Name: Caracterização funcional de macrófagos regulatórios que inibem a imunidade reativa ao enxerto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a caracterizar macrófagos regulatórios infiltrantes em corações aloenxertados usando citometria de fluxo e co-cultura com células T. Este método permite estudar a modulação da resposta imune e melhorar a sobrevida do enxerto.

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Reconhecemos as contribuições técnicas dos Centros de Citometria de Fluxo, Microcirurgia e Biopositório / Patologia de Excelência em Pesquisa no Monte Sinai. Este trabalho foi apoiado pela Ação COST BM1305: Ação para Focar e Acelerar Terapêuticas Tolerogênicas Celulares (A FACTT), os fundos de desenvolvimento do Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Institute, Ministério da Ciência e Inovação SAF2013-48834-R e SAF2016-80031-R JO

<html> Neste estudo, os camundongos são alojados de acordo com as diretrizes do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos e as recomendações do Guia do Serviço de Saúde Pública para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todas as técnicas experimentais envolvendo uso animal foram realizadas de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Utilização e Cuidados de Animais Institucionais (IACUC) da Faculdade de Medicina Mount Sinai. 1. Preparação de mídia <ol><li> Prepare o meio RPMI 1640 completo com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (10 000 U / mL) usando L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais 0,1 mM, HEPES 5 mM e 0,05 mM 2 -mercaptoetanol. </li></ol> 2. Isolamento de aloenxerto e suspensão de célula única NOTA: A técnica de transplante e anastomose da artéria pulmonar e da veia de cava inferior foi inicialmente descrita por Corry e colaboradores e pode ser visualizada em Liu &amp; KangS = &quot;xref&quot;&gt; 10 , 11 ( Figura 1A ). <ol><li> Anestesiar um rato transplantado com 4-5% de isoflurano numa câmara de indução. Sacrifique-o pela luxação cervical. </li><li> Faça uma incisão abdominal na linha média com tesoura padrão e remova o conteúdo abdominal para localizar a aorta. NOTA: O coração transplantado estará no lado direito da aorta abdominal do receptor ( Figura 1B ). </li><li> Retire o enxerto suavemente usando pinças finas de dentes afiados e coloque-o imediatamente em meio RPMI gelado. NOTA: O uso de uma tesoura cirúrgica para separar o enxerto da aorta pode danificar o enxerto e fazer com que algum tecido permaneça aderido ao destinatário. </li><li> Depois de todos os enxertos terem sido coletados, mova-os para uma capa de cultura estéril para o processamento de tecidos. Coloque o enxerto em uma placa de Petri e corte o tecido em pequenos pedaços (1 mm) usando tesoura de microcirurgia estéril e contundente. </li><li> Com dentes afiados forcEps, transfira as peças para um tubo de 50 mL com 5 mL de colagenase A (0,1 mg / mL de colagenase em 1x PBS estéril). Incubar durante 1 h em um banho de 37 ° C. </li><li> Adicione 5 mL de meio RPMI para neutralizar a colagenase e transferir a amostra através de um filtro de 100 μm com a ajuda do êmbolo de uma seringa de 1 ml. </li><li> Gire a amostra para baixo a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 mL de tampão de lise de ACK. Misture bem e incube durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Adicione 1 mL de meio RPMI para neutralizar o tampão de lise e gire a amostra para baixo a 400 xg durante 5 m a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 200 μL de meio RPMI e transferi-lo para um tubo redondo de fundo de polipropileno de 5 mL. NOTA: Os tubos de polipropileno suportam menos aderência. Além disso, manter as células a baixa temperatura, como 4 ° C, reduz a adesão. </li></ol> 3. Isolamento de macrófagos infiltrantes de enxerto usando células ativadas por fluorescênciaIng <ol><li> Bloqueie a ligação específica indesejada em células mieloides utilizando o mAb de bloqueio do receptor Fc (CD16 / 32 de rato anti-mouse). Adicione 1-2 μL por amostra, 15 min antes da coloração da superfície. </li><li> Mancha com o CD11b Percp / Cy5.5 anti-mouse (concentração final de 0,6 μg / μL no meio RPMI), APC / eFluor780 anti-mouse (0,6 μg / μL), APC Ly6C anti-mouse (2 μg / μL) E Ly6G Pe / Cy7 anti-mouse (2 μg / μL). Cubra os tubos com papel alumínio para proteger os anticorpos fluorescentes da luz e incubar os tubos na geladeira a 4 ° C durante 45 min. NOTA: Para compensações de manchas únicas, prepare um tubo de controle negativo (sem mancha) e tubos com células rotuladas individualmente com cada um dos fluorocromos. Para ajudar a configurar o portão, os controles do isotipo podem ser usados ​​especialmente para Ly6C (IgG2a) e Ly6G (IgG2b). </li><li> Lave as células duas vezes com meio RPMI e gire-as a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Conte as células usando azul de tripano e um hemocitomeR e diluí-los em 1 mL de meio RPMI por 1 x 10 6 células. Antes de ordenar, transfira as amostras através de uma tampa de tubo de filtro de células de 5 mL, 70 μm. Adicionar DAPI (1 μg / mL) como marcador de viabilidade celular e proceder a ordenar. </li><li> Como os macrófagos são células sensíveis e frágeis, defina as condições de classificação para 20 psi e use um tamanho de bico de 100 μm para isolar macrófagos usando um modo de pureza de 4 vias. </li><li> Prepare tubos de coleta com 1 mL de meio RPMI em um tubo de polipropileno de 5 mL. </li><li> Usando o software classificador, abra uma nova experiência e selecione uma experiência em branco com um painel em branco para definir as configurações. </li><li> Configure um gráfico de pontos que exiba a dispersão de frente (FSC) versus (lado a lado) e o portão em todos os leucócitos, excluindo detritos e aglomerados com a menor dispersão para frente e para o lado. A partir deste gate principal, crie um novo gráfico de pontos que exiba SSC vs. DAPI e gate em células DAPI. <ol><li> Sobre esta população recém-gated, crie anúnciosOt plot que exibe CD11b vs. CD45 e portão em macrófagos e neutrófilos de dois positivos (CD11b + CD45 + ). </li><li> A partir daqui, crie um traço de pontos final que exiba Ly6C vs. Ly6G e administre as populações desejáveis: Ly6C oi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - e Ly6C int Ly6G + ( Figura 2 ). </li></ol></li><li> Após a triagem, verifique se há pureza