, utilizar o pré-injecção e 5 min exames pós-injecção de iohexol para calcular a fracção de volume intersticial tal como descrito anteriormente 7. </li><li> Obter intensidade tempo de curvas (TICs) ao importar os dados DCE-CT em software que fornece a capacidade de identificar uma região de interesse (ROI) dentro do volume do tumor. Em seguida o cálculo do realce significativo TC na ROI como uma função do tempo. Neste experimento software personalizado foi desenvolvido para identificar um ROI e calcular a TIC. </li><li> Obter estimativas quantitativas de perfusão e permeabilidade vascular ajustando TICs medidos usando um modelo cinético traçador de dois compartimentos. Encaixe pode ser realizada usando software de análise de DCE-CT e utilizar as estimativas priori da fracção de volume de plasma e fracções de volume intersticial como parâmetros fixos no modelo cinético do marcador de dois compartimentos. Usar métodos reportados anteriormente para obter estimativas a priori do plasmaa e frações de volume intersticiais 14. </li></ol> 4. Medidas espaciais de Tumor intersticial Pressão Fluid <ol><li> Para medir IFP conectar a agulha espinhal 25 G para o transdutor de pressão e ao sistema de aquisição IFP através de 50 cm de tubo de polietileno PE20. Lavar todo o sistema com uma solução de sulfato de heparina / solução salina (01:10). Esterilizar a agulha com 70% isopropílico antes da utilização. </li><li> Ligue o sistema de aquisição e lançar o software de aquisição de IFP e carregar os arquivos de configurações para calibrar o sistema para adquirir medições IFP em mmHg. Clique no botão AQUISIÇÃO para recolher continuamente dados IFP. </li><li> Realizar medições IFP entre 48 e 72 horas após a injecção de lipossomas-CT (isto corresponde a aproximadamente o tempo de acumulação de pico de CT-lipossomas em que o tumor), utilizando os métodos descritos em 4.8. Coloque a agulha IFP para o robô CT-IFP. </li><li> Executar verificações de calibração para alinhar os sistemas de coordenadas parao robô CT-IFP eo scanner CT. Adicionar o acessório marcador fiducial para o robô CT-IFP e executar um de quatro volumétrica TC com o marcador fiducial em quatro posições diferentes. <ol><li> O lançamento do software controlador do robô CT-IFP, inicializar o robô, e mover o robô para as três posições, inserindo os x, y, z alvejando posições e clicando no botão &quot;ir&quot;. </li><li> Tome uma tomografia computadorizada no seguinte x, y, z coordenadas: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; e (4) 0,0,10. Selecione um kV 90, 10 mA, 16 varredura seg usando o software CT-scanner e pressione &#39;Start&#39; para iniciar a digitalização. Reconstruir a digitalização como descrito em 3.10. </li></ol></li><li> Inicie o software de alinhamento robô CT-IFP. Clique no botão &quot;adicionar&quot; carregado na região &quot;Dados de Registo&quot; e selecione os quatro varreduras de registro reconstruídos obtidos em 4.3, clique em &#39;open&#39;. NOTA: A localização de pixel do marcador fiducial serão automaticamente inseridos no softwaré. <ol><li> Clique no botão &quot;Calcular Transformar &#39;e depois clique no botão&quot; Aplicar Transformação&#39;. Isto gera dados de alinhamento que vai ser usado para converter o robô CT-IFP sistema de coordenadas para o aparelho de tomografia computadorizada sistema de coordenadas. Após a calibração estiver completa, coloque a plataforma de animal para o robô CT-IFP. </li></ol></li><li> Anestesiar cada rato utilizando 2% de isoflurano misturado com ar medicinal ou oxigénio e confirme apertando o dedo do pé e observando nenhuma reação. Imobilizar animal na plataforma do robô CT-IFP e posicione o mouse de modo que o tumor é acessível para o sistema do robô CT-IFP. Imobilizar o tumor utilizando fita adesiva de tal modo que não se move durante a inserção da agulha IFP. </li><li> Efectuar uma análise micro-CT anatômica antes de inserir a agulha IFP. Reconstruir os dados CT usando as etapas descritas em 3.10. </li><li> Carregar os dados de inserção CT pré-agulha para o software de alinhamento robô CT-IFP. Ajustar a janela e o nível de visualizar o tumor. Clique no the borda do tumor em qualquer imagem, em seguida, clique em um segundo local aro. NOTA: O software irá calcular uma série de posições ao longo de uma linha linear entre as duas posições. Note-se a x, y e z coordenadas para uma série de 5 a 8 posições uniformemente espaçadas a partir da lista. </li><li> Prepara-se o sistema PI, através de lavagem da agulha com uma solução salina de heparina antes da inserção. </li><li> Digite as primeiras posições da agulha pré-determinados para o x, y, z, para o software de controle do robô CT-IFP e pressione-move para o botão &quot;ir&quot; para mover o robô para a posição desejada. Clique no botão &quot;Insert agulha &#39;para inserir a agulha no tecido. <ol><li> Depois de inserir a agulha garantir uma boa comunicação fluida entre a agulha IFP eo tecido apertando e soltando o tubo PE20, observando que os IFP aumentos de medição e retorna ao valor de pré-beliscar sobre o software de aquisição de IFP. Rejeitar as medições que não retornam à linha de base. </li></ol></li><li> adquirir umaTC anatômica com a agulha inserida, em seguida, clique no botão &quot;Retração da agulha &#39;no software de controle do robô CT-IFP para retrair a agulha do tecido. Rejeitar quaisquer medições IFP onde o valor IFP não regressa ao valor de inserção pré-agulha após a retirada da agulha. Isto significa que a agulha pode ter sido obstruído durante a medição. Repita os passos 4,8-4,10 para cada posição da agulha. </li><li> Determinar a posição da agulha no interior do volume do tumor por meio do cálculo das posições x, y, e z da porta da agulha em relação ao centro de massa do volume de tumor tal como identificado na pós-inserção varrimento CT volumétrica da agulha. </li><li> Retornar animais para sua gaiola depois de todas as medições estão completos. Não deixar os animais sem vigilância, e cuidar para observá-los até que a consciência foi recuperado e eles são capazes de manter decúbito esternal. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar

