Isolamento de perivascular Multipotentes populações de células precursoras a partir de tecido cardíaco humano

O objetivo geral deste procedimento é isolar duas populações discretas de células precursoras perivasculares multipotentes do tecido cardíaco humano. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da regeneração cardíaca, como a contribuição feita a esse processo por subconjuntos da população de células perivasculares. As principais vantagens desta técnica são que ela resulta em populações de células progenitoras de heterogeneidade reduzida e viabilidade aprimorada de uma seleção das principais técnicas de ex-adesão.

Esta técnica pode ter implicações na terapia da doença cardíaca isquêmica porque os subtipos de células-tronco perivasculares demonstraram ter potencial cardiomiogênico. Embora esse método possa fornecer informações sobre o papel das células perivasculares na regeneração cardíaca, ele também pode ser aplicado à investigação de outros aspectos da doença cardíaca, como a fibrose miocárdica. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido ao uso viável de células como resultado do frescor do tecido.

Para iniciar este procedimento, após remover o pericárdio, os vasos principais e os átrios, coloque a amostra em meio de lavagem em uma placa de Petri. Em seguida, corte o miocárdio ventricular em pequenos pedaços de aproximadamente um milímetro cúbico e processe-os imediatamente para obter o maior rendimento celular. Em seguida, faça uma solução de digestão fresca e aqueça-a a 37 graus Celsius em banho-maria.

Depois disso, filtre os pedaços de tecido suspensos através de uma peneira de 100 mícrons e lave-os duas vezes com PBS. Transfira os pedaços de tecido para um recipiente estéril de 30 mililitros com uma tampa hermeticamente fechada. Adicione a solução de digestão e coloque o recipiente dentro de um saco plástico lacrado em um banho-maria agitado a 37 graus Celsius ajustado para 120 RPM.

Após 15 minutos, inverta o recipiente três vezes. Em seguida, coloque-o de volta no banho-maria por mais 15 minutos. Em seguida, remova e tempere as colagenases com cinco mililitros de DMEM suplementado com 20% de FBS.

Em seguida, triturar o tecido digerido pipetando suavemente 10 a 20 vezes com uma pipeta sorológica de 10 mililitros para quebrar quaisquer aglomerados de tecido. Em seguida, filtre a suspensão sequencialmente através de filtros de células de 100 mícrons, 70 mícrons e, finalmente, 40 mícrons para obter uma suspensão de célula única. Em seguida, centrifugar a suspensão celular a 200 x g durante quatro minutos.

Decantar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento num mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos durante dois minutos à temperatura ambiente antes de o diluir com quatro mililitros de meio de lavagem. Repetir a etapa de centrifugação e ressuspender o pellet em um mililitro de meio de lavagem. Dilua 10 microlitros de suspensão celular com 90 microlitros de meio de lavagem para fazer uma diluição de um a 10 da suspensão celular.

Misture 10 microlitros da suspensão de células diluídas com 10 microlitros de mancha azul de tripano e coloque 10 microlitros da mistura em um hemocitômetro padrão para contagem de células. Neste procedimento, adicione 50 microlitros de soro de camundongo à suspensão celular e incube-o a quatro graus Celsius por 20 minutos para bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos. Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 200 x g por quatro minutos.

Remover o sobrenadante e ressuspendê-lo em meio de lavagem. Em seguida, alíquota de 50 microlitros da suspensão celular em cada um dos dois tubos de citometria de fluxo de fundo redondo de poliestireno para o isotipo e controles não corados e coloque o volume restante em um terceiro tubo para coloração multicolorida. Adicione cinco anticorpos à suspensão de célula única para coloração multicolorida.

Pipete suavemente para misturar os anticorpos com as células e incubar todos os tubos a quatro graus Celsius por 20 minutos no escuro. Prepare os grânulos de controle de compensação adicionando uma gota de grânulos positivos a 100 microlitros de meio de lavagem em cinco tubos de citometria de fluxo. Adicione os anticorpos individualmente a cada um dos cinco tubos.

Em seguida, incube todos os tubos a quatro graus Celsius por 20 minutos no escuro. Enquanto isso, prepare tubos de coleta de células, cada um com 500 microlitros de meio de cultura EGM-2, e coloque-os a quatro graus Celsius. Após a incubação de anticorpos, adicione cinco mililitros de meio de lavagem para lavar as células e grânulos para remover quaisquer anticorpos não ligados.

Centrifugar todos os tubos a 200 x g durante quatro minutos. Repetir as etapas de lavagem e centrifugação e decantar cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células em meio de lavagem a uma concentração de uma vez 10 elevado à 6ª células por 250 microlitros.

Em seguida, ressuspenda as contas em 100 microlitros de meio de lavagem. Transfira as suspensões de células e contas para o classificador de células no gelo no escuro. Adicione uma gota de contas negativas aos tubos de controle de compensação de contas positivas e use-os para definir a compensação de fluorescência.

Em seguida, execute as células de controle não coradas para estabelecer a fluorescência de fundo e definir as tensões. Em seguida, execute os isotipos de controle para estabelecer os limites de fluorescência de fundo relacionados à ligação inespecífica. Execute a amostra corada multicolorida e colete as populações de células pericitas e adventícias nos tubos de coleta.

Neste procedimento, adicione 100 microlitros de solução estéril de gelatina a 0,2% por centímetro quadrado de área de crescimento e agite manualmente para revestir a totalidade dos poços. Depois disso, incube as placas a quatro graus Celsisu por 10 minutos. Em seguida, remova completamente a solução de gelatina.

Mantenha as células coletadas no gelo enquanto prepara as placas de cultura. Em seguida, centrifugue as células recém-coletadas a 200 x g por quatro minutos e ressuspenda suavemente o pellet celular em uma quantidade apropriada de EGM-2. Depois, semeie as células nas placas revestidas de gelatina.

Nesta figura, as células vivas foram fechadas para excluir primeiro as células CD45-positivas, seguidas pelas células CD56-positivas. As células endoteliais CD144-positivas foram então removidas da fração CD56-negativa. Dessa população final, pericitos CD146-positivos, CD34-negativos e CD146-negativos, CD34-positivos

Ambas as culturas de pericitos miocárdicos purificados por FACS e células adventícias exibem uma morfologia celular fuso a estrelada. Uma vez dominada, essa técnica levará aproximadamente cinco horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as amostras mais frescas fornecerão o melhor rendimento de células viáveis.

Após esse procedimento, outros métodos, como a cardiomioplastia celular, podem ser realizados a fim de responder a questões adicionais, como a adequação dessas células no tratamento da cardiopatia isquêmica.