e viabilidade celular (&gt; 90%) e gire os tubos de recolha a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Contar as células usando azul de tripano e um hemocitômetro e ressuspendê-las na concentração desejada ( por exemplo, 1 x 10 6 macrófagos / mL) em meio RPMI completo. </li><li> Placa 50 x 10 3 macrófagos por poço em uma placa de fundo redondo de 96 poços com um volume final de 100 μL de meio RPMI completo. Deixe as células inalteradas durante pelo menos 24 h a 37 ° C e 5% de CO 2 . </li></ol> 4. IsolatioN de células T usando a classificação celular celular ativada por fluorescência NOTA: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn é uma linhagem de mouse knock-in segmentada em X que co-marca células que expressam o gene Foxp3 (forkhead box P3) com proteína fluorescente vermelha monomérica (mRFP). <ol><li> Anestesiar e sacrificar ratinhos C57BL / 6 e C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) como descrito anteriormente no passo 2.1. Isolar o baço e os linfonodos (LN: inguinal, lombar, axilar, braquial e cervical) e colocá-los rapidamente em meio RPMI gelado. </li><li> Para isolar o LN, coloque o mouse em posição supina, faça uma incisão da pele da linha média de baixo para cima, cortando cuidadosamente o peritoneu e espalhando suavemente a pele. Uma vez que todos os LN inguinal, lombar, axilar, braquial e cervical são coletados ( Figura 1C , coloridos em vermelho), cortar o peritoneu e isolar o baço no lado superior esquerdo do intestino. </li><li> Desagregar o baço e LN usando um filtro de 100 μm colocadoEm cima de um tubo de 50 mL. Usando o êmbolo de uma seringa de 1 mL, pressione suavemente o tecido. Enxaguar o filtro com o meio RPMI quantas vezes for necessário até ficar limpo. NOTA: LN e baço de cada mouse podem ser agrupados no mesmo tubo. </li><li> Gire para baixo a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 2 mL de tampão de lise ACK. Misture bem e incube durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Adicione 2 mL de meio RPMI para neutralizar o tampão de lise. Gire para baixo a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 200 μL de meio RPMI e transferi-lo para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml. </li><li> Mancha para APC CD4 anti-mouse (0,6 μg / μL) e / ou CD8 PeCy7 anti-mouse (2 μg / μL). Cubra os tubos com papel alumínio para proteger os anticorpos fluorescentes da luz e incubar os tubos na geladeira a 4 ° C durante 45 min. NOTA: Para compensações de mancha única, prepare um tubo de controle negativo (sem mancha) eTubos com células rotuladas individualmente com cada um dos fluorocromos. </li><li> Lave as células duas vezes com meio RPMI e gire-as a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Conte as células usando azul de tripano e um hemocitômetro. NOTA: O corante CFSE é fornecido como pó de éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína normalmente a 50 μg. Adicione 18 μL de DMSO a um frasco de CFSE para uma solução de reserva final de 5 mM e armazene a -20 ° C durante vários meses. </li><li> Para a marcação CFSE, ressuspenda as células coradas CD8 a uma concentração de até 10 6 células por mL em PBS a uma concentração final de trabalho de 5 μM CFSE da solução de reserva. Incubar em um banho a 20 ° C durante 5 min como descrito anteriormente 6 . NOTA: (PASSO CRÍTICO) Para células com baixa concentração (≤10 6 por mL), é essencial que as células sejam rotuladas na presença de proteína adicionada para amortecer os efeitos tóxicos do CFSE. Portanto, PBS pode conter 5% de FBS. Note que, se euO dium é usado, os aminoácidos livres podem reduzir a eficiência de rotulagem ao competir pelo CFSE. </li><li> Neutralize o CFSE com 2 mL de meio RPMI. Girar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Adicione 1 mL de meio RPMI por 1 x 10 6 células T CD8. </li><li> Antes da triagem, transfira a amostra através de um filtro de células de 70 μm numa tampa de tubo de 5 mL. Adicionar 50 μL de 1x DAPI (1 μg / mL) como marcador de viabilidade celular e proceder à triagem. NOTA: 1x significa proporção 1: 1 do reagente em relação a outro constituinte. </li><li> Defina as condições de classificação a 20 psi e 100 μm do tamanho do bocal para isolar células T CD8 + CFSE + de duplo positivo ( Figura 3A ). </li><li> Prepare tubos de coleta com 1 mL de meio RPMI em um tubo de polipropileno de 5 mL e proceda a ordenar. </li><li> Usando o software classificador, abra uma nova experiência e selecione uma experiência em branco com um painel em branco para definir as configurações. </li><li> Para o isolamento de células T CD4 + , configure um gráfico de pontos que sejaToca o FSC vs. SSC e o portão em linfócitos, excluindo detritos, bem como grandes células granulares, como células dendríticas. <ol><li> A partir deste gate principal, crie um novo gráfico de pontos que exiba SSC vs. DAPI e gate em células DAPI. </li><li> Sobre esta população recém-gated, crie um gráfico de pontos que exiba SSC vs. CD4 para isolar todas as células CD4 + ( Figura 3B ). Alternativamente, um mAb anti-CD3 pode ser usado para garantir o isolamento de populações de células T puras. NOTA: Uma pequena fração de todas as células T CD4 + (5-10%) deve ser Foxp3 + mRFP + . </li></ol></li><li> Após a triagem, verifique se há pureza e viabilidade celular (&gt; 90%) e gire os tubos de recolha a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Conte as células usando azul de tripano e um hemocitômetro. Ressuspender usando 1 mL de meio RPMI completo por 2 células de células T 6 . </li><li> Configure o teste de supressão cultivando células T com macrófagos previamente classificados. Placa 10 x 10 4 CD4 + T e 10 x 10 4 CD8 + células CFSE + T no mesmo poço em um volume final de 100 μL de meio RPMI completo. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 96 h. NOTA: Macófagos e células T foram utilizados em uma proporção de 1: 4. </li><li> Estimule a divisão de células T por lavagem de esferas magnéticas CD3 / CD28 activadoras de células T em 2 mL de PBS antes de usá-las para limpar o tampão contendo azida. Adicione 5 μL de células CD3 / CD28 de células T de mouse por poço. NOTA: Os grânulos de magnetismo são de tamanho semelhante às células apresentadoras de antígeno e são acoplados a mAb anti-CD3 e anti-CD28, oferecendo um método simples para a ativação e expansão de células T. </li></ol>