Os métodos de medição com base em imagens aqui apresentadas permitir a determinação da distribuição espacial das propriedades microcirculação tumor, IFP e acumulação CT-lipossoma. As tentativas anteriores de se relacionar essas propriedades têm contado com a realização de medições em massa em vários animais portadores de tumor e, portanto, não têm a sensibilidade para elucidar os mecanismos responsáveis ​​pela heterogeneidade na acumulação intra-tumoral que tem sido comumente observada para os sistemas de distribuição d...

Medição da acumulação intra-tumoral de sistemas de entrega de droga de nanopartículas podem ser uma ferramenta importante para determinar se uma concentração adequada de droga citotóxica foi atingido no interior do tumor. O desenvolvimento de sistemas de lipossomas &quot;imagem-poder&quot; permite a não-invasivo e quantitativa in vivo de detecção do veículo de entrega da droga usando métodos de imagem como a tomografia por emissão de positrões (PET) 1, fluorescência óptica 2, e tomografia computadorizada (CT) 3, 4 e ressonância magnética (MRI) 5. Imagem tem sido usado para determinar a farmacocinética e biodistribuição de sistemas de entrega de lipossomas e para revelar o grau de heterogeneidade inter-sujeito e intra-tumoral na acumulação de nanopartículas 6,7. No entanto, a imagem latente de nanopartículas sozinho não identificar as barreiras biológicas que têm contribuído para a sua má acumulação e distribuição. Este conhecimento é fundamental para o rdesenvolvimento acional de formulações mais eficazes e estratégias para melhorar a acumulação intra-tumoral 8. Demonstrou-se que as estratégias terapêuticas pode ser aplicada para modular as barreiras biológicas específicas resultando na melhoria do transporte de nanopartículas 9. Além disso, as formulações de nanopartículas têm sido desenvolvidos especificamente para superar a barreira biológica específica de transporte 10. Em ambos os casos, as medições de barreiras biológicas pode ser utilizado para orientar o uso de uma estratégia adequada de administração de fármaco de nanopartículas. Microcirculação do tumor e elevada IFP são acreditados para ser dois principais determinantes da acumulação intra-tumoral das nanopartículas, tal como lipossomas, em tumores sólidos 9,11. No entanto, outras barreiras que contribuem para a acumulação de lipossomas pobres incluem uma matriz densa extracelular, vasculatura impermeável e pressão tecido sólido 12. Estas barreiras estão relacionados em um espaço-temporalforma, com o fluxo sanguíneo anormal e pressão do fluido intersticial elevada sendo dois importantes fatores que impulsionam a entrega inicial e extravasamento de nanopartículas. Como discutido anteriormente, que estabelece a relação entre a microcirculação do tumor, IFP elevada, e a acumulação intratumoral de lipossomas é imperativo para a correcta interpretação dos dados de imagem de lipossomas. Nisto métodos quantitativos para medir a relação entre a microcirculação do tumor, IFP elevada, e acumulação de nanopartículas num tumor sólido são apresentados. Isto é conseguido através da realização de medições co-localizada da distribuição intra-tumoral de um agente de contraste de lipossoma CT usando tomografia computadorizada volumétrica, microcirculação tumor usando contraste dinâmico aprimorado tomografia computadorizada, e IFP tumor utilizando um sistema de posicionamento da agulha robótico guiada por imagem, denominado o robô CT-IFP 13.

