Medidas espaciais de Perfusão, intersticial pressão do produto e lipossomas Acumulação em tumores sólidos

O objetivo geral deste experimento é relacionar o acúmulo intratumoral de nanoterapêuticos às propriedades do microambiente tumoral, incluindo a microcirculação tumoral e a pressão intersticial elevada do fluido, ou PIF. Este método nos permite responder perguntas importantes sobre nanomedicamentos. Perguntas como: o que impulsiona a captação heterogênea de nanopartículas dentro de um tumor?

A principal vantagem desta técnica é que permite a obtenção de mapas espaciais co-localizados das propriedades do microambiente tumoral e da distribuição intratumoral de nanopartículas. Após confirmar o nível apropriado de anestesia por palpação, aplique pomada nos olhos do camundongo e prenda as patas do animal na posição prona sobre uma placa plástica fina. Em seguida, insira um cateter personalizado de 27 gauge conectado a um segmento de 20 centímetros de tubo PE10 na veia lateral da cauda e fixe o tubo com várias tiras de fita adesiva.

Agora, encha uma seringa de um mililitro com pelo menos 200 microlitros de lipossomos de tomografia computadorizada, ou CT, e uma seringa de um mililitro com pelo menos 150 microlitros de uma mistura em proporção volumétrica de 9-1 de iohexol livre em solução salina. Coloque a seringa com lipossomos de CT em uma bomba de infusão e conecte o cateter à seringa, ajustando a taxa da bomba para 600 microlitros por minuto, equivalente a 10 microlitros por segundo. Em seguida, posicione o camundongo na plataforma do scanner de micro-TC e use o sistema de posicionamento a laser para ajustar o tumor, de modo que fique aproximadamente na mesma orientação em cada aquisição.

Utilizando o software do console do scanner de TC para cada protocolo de imagem de interesse, selecione brilho escuro no menu suspenso e clique no botão de escaneamento para iniciar a calibração e inicializar o sistema. Para obter uma micro-TC volumétrica anatômica do tumor antes da injeção de qualquer agente de contraste, verifique primeiro o indicador do software do console do scanner de TC para confirmar que as travas de segurança do scanner de TC foram liberadas. Em seguida, selecione a varredura que utiliza uma energia de raios X de 80 quilovolts, uma corrente de tubo de 70 miliampères e captura 1.000 projeções de imagem.

Em seguida, inicie a varredura. Quando a varredura for concluída, ajuste a bomba para injetar aproximadamente 150 microlitros da solução de lipossomos e pressione o botão de início para injetar a bolus de lipossomos de CT na concentração de 55 miligramas de iodo por mililitro de solução. Lave manualmente o cateter com 50 microlitros de solução salina para garantir que toda a quantidade do agente lipossomal tenha sido injetada e que o cateter tenha sido limpo.

Após 10 minutos, realize uma segunda varredura anatômica do tumor, conforme acabou de ser demonstrado. Para realizar uma TC com contraste dinâmico (DCE-CT), coloque uma seringa com solução livre de iohexol na bomba de infusão e configure a bomba para injetar 100 microlitros do iohexol na mesma taxa de injeção. Esses volumes de injeção são maiores que o padrão de 200 microlitros, mas os animais são monitorados durante a recuperação e nenhum evento adverso foi observado.

Em seguida, no console do scanner de TC, selecione uma varredura dinâmica de cinco minutos usando uma energia de raios X de 80 quilovolts e uma corrente de tubo de 90 miliampères, conforme acabou de ser demonstrado, que captura 416 projeções de imagem a cada um segundo durante os primeiros 30 segundos, seguido por 416 projeções de imagem a cada 10 segundos. Capture cinco segundos de dados de TC-DCE, então inicie a bomba de injeção. Ao final da varredura, realize uma terceira varredura micro-TC anatômica volumétrica.

48 a 70 horas depois, capture imagens anatômicas de tomografia computadorizada dos lipossomos utilizando as mesmas configurações volumétricas recém-demonstradas. Para medir a PIIF, fixe o animal na plataforma robótica de PIIF por meio de fita adesiva, de modo que o tumor fique imobilizado e acessível ao sistema robótico de PIIF por TC. Obtenha uma tomografia computadorizada microanatômica conforme recém-demonstrado.

Em seguida, carregue os dados pré-inserção da agulha no software de alinhamento do robô CT IFP e ajuste a janela e o nível para visualizar o tumor. Clique na borda do tumor em qualquer imagem, seguido pela seleção de um segundo ponto na borda do lado adjacente do tumor. O software calculará uma série de posições ao longo de uma linha reta entre os dois pontos.

Em seguida, selecione as coordenadas X, Y e Z para uma série de cinco a oito posições espaçadas uniformemente na lista. A seguir, aspire o sistema de agulha do IFP com uma solução salina de heparina e insira as primeiras posições predeterminadas da agulha nas janelas de coordenadas X, Y e Z do software de controle do robô de IFP por TC. Pressione o botão de avançar para mover o robô até a localização desejada.

Em seguida, para cada posição da agulha sucessivamente, clique no botão inserir agulha para introduzir a agulha no tecido. Aperte e solte o tubo PE20 para confirmar uma boa comunicação de fluido entre a agulha de PFI e o tecido, observando que a medida de PFI aumenta e retorna ao valor prévio ao aperto no software de aquisição de PFI. Por fim, adquira uma tomografia computadorizada anatômica com a agulha inserida, clicando no botão retrair agulha ao final da aquisição para remover a agulha do tecido.

A seleção de uma região de interesse dentro do tumor fornece uma curva de tempo/intensidade que pode ser utilizada para obter estimativas quantitativas de parâmetros hemodinâmicos específicos no tumor. A segmentação do volume tumoral em múltiplas regiões de interesse de tamanho igual permite a quantificação da distribuição espacial desses parâmetros dentro do volume tumoral. A biodistribuição dos lipossomos de TC 48 horas após a injeção também pode ser observada.

Como indicado, o agente ainda está circulando no sistema vascular, com captação substancial observada no baço e no fígado. A acumulação intratumoral dessas lipossomas de TC é heterogênea, com acúmulo predominantemente periférico em comparação ao centro do tecido tumoral. A agulha pode ser claramente identificada por micro-TC de alta resolução, permitindo a localização espacial das medidas de PIF dentro do volume tumoral.

A medição espacialmente co-localizada da profusão e da fração de volume plasmático demonstra uma correlação significativa com o acúmulo intratumoral de lipossomos de TC em tumores subcutâneos. Além disso, a distribuição radial da PIF correlaciona-se com outras medições hemodinâmicas, sugerindo uma relação espacial/temporal complexa entre a microcirculação tumoral, a PIF e o acúmulo intratumoral dos lipossomos. Ao realizar este procedimento, é importante fixar o animal na cama do scanner, garantindo movimento mínimo do tumor entre as medições de PIF.

As implicações deste trabalho estendem-se ao desenvolvimento de novas terapias. O transporte de nanopartículas é uma etapa inicial fundamental para a criação de terapêuticas eficazes baseadas na nanomedicina. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como mapear espacialmente a pressão intersticial do fluido tumoral, a microcirculação tumoral e a distribuição de nanopartículas.