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<li>Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lymphocyte+proliferation%3A+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primarily+vascularized+allografts+of+hearts+in+mice.+The+role+of+H-2D%2C+H-2K%2C+and+non-H-2+antigens+in+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection.</a> Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).</li>
<li>Liu, F., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heterotopic heart transplantation in mice.</a> J Vis Exp. (6), e238(2007).</li>
<li>Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Derived+Suppressor+Cells+in+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Transplant+Rep%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation.</a> Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).</li>
<li>Gallina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gr-1%2BCD115%2B+immature+myeloid+suppressor+cells+mediate+the+development+of+tumor-induced+T+regulatory+cells+and+T-cell+anergy+in+tumor-bearing+host%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host.</a> Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).</li>
<li>Luan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+accumulate+in+renal+transplant+patients+and+mediate+CD4%28%2B%29+Foxp3%28%2B%29+Treg+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion.</a> Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).</li>
<li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+immune+cell+proliferation+and+cytotoxic+potential+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve os métodos que usamos para imuno-caracterizar subconjuntos de células mieloides infiltradas por enxerto em um modelo experimental murino de transplante cardíaco, que também é aplicável a outros tecidos em diferentes modelos experimentais murinos. A classificação de células de baixa pressão a 20 psi foi o método preferido para isolar um bom rendimento de subconjuntos de células puras. Manter a pureza de cada subconjunto mielóide é fundamental para estabelecer resultados conclusivos da capacidade d...