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 células tumorais de adenocarcinoma de mama metastático</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicilina-Estreptomicina 100x Solução</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), fenol vermelho</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)</td><td>Avanti Lipids Inc., EUA</td><td>850355P</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol (CH)</td><td>Avanti Lipids Inc., EUA</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-poli(etilenoglicol) 2000 (DSPE-PEG2000)</td><td>Avanti Lipids Inc., EUA</td><td>880128P</td><td></td></tr><tr><td>Omnipaque (Iohexol) 300 mg de iodo/ml&nbsp;</td><td>GE Healthcare, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes</td><td>Whatman Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes</td><td>Whatman Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 m Lipex Extruder&nbsp;</td><td>Nothern Lipids Inc, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolsa de Diálise Corte de Peso Molecular (MWCO) de 8 kDa</td><td>Spectrum Labs, EUA&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>750.000 Coluna de fluxo tangencial de corte de peso molecular nominal (NMWC)</td><td>Cartucho de ultrafiltração MidGee, GE Healthcare, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica&nbsp;</td><td>Watson Marlow Inc., Espectrômetro UV Helios</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>&gamma;, Spectronic Unicam,&nbsp; Analisador de</td> tamanho de partícula USA <td></td><td></td></tr><tr><td>90Plus&nbsp;</td><td>Brookhaven, Holtsville, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eXplore Locus Ultra micro-CT system&nbsp;</td><td>GE Healthcare, CA</td><td></td><td>Manipulado usando o software CT-Console</td></tr><tr><td>Reconstrução baseada em GPU AxRecon</td><td>&nbsp; Acceleware Corp. CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G Cateter SURFLO Conjunto de Infusão Alada</td><td>Terumo Medical Products, EUA</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>PE20 tubo de polietileno</td><td>Becton Dickinson, EUA</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Ponta da caneta 25 G &vezes; 3.5&prime; &prime; Agulha espinhal Whitacre&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>405140</td><td>Agulha IFP</td></tr><tr><td>P23XL&nbsp; transdutor de pressão&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus, CA</td><td>P23XL</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 4/35, Bridge Amp, com LabChart Pro 7.0</td><td>ADInstruments Pty Ltd., EUA</td><td>PL3504, FE221</td><td>Sistema de aquisição IFP e software de aquisição</td></tr><tr><td>CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot)</td><td>Parallax Innovations, CA</td><td></td><td>Manipulado usando o software de controle do robô CT-IFP</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> de alinhamento do robô <td>CT-IFP Personalizado Software Matlab</td></tr> Software <tr><td>de análise</td><td></td><td></td> DCE-CT <td>Software Matlab personalizado</td></tr><tr><td>Matlab 2013b</td><td>Mathworks, EUA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medidas espaciais de perfusão, intersticial pressão do produto e lipossomas acumulação em tumores sólidos

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

A acumulação intra-tumoral heterogêneo de lipossomas é um factor determinante da sua eficácia. Tanto a microcirculação tumor caótica e elevada IFP estão ligados à distribuição intra-tumoral heterogêneo de sistemas de entrega de medicamentos à base de nanotecnologia, tais como lipossomas. No presente estudo, a relação entre a microcirculação tumor, IFP elevada e acúmulo de nanopartículas foi investigada através de in vivo experimentação. Isto foi conseguido através da avaliação da microcirculação tumor usando contraste dinâmico tomografia computadorizada (DCE-CT) e medição de IFP tumor usando um novo sistema de colocação da agulha robótico guiada por imagem conectado ao scanner micro-CT. A acumulação intra-tumoral de lipossomas foi determinado por avaliação com base em imagens CT de uma formulação lipossomal nanopartícula que encapsular estavelmente o iohexol agente de contraste (CT-lipossomas). CT imagiologia permitido para a co-localização da distribuição espacial dehemodinâmica tumorais, IFP e acumulação CT-lipossomas em um rato modelo de xenoenxerto subcutâneo individual de cancro da mama. Medições levou à descoberta de que a perfusão e a fração de volume de plasma são fortes mediadores de a distribuição intra-tumoral de lipossomas. Além disso, os resultados sugerem que o IFP desempenha um papel indireto na mediação de distribuição de lipossomas através de modulação do fluxo sanguíneo.

