Isolamento de perivascular Multipotentes populações de células precursoras a partir de tecido cardíaco humano

O objetivo geral deste procedimento é isolar duas populações discretas de células precursoras perivasculares multipotentes a partir de tecido cardíaco humano. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da regeneração cardíaca, como a contribuição feita para esse processo por subpopulações da população celular perivascular. As principais vantagens desta técnica são a obtenção de populações de células progenitoras com menor heterogeneidade e viabilidade melhorada, em comparação com um conjunto seleto de técnicas tradicionais de adesão.

Essa técnica pode ter implicações na terapia da doença cardíaca isquêmica, pois subtipos de células-tronco perivasculares demonstraram possuir potencial cardiomiogênico. Embora este método possa fornecer informações sobre o papel das células perivasculares na regeneração cardíaca, ele também pode ser aplicado à investigação de outros aspectos da doença cardíaca, como a fibrose miocárdica. Geralmente, indivíduos novos nesse método enfrentarão dificuldades devido ao uso de células viáveis como resultado da frescor do tecido.

Para iniciar este procedimento, após remover o pericárdio, os vasos principais e as átrias, coloque a amostra em meio de lavagem em uma placa de Petri. Em seguida, corte o miocárdio ventricular em pequenos fragmentos de aproximadamente um milímetro cúbico e processe-os imediatamente para obter o maior rendimento celular possível. Então, prepare uma solução digestiva fresca e aqueça-a a 37 graus Celsius em banho-maria.

Em seguida, filtre os fragmentos de tecido suspensos através de uma peneira de 100 mícrons e lave-os duas vezes com PBS. Transfira os fragmentos de tecido para um recipiente estéril de 30 mililitros com tampa hermética. Adicione a solução de digestão e coloque o recipiente dentro de um saco plástico fechado, em um banho-maria agitado a 37 graus Celsius regulado em 120 RPM.

Após 15 minutos, inverta o recipiente três vezes. Em seguida, coloque-o novamente no banho-maria por mais 15 minutos. Depois disso, remova e inative as colagenases com cinco mililitros de DMEM suplementado com 20% de FBS.

Posteriormente, triture o tecido digerido pipetando suavemente de 10 a 20 vezes com uma pipeta serológica de 10 mililitros para desagregar quaisquer agregados de tecido. Em seguida, filtre a suspensão sequencialmente por peneiras celulares de 100 mícrons, 70 mícrons e, finalmente, de 40 mícrons para obter uma suspensão de células simples. Após isso, centrifugue a suspensão celular a 200 x g durante quatro minutos.

Decante cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda o pellet em um mililitro de tampão de lise de células vermelhas durante dois minutos à temperatura ambiente, antes de diluí-lo com quatro mililitros de meio de lavagem. Repita o passo de centrifugação e re-suspenda o pellet em um mililitro de meio de lavagem. Dilua 10 microlitros de suspensão celular com 90 microlitros de meio de lavagem para obter uma diluição de 1 para 10 da suspensão celular.

Adicione 10 microlitros da suspensão celular diluída a 10 microlitros do corante azul de tripano e coloque 10 microlitros da mistura em um hemocitômetro padrão para contagem celular. Neste procedimento, adicione 50 microlitros de soro de camundongo à suspensão celular e incube-a a quatro graus Celsius por 20 minutos para bloquear a ligação inespecífica de anticorpos. Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 200 × g durante quatro minutos.

Remova o sobrenadante e ressuspenda-o em meio de lavagem. Em seguida, alíquota 50 microlitros da suspensão celular em cada um dos dois tubos de citometria de fluxo de fundo redondo de poliestireno para os controles de isotipo e não corado e coloque o volume restante em um terceiro tubo para coloração multicolorida. Adicione cinco anticorpos à suspensão simples de células para coloração multicolorida.

Pipete suavemente para misturar os anticorpos com as células e incube todos os tubos a quatro graus Celsius por 20 minutos no escuro. Prepare as microesferas de controle de compensação adicionando uma gota de microesferas positivas a 100 microlitros de meio de lavagem em cinco tubos de citometria de fluxo. Adicione os anticorpos individualmente a cada um dos cinco tubos.

Em seguida, incubar todos os tubos a quatro graus Celsius durante 20 minutos no escuro. Enquanto isso, preparar tubos de coleta celular, cada um com 500 microlitros de meio de cultura EGM-2, e colocá-los a quatro graus Celsius. Após a incubação com o anticorpo, adicionar cinco mililitros de meio de lavagem para lavar as células e as microesferas, a fim de remover quaisquer anticorpos não ligados.

Centrifugue todos os tubos a 200 x g durante quatro minutos. Repita as etapas de lavagem e centrifugação e remova cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, re-suspenda as células no meio de lavagem numa concentração de um vezes 10 à 6ª células por 250 microlitros.

Em seguida, re-suspenda as microesferas em 100 microlitros de meio de lavagem. Transfira as suspensões celulares e de microesferas para o classificador celular mantido no gelo e ao abrigo da luz. Adicione uma gota de microesferas negativas aos tubos de controle de compensação de microesferas positivas e utilize-os para ajustar a compensação de fluorescência.

Em seguida, analise as células-controle não coradas para estabelecer a fluorescência de fundo e ajustar as voltagens. Posteriormente, analise os isotipos-controle para definir os limiares de fluorescência de fundo relacionados à ligação inespecífica. Analise a amostra corada com múltiplos cores e colete as populações de células perivasculares e adventiciais nos tubos de coleta.

Neste procedimento, adicione 100 microlitros de solução estéril de gelatina a 0,2% por centímetro quadrado de área de crescimento e agite manualmente para revestir completamente todos os poços. Em seguida, incube as placas a quatro graus Celsius por 10 minutos. Depois disso, remova completamente a solução de gelatina.

Mantenha as células coletadas no gelo enquanto prepara as placas de cultura. Em seguida, centrifugue as células recém-coletadas a 200 x g durante quatro minutos e ressuspenda suavemente o pellet celular em uma quantidade apropriada de EGM-2. Posteriormente, semeie as células nas placas revestidas com gelatina.

Nesta figura, as células vivas foram selecionadas para excluir primeiro as células positivas para CD45, seguidas pelas células positivas para CD56. As células endoteliais positivas para CD144 foram então removidas da fração negativa para CD56. A partir dessa população final, foram selecionadas e subsequentemente coletadas as células pericitárias positivas para CD146 e negativas para CD34, bem como as células adventiciais negativas para CD146 e positivas para CD34.

As culturas de pericitos miocárdicos e células adventíciais purificadas por FACS exibem uma morfologia celular fusiforme a estrelada. Uma vez dominada, esta técnica levará aproximadamente cinco horas, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as amostras mais frescas proporcionarão o melhor rendimento de células viáveis.

Após este procedimento, outros métodos, como a cardiomioplastia celular, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a adequação dessas células no tratamento da doença cardíaca isquêmica.