Este protocolo descreve técnicas in vitro para estudar a função de macrófagos infiltrantes de tecidos isolados de aloenxertos cardíacos, de acordo com sua capacidade de modular as respostas de células T. Amplamente descritos na literatura, corantes de rastreamento de células fluorescentes em combinação com citometria de fluxo, são ferramentas poderosas para estudar a função supressiva de tipos celulares específicos in vitro e in vivo. Nosso protocolo segue o método do éster de succinimidil de carboxifluoresceína (CFSE) para monitorar a proliferação de linfócitos in vitro . Quando uma célula marcada com CFSE se divide, sua progênie adquire metade do número de moléculas marcadas com carboxifluoresceína 6 . A diminuição correspondente na fluorescência celular por citometria de fluxo pode ser usada para avaliar a divisão celular, monitorando a capacidade de macrófagos supressivos para modular as respostas imunes das células T. Como o CFSE é um corante à base de fluoresceína, é compatível com um brGama de outros fluorocromos, tornando-o aplicável à citometria de fluxo multicolorida. A escolha apropriada de fluorocromos para fenotípulos também é importante para evitar a sobreposição espectral excessiva e a incapacidade de reconhecer células positivas a anticorpos, particularmente com corantes proteicos visíveis, como o CFSE 7 . Existem muitas vantagens de usar corantes fluorescentes em técnicas alternativas que medem a proliferação celular, como o ensaio de incorporação de timidina, que usa a timidina radiomarcada (TdR) 8 . Este ensaio utiliza timidina tritiada (3H-TdR) que é incorporada em novas cadeias de DNA cromossómico durante a divisão de células mitóticas. Uma preocupação de segurança associada a este ensaio é o uso de radioisótopos, uma vez que um contador beta de cintilação é usado para medir a radioatividade no DNA recuperado das células para determinar a extensão da divisão celular. Metodologicamente, o burro de timidina tritiadoAy não é flexível o suficiente para se adequar às importantes restrições de laboratório clínico, como o baixo número de células e a análise tardia após a coloração. Pelo contrário, a coloração com CFSE demonstrou prevenir a proliferação celular e interferir com marcadores críticos de ativação, como CD69, HLA-DR e CD25 9 . Portanto, a compreensão de vantagens e limitações de cada metodologia, particularmente em estudos multicoloridos, onde corantes múltiplos são usados ​​para rastrear diferentes tipos de células, é fundamental para obter resultados precisos e reprodutíveis.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1.000x 2-mercaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100x L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>100x Não Aminoácidos essenciais</td><td>Corning</td><td>25025039</td><td></td></tr><tr><td>1 M tampão HEPES&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25060CL</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Sodium Pyruvate</td><td></td><td>ThermoScientific SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptavidyn</td><td>ThermoScientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Collagenese A</td><td>Roche</td><td>70381322</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (sem cálcio& magnésio)</td> <td>Corning</td><td>21031CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro de células</td><td>Fisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampão de lise</td> Life <td>Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5mg-F</td><td></td></tr><tr><td>CFSE-FITC</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Ativador de células T de camundongo CD3/CD28</td><td>Life Technologies</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>96 poços&nbsp; Placa inferior em U</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anti-Ly6C-APC</td><td>eBioscience</td><td>175932-80</td><td></td></tr><tr><td>anti-Ly6G-Pe / Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127617</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD11b-Percp / Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45011282</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC / Cy7</td><td>eBioscience</td><td>47045182</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4-APC</td><td>eBioscience</td><td>17004181</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8-P/ Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25008181</td><td></td></tr><tr><td>LSRII Citômetro de Fluxo</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva Software</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J&nbsp;</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>008374</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Balb / c</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>000651</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização funcional de macrófagos regulatórios que inibem a imunidade reativa ao enxerto