O protocolo acima referido deve render CT-lipossomas com uma concentração encapsulada de iohexol, diâmetro médio de lipossomas, e potencial zeta de 55 mg ml -1, 91,8 ± 0,3 nm e -45,5 ± 2,5 mV, respectivamente. Figura 1a inclui imagem representativa DCE-CT resultados, produzindo uma série temporal de dados volumétricos que mostram as mudanças temporais na acumulação intra-tumoral de iohexol. Selecção de uma ROI dentro do tumor produz um tique que pode ser quant...

O acúmulo intratumoral heterogêneo de lipossomas tem sido associado a um microambiente tumoral anormal. Aqui são apresentados métodos para medir a microcirculação tumoral por imagem de perfusão e pressão elevada do fluido intersticial (IFP) usando um sistema robótico guiado por imagem. As medições são comparadas ao acúmulo intratumoral de lipossomas, determinado por meio de microtomografia computadorizada volumétrica.

Medidas espaciais de Perfusão, intersticial pressão do produto e lipossomas Acumulação em tumores sólidos

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and ...

O objetivo geral deste experimento é relacionar o acúmulo intratumoral de nanoterapêuticos às propriedades do microambiente tumoral, incluindo a microcirculação tumoral e a pressão intersticial elevada do fluido, ou PIF. Este método nos permite responder perguntas importantes sobre nanomedicamentos. Perguntas como: o que impulsiona a captação heterogênea de nanopartículas dentro de um tumor?A principal vantagem desta técnica é que permite a obtenção de mapas espaciais co-localizados das propriedades do microambiente tumoral e da distribuição intratumoral de nanopartículas. Após confirmar o nível apropriado de anestesia por palpação, aplique pomada nos olhos do camundongo e prenda as patas do animal na posição prona sobre uma placa plástica fina. Em seguida, insira um cateter personalizado de 27 gauge conectado a um segmento de 20 centímetros de tubo PE10 na veia lateral da cauda e fixe o tubo com várias tiras de fita adesiva.Agora, encha uma seringa de um mililitro com pelo menos 200 microlitros de lipossomos de tomografia computadorizada, ou CT, e uma seringa de um mililitro com pelo menos 150 microlitros de uma mistura em proporção volumétrica de 9-1 de iohexol livre em solução salina. Coloque a seringa com lipossomos de CT em uma bomba de infusão e conecte o cateter à seringa, ajustando a taxa da bomba para 600 microlitros por minuto, equivalente a 10 microlitros por segundo. Em seguida, posicione o camundongo na plataforma do scanner de micro-TC e use o sistema de posicionamento a laser para ajustar o tumor, de modo que fique aproximadamente na mesma orientação em cada aquisição.Utilizando o software do console do scanner de TC para cada protocolo de imagem de interesse, selecione brilho escuro no menu suspenso e clique no botão de escaneamento para iniciar a calibração e inicializar o sistema. Para obter uma micro-TC volumétrica anatômica do tumor antes da injeção de qualquer agente de contraste, verifique primeiro o indicador do software do console do scanner de TC para confirmar que as travas de segurança do scanner de TC foram liberadas. Em seguida, selecione a varredura que utiliza uma energia de raios X de 80 quilovolts, uma corrente de tubo de 70 miliampères e captura 1.000 projeções de imagem.Em seguida, inicie a varredura. Quando a varredura for concluída, ajuste a bomba para injetar aproximadamente 150 microlitros da solução de lipossomos e pressione o botão de início para injetar a bolus de lipossomos de CT na concentração de 55 miligramas de iodo por mililitro de solução. Lave manualmente o cateter com 50 microlitros de solução salina para garantir que toda a quantidade do agente lipossomal tenha sido injetada e que o cateter tenha sido limpo.Após 10 minutos, realize uma segunda varredura anatômica do tumor, conforme acabou de ser demonstrado. Para realizar uma TC com contraste dinâmico (DCE-CT), coloque uma seringa com solução livre de iohexol na bomba de infusão e configure a bomba para injetar 100 microlitros do iohexol na mesma taxa de injeção. Esses volumes de injeção são maiores que o padrão de 200 microlitros, mas os animais são monitorados durante a recuperação e nenhum evento adverso foi observado.Em seguida, no console do scanner de TC, selecione uma varredura dinâmica de cinco minutos usando uma energia