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

A acumulação de macrófagos em órgãos transplantados tem sido reconhecida como uma característica da rejeição de aloenxerto 1 . Os monócitos imunogênicos infiltram o aloenxerto logo após o transplante, montam uma resposta reativa do enxerto contra o órgão transplantado e iniciam a rejeição dos órgãos 2 . Dados recentes sugerem que os macrófagos supressivos facilitam o transplante de longo prazo com êxito 3 e são necessários para a indução de tolerância ao transplante 4 . Isso sugere um conceito multidimensional de ontogenia, ativação e função de macrófagos, que exige um novo roteiro para isolamento e análise da função de macrófagos 5 . Devido à plasticidade dos macrófagos, é necessário fornecer uma metodologia para isolar e caracterizar macrófagos, dependendo do ambiente de tecido, e definir suas funções de acordo com diferentes cenários. Aqui, nós descrevemosSeja um protocolo para a caracterização imune de macrófagos infiltrados por enxerto e os métodos que usamos para avaliar funcionalmente sua capacidade de inibir a proliferação de CD8 + T e promover a expansão de Treg de CD4 + Foxp3 + in vitro .

Os resultados representativos mostram a estratégia de bloqueio descrita no protocolo acima. Os resultados também exibem a análise da atividade de proliferação de células T após a co-cultura com macrófagos infiltrados por enxerto. A capacidade supressiva in vitro de subconjuntos de macrófagos foi analisada na Figura 4 . Os resultados indicam que o Ly6C lo Ly6G - macrófagos obtidos de receptores tolerados são supressivos. Os resultados também...

Os macrófagos são células plasmáticas do sistema hematopoiético que desempenham um papel crucial na imunidade protetora e na homeostase. Neste relatório , descrevemos técnicas otimizadas in vitro para caracterizar fenotípica e funcionalmente macrófagos reguladores infiltrantes de enxerto que se acumulam no órgão transplantado em condições tolerogênicas.

Caracterização funcional de macrófagos regulatórios que inibem a imunidade reativa ao enxerto

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

O objetivo geral deste procedimento in vitro é caracterizar fenotípica e funcionalmente populações de macrófagos isolados de corações aloenxertados em um modelo de transplante em massa. Esses métodos podem ajudar a responder a perguntas-chave na imunidade que encontramos sobre como melhorar o sucesso na sobrevivência e tolerância do alógrafo. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o estudo de como um subconjunto de micrófagos isolados de alógrafo cardíaco infiltrado em tecido específico modula a resposta dos tecidos do hospedeiro.Depois de gerar uma suspensão unicelular do aloenxerto, bloqueie qualquer ligação não específica nas células mieloides com um a dois microlitros de anticorpo monoclonal bloqueador do receptor FC por 15 minutos. No final da incubação, corar as células com os anticorpos de superfície de células mielóides conjugadas com fluorescência apropriados por 45 minutos a quatro graus Celsius protegidos da luz. Em seguida, lave as células duas vezes em meio RPMI por centrifugação.E ressuspenda o pellet em azul de tripano para contagem. Em seguida, dilua as células para uma concentração de 10 a sexta células por mililitro em meio fresco. E filtre as células através de um filtro de 70 mícrons em um tubo de fundo redondo de cinco mililitros.Imediatamente antes da classificação, corar as células com DAPI como marcador de viabilidade e ajustar o citômetro de fluxo para os parâmetros apropriados de classificação de macrófagos. Coloque tubos cônicos de cinco mililitros contendo um mililitro de meio RPMI para coletar as células classificadas e carregue o tubo de amostra no citômetro. No software do citômetro de fluxo, selecione um experimento em branco com um painel em branco e configure um gráfico de pontos de dispersão para frente versus lateral.Gate nos leucócitos, excluindo os detritos celulares e aglomerados com a menor dispersão para frente e para o lado. A partir dessa porta pai, crie um novo gráfico de pontos que exiba a dispersão lateral versus DAPI e porta nas células negativas DAPI. Nesta população recém-fechada, crie um gráfico de pontos que exiba CD11b versus CD45 e gate nos macrófagos e neutrófilos duplos CD11b CD45 positivos.Em seguida, crie um gráfico de pontos final para exibir Ly6C versus Ly6G para permitir o bloqueio da população desejável e classificar as células. No final da classificação, confirme a pureza e a viabilidade das amostras. Coletar as células separadas por centrifugação e ressuspender o pellet para contagem em meio RPMI fresco.Diluir as populações de macrófagos até a concentração apropriada para semear cinco vezes 10 a quatro macrófagos por 100 microlitros de meio completo por poço, em uma placa de fundo redondo de 96 poços. Em seguida, coloque as células em uma incubadora de cultura de células por pelo menos 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Para isolar o T, coloque o mouse knock-in na posição supina.Primeiro, faça uma incisão na pele na linha média, cortando cuidadosamente o peritônio e espalhando suavemente a pele. Colete os gânglios linfáticos periféricos e o baço e coloque os tecidos em um filtro de 100 micrômetros em cima de um tubo cônico de 50 mililitros. Usando o êmbolo de uma seringa de 1 mililitro, pressione suavemente os tecidos linfóides através do filtro e enxágue o filtro com meio RPMI fresco até que a malha esteja limpa.Colete a suspensão de célula única por centrifugação e substitua novamente o pellet em dois mililitros de tampão de lise ACK. Após cinco minutos a quatro graus Celsius, neutralize o tampão de lise com dois mililitros de meio RPMI fresco e centrifugue as células. Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de meio fresco e transfira as células para um tubo de fundo redondo de cinco mililitros para coar com os anticorpos apropriados de coloração da superfície das células T.Após 45 minutos a quatro graus Celsius protegidos da luz, lave as células duas vezes em meio RPMI fresco e conte as células por exclusão de azul de tripano. Em seguida, dilua as células coradas com CD8 para uma concentração de uma vez 10 elevado à sexta célula por mililitro em CFSE por cinco minutos em banho-maria a 20 graus Celsius. No final da incubação, neutralizar o CFSE com dois mililitros de meio RPMI e recolher as células por centrifugação.Ressuspenda as células de uma vez 10 elevado ao sexto número de células T coradas com CD8 por mililitro de concentração média de RPMI e filtre todas as amostras de células através de um filtro de células de 70 micrômetros em tubos de fundo redondo de cinco mililitros. Em seguida, rotule as células com DAPI e prepare o citômetro de fluxo para classificação conforme demonstrado. Para isolamento de células T CD4 positivas, configure um gráfico de pontos de dispersão para frente versus lateral para gating nos linfócitos, excluindo os detritos, bem como as grandes células mieloides granulares.A partir dessa porta pai, crie um gráfico de pontos que exiba a dispersão lateral versus DAPI e a porta nas células negativas DAPI. Nessa população recém-fechada, crie um gráfico de pontos que exiba a dispersão lateral versus CD4 e um gráfico de pontos que exiba CD8 versus CFSE. Em seguida, classifique as populações de células T fechadas.No final da triagem, confirmar a pureza e viabilidade das amostras e recolher as células por centrifugação para contagem. Dilua as células para duas vezes 10 elevado a sexto de células T por mililitro de concentração de RPMI e 100 microlitros de células T em meio RPMI completo para cada poço de macrófagos para uma co-cultura de 96 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Finalmente, adicione cinco microlitros de esferas magnéticas do ativador de células T de lavagem PBS CD3 CD28 a cada poço para ativar e expandir as células T.Os macráfagos Ly6Clo Ly6G obtidos de receptores tolerados exercem um efeito supressor nas células T CD8 positivas, com uma atividade supressora modesta também observada nas células Ly6CG positivas intermediárias Ly6C. No entanto, apenas as células Ly6G Ly6Clo promovem a expansão in vitro de TReg positivo para Foxp3 CD4. Juntos, esses dados apóiam a conclusão de que os macrófagos negativos para Ly6Clo Ly6G positivos para infiltração de enxerto possuem muitas das propriedades relatadas como associadas às células supressoras derivadas de monócitos, incluindo sua capacidade de inibir a proliferação de células T CD8 e promover a expansão de TReg positivo para Foxp3 CD4.Ao tentar este procedimento, é importante manter a pureza para estabelecer dados conclusivos sobre a capacidade supressora de cada subconjunto de macrófagos. Seguindo este procedimento, outros métodos, como o uso de portões de enriquecimento comercial, podem ser usados para isolar diferentes populações de leucócitos de interesse. A classificação de macrófagos é a parte mais longa desse procedimento, mas quando dominada, essa parte da técnica pode ser concluída em oito horas se realizada corretamente.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de imunologia explorarem a capacidade supressora de macrófagos infiltrantes no modelo sim de transplante de órgãos sólidos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como caracterizar diferentes populações de macrófagos em selecionados a partir do alograma do coração de camundongo.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Os macrófagos desempenham um papel central na homeostase e patologia em muitos tecidos. O protocolo apresentado aqui descreve métodos para esgotar...