de raios X de 80 quilovolts e uma corrente de tubo de 90 miliampères, conforme acabou de ser demonstrado, que captura 416 projeções de imagem a cada um segundo durante os primeiros 30 segundos, seguido por 416 projeções de imagem a cada 10 segundos. Capture cinco segundos de dados de TC-DCE, então inicie a bomba de injeção. Ao final da varredura, realize uma terceira varredura micro-TC anatômica volumétrica.48 a 70 horas depois, capture imagens anatômicas de tomografia computadorizada dos lipossomos utilizando as mesmas configurações volumétricas recém-demonstradas. Para medir a PIIF, fixe o animal na plataforma robótica de PIIF por meio de fita adesiva, de modo que o tumor fique imobilizado e acessível ao sistema robótico de PIIF por TC. Obtenha uma tomografia computadorizada microanatômica conforme recém-demonstrado.Em seguida, carregue os dados pré-inserção da agulha no software de alinhamento do robô CT IFP e ajuste a janela e o nível para visualizar o tumor. Clique na borda do tumor em qualquer imagem, seguido pela seleção de um segundo ponto na borda do lado adjacente do tumor. O software calculará uma série de posições ao longo de uma linha reta entre os dois pontos.Em seguida, selecione as coordenadas X, Y e Z para uma série de cinco a oito posições espaçadas uniformemente na lista. A seguir, aspire o sistema de agulha do IFP com uma solução salina de heparina e insira as primeiras posições predeterminadas da agulha nas janelas de coordenadas X, Y e Z do software de controle do robô de IFP por TC. Pressione o botão de avançar para mover o robô até a localização desejada.Em seguida, para cada posição da agulha sucessivamente, clique no botão inserir agulha para introduzir a agulha no tecido. Aperte e solte o tubo PE20 para confirmar uma boa comunicação de fluido entre a agulha de PFI e o tecido, observando que a medida de PFI aumenta e retorna ao valor prévio ao aperto no software de aquisição de PFI. Por fim, adquira uma tomografia computadorizada anatômica com a agulha inserida, clicando no botão retrair agulha ao final da aquisição para remover a agulha do tecido.A seleção de uma região de interesse dentro do tumor fornece uma curva de tempo/intensidade que pode ser utilizada para obter estimativas quantitativas de parâmetros hemodinâmicos específicos no tumor. A segmentação do volume tumoral em múltiplas regiões de interesse de tamanho igual permite a quantificação da distribuição espacial desses parâmetros dentro do volume tumoral. A biodistribuição dos lipossomos de TC 48 horas após a injeção também pode ser observada.Como indicado, o agente ainda está circulando no sistema vascular, com captação substancial observada no baço e no fígado. A acumulação intratumoral dessas lipossomas de TC é heterogênea, com acúmulo predominantemente periférico em comparação ao centro do tecido tumoral. A agulha pode ser claramente identificada por micro-TC de alta resolução, permitindo a localização espacial das medidas de PIF dentro do volume tumoral.A medição espacialmente co-localizada da profusão e da fração de volume plasmático demonstra uma correlação significativa com o acúmulo intratumoral de lipossomos de TC em tumores subcutâneos. Além disso, a distribuição radial da PIF correlaciona-se com outras medições hemodinâmicas, sugerindo uma relação espacial/temporal complexa entre a microcirculação tumoral, a PIF e o acúmulo intratumoral dos lipossomos. Ao realizar este procedimento, é importante fixar o animal na cama do scanner, garantindo movimento mínimo do tumor entre as medições de PIF.As implicações deste trabalho estendem-se ao desenvolvimento de novas terapias. O transporte de nanopartículas é uma etapa inicial fundamental para a criação de terapêuticas eficazes baseadas na nanomedicina. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como mapear espacialmente a pressão intersticial do fluido tumoral, a microcirculação tumoral e a distribuição de nanopartículas.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fluxo de fluido intersticial é elevada em tumores sólidos e pode modular a invasão de células tumorais. Descrevemos aqui uma técnica para aplicar o fluxo de fluido intersticial para as células embebidas numa matriz e, em seguida medir os seus efeitos sobre a invasão celular. Esta técnica pode ser facilmente adaptado para estudar outros sistemas.