Depleção e reconstituição de macrófagos em Ratos

Descrevemos aqui um protocolo simples para isolar macrófagos peritoneais murinos. Este procedimento é seguido pela extração de RNA para realizar a análise da expressão gênica após a estimulação de receptores do tipo Toll.

Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação

Descrevemos um protocolo para enxerto de interposição aórtica em camundongos. O objetivo do protocolo é fornecer um modelo para estudar processos patológicos e estratégias terapêuticas relevantes para reações aloimunes nas artérias e as alterações arteriais resultantes que contribuem para a falha do transplante de órgãos.

Modelo rato de rejeição vascular induzida por Aloimune e Transplante Arteriosclerose

Aqui, descrevemos um protocolo para analisar o fenótipo de células T reguladoras (Treg) isoladas de camundongos infectados pelo vírus da coriomeningite linfocítica ingênua e crônica. Além disso, fornecemos um processo para avaliar a atividade supressora das células Treg.

Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir a tolerância em transplante e avaliar in vitro e em vivo a capacidade supressora de subconjuntos distintos celular do destinatário e o status imune do destinatário para doador ou antígenos exógenos.

In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados

Drogas baseadas em anticorpos revolucionaram o tratamento de doenças inflamatórias. Além de ter efeito direto sobre a alvos específicos, os anticorpos podem ativar macrófagos tornar-se anti-inflamatórios. Este protocolo descreve como anti-inflamatórios macrófago ativação pode ser avaliada in vitro, usando os macrófagos da medula óssea de rato e in vivo usando os macrófagos peritoneais.

Avaliação dos efeitos de drogas baseados em anticorpo murino da medula óssea e ativação de macrófagos peritoneais

Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

O protocolo ilustra o uso do exame histopatológico e imuno-histoquímica para perfil o macrófago de beta de receptor de folato e sua relação com a célula total imune infiltrar-se na biópsia da artéria temporal na arterite de células gigantes.

Um estudo de Immunohistopathologic de perfil o folato receptores Beta macrófago e Vascular microambiente imune na arterite de células gigantes

Apresentado aqui é um protocolo para quantificar e produzir imagens dinâmicas de células-tronco mesenquimais (MSC) regulação mediada de fagocitose macrófago (MΦ) de partículas de levedura não opssonizada (zymosan) que são conjugadas a uma molécula fluorescente sensível ao pH.

Regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose macrófago; Quantitação e Imagem

Monócitos e macrófagos são células imunes muito plásticas e reprogramáveis, cruciais para a saúde e a doença. Eles sentem e respondem a uma ampla gama de estímulos adotando programas de diferenciação e fenótipos específicos. Padronizamos um modelo in vitro para estudar a polarização e reprogramação de macrófagos, fornecendo uma ferramenta valiosa para pesquisa.

Modelo de reprogramação de macrófagos derivados de monócitos humanos para ensaios in vitro

Aprenda a caracterizar macrófagos regulatórios infiltrantes em corações aloenxertados usando citometria de fluxo e co-cultura com células T. Este método permite estudar a modulação da resposta imune e melhorar a sobrevida do enxerto.

Caracterização funcional de macrófagos regulatórios que inibem a imunidade reativa ao enxerto

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