Um modelo tridimensional de Cultura Celular para avaliar os efeitos de fluxo de fluido intersticial na invasão da célula tumoral

O protocolo romance relatado no presente estudo permite a detecção seletiva de metástases pulmonares em resolução única célula em camundongos...

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

Este vídeo descreve uma técnica de medição da pressão do fluido intersticial dentro de um tumor por imagem de perfusão usando um sistema robótico guiado por imagem. As medidas são comparadas ao acúmulo intratumoral de lipossomas, dentro de um tumor sólido.

Medição espacial da pressão do fluido intersticial tumoral: um método para medir a pressão do fluido intersticial

Neste artigo, apresentamos um método para analisar microvasos tumorais in vivo utilizando dinâmica com contraste de fluorescência videomicroscopia. Dois parâmetros quantitativos foram adquiridos: densidade capilar funcional refletindo a vascularização do tumor, e perdas de índice que reflete o vazamento de parede endotelial.

Imagem in vivo da angiogênese tumoral utilizando fluorescência confocal Videomicroscopia

Um método é apresentado para medir a velocidade do fluxo sanguíneo microcirculatório em metástases de câncer de pulmão da superfície pleural em ratos de forma automatizada, usando microscopia intravital pulmonar de tórax fechado. Este modelo tem potencial para ser usado como uma ferramenta amplamente difundida para realizar pesquisas fisiológicas sobre metástases pulmonares em roedores.

Automated Medição da microcirculação sanguínea velocidade na Pulmonar Metástases of Rats

O uso de fluoróforos para imagens in vivo pode ser bastante limitado por opsonização, depuração rápida, baixa sensibilidade de detecção e efeitos citotóxicos no hospedeiro. O encapsulamento de fluoróforos em lipossomas por hidratação e extrusão de filme leva à extinção e proteção de fluorescência, o que permite imagens in vivo com alta sensibilidade de detecção.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para In Vivo Imageamento óptico

Este protocolo descreve a intravital imagem de ratos transgênicos expressando marcadores fluorescentes específicos de célula. Intravital imagem fornece um método não-invasivo para observações de alta resolução em animais vivos usando windows implantáveis, através do qual a visualização microscópica de processos é possível. Este método é especialmente útil para estudar processos longitudinais.

A microscopia intravital da vasculatura Tumor-associado usando avançada Dorsal câmaras de janela dobras cutâneas em ratos transgênicos fluorescentes

Nós descrevemos dois métodos para avaliar a permeabilidade vascular transiente associada com o microambiente do tumor da função da entrada da metástase (TMEM) e da intravasação da pilha de cancro usando a injeção intravenosa do dextrano high-molecular do peso (155 kDa) nos ratos. Os métodos incluem a imagem latente intravital em animais vivos e a análise fixa do tecido usando a imunofluorescência.

Avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido

O objetivo deste protocolo é sintetizar lipossomas fluorescentemente marcados e usar citometria de fluxo para identificar a localização in vivo de lipossomas em nível celular.

Preparação, Administração e Avaliação da Captação Celular Tecido-Específica In Vivo de Lipossomas Marcados com Corante Fluorescente

Este protocolo apresenta um modelo tumor-on-a-chip fisiologicamente relevante para realizar pesquisa básica e translacional de câncer humano de alto rendimento, rastreamento avançado de drogas, modelagem de doenças e abordagens de medicina personalizada com uma descrição de procedimentos de carregamento, manutenção e avaliação.

Estabelecendo um Modelo Fisiológico de Microtumor Vascularizado Humano para Pesquisa em Câncer

A tradução dos achados da microscopia intravital é desafiada por sua penetração em profundidade rasa no tecido. Aqui, descrevemos um modelo de camundongo com câmara de janela dorsal que permite o co-registro de microscopia intravital e modalidades de imagem clinicamente aplicáveis (por exemplo, TC, RM) para correlação espacial direta, potencialmente simplificando a tradução clínica dos achados da microscopia intravital.

Um modelo de camundongo tumoral de câmara de janela de dobra cutânea dorsal para microscopia intravital combinada e ressonância magnética na pesquisa translacional do câncer

Aprenda a mapear espacialmente a pressão intersticial, microcirculação tumoral e acumulação de lipossomas em tumores sólidos usando micro-CT e robótica. Este método avançado permite correlacionar propriedades do microambiente com a distribuição de nanoterapêuticos.

Medidas espaciais de Perfusão, intersticial pressão do produto e lipossomas Acumulação em tumores sólidos

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