Name: Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprenda um método simplificado para isolar lipoproteínas de alta densidade purificadas do plasma sanguíneo humano para análise de microRNAs. Esta técnica rápida permite estudar mecanismos moleculares e funções protetoras do HDL em hepatologia e cardiologia com eficiência.

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Este trabalho foi apoiado, no todo ou em parte, pelos NIH Grants R01 AA 020758-04, U01DK 061731-13 e T32 DK 007150-38 para AJS e T32 DK 007150-38 para AA. Este é um trabalho original e não está sendo considerado em outro lugar para publicação.

1. Recolha de amostras de sangue <ol><li> Recolha de amostras de sangue em jejum venosos periféricos em tubos de 10 ml em plástico contendo anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (que tem diversas vantagens sobre os outros anticoagulantes) por punção venosa de uma veia padrão proeminente na fossa antecubital. </li><li> Centrifugar as amostras de sangue a 1600 xg durante 20 min a 4 ° C numa centrífuga de mesa a obter o plasma livre de células vermelhas do sangue e pequenas quantidades de ARN. </li><li> Sequencialmente centrifugar o sobrenadante a 3000 g (4 ° C) num rotor de balde oscilante durante 10 min para remover WBC e plaquetas e, em seguida, mais 15 min para remover as partículas remanescentes de células, respectivamente. </li><li> Medir a densidade do plasma, utilizando um densitómetro à TA de acordo com as instruções de fabrico. NOTA: O ajuste da densidade (d = 1,023 g / ml), com solução salina a 0,9% pode ser necessário após a remoção de exossomas, mas antes a uma ultracentrifugação de gradiente de densidade. </li></ol&gt; 2. exossomo Remoção de Plasma <ol><li> Retire os exossomos circulantes que têm uma densidade semelhante ao HDL e representam uma fonte quantitativamente significativo de miRNA 3. <ol><li> Para fazer isso, a adição de 252 ul de solução exossomo precipitação a 1 ml de plasma, seguido por incubação durante 30 min a 4 ° C. Para peletizar os exossomas, centrifugar a mistura durante 30 min a 1500 g a 4 ° C. </li><li> Para isolar o HDL, Transferir 1 ml do sobrenadante resultante para um tubo de ultracentrífuga policarbonato de parede espessa para processamento adicional com ultracentrifugação em gradiente de densidade (ver abaixo). </li></ol></li></ol> 3. gradiente de densidade Ultracentrifugação (Figura 1). <ol><li> Para separar HDL usar um processo de três passos empregando uma ultracentrífuga chão com um rotor de ângulo fixo operando a 448811 x G e 8 ° C, respectivamente. </li><li> Preparar três soluções de densidade diferentes sequencialmente e fresco para cada isolamento. <ol><li> Preparar a solução de A (isolamento de VLDL, d = 1,006 g / ml) por dissolução de 11,4 g de NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na e 1 ml de NaOH 1 N em 1000 mL de água destilada autoclavada-. Em seguida, adicionar um adicional de 3 ml de água esterilizada destilada. </li><li> Preparar a solução de B (isolamento de LDL, d = 1,182 g / ml) por adição de 25,2 g de NaBr a 100 ml de solução A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol). </li><li> Preparar a solução de C (isolamento de HDL, d = 1,470 g / ml) por mistura de 78,8 g de NaBr com 100 ml de solução A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Confirmar a densidade adequada à temperatura ambiente usando um densitômetro. Mantenha todas as soluções a 4 ° C até uso posterior. </li></ol></li></ol> 4. Isolamento de VLDL <ol><li> Misture 1 ml de plasma (densidade média = 1,023 g / ml) e nuclease livre 200 mL de Fat Red 7B em um tubo de ultracentrífuga 6,5 ​​ml de policarbonato de paredes espessas. </li><li> Em seguida, a camada cuidadosamente 5 ml de solução A em cima da mistura. Se necessário, adicionar gordura adicional Red 7B no topo da solução A, TO equilibrar o peso de cada tubo. Centrifugar durante 2 h (aceleração - 5), (desaceleração - 7). Nota: Durante a centrifugação, as lipoproteínas são acumulados como uma banda nas suas regiões de densidade de equilíbrio. </li><li> No final da corrida observar 2 camadas. Remover 1,5 mL da fracção VLDL representando a camada superior e armazenar a 4 ° C. </li><li> Finalmente, usando uma pipeta de transferência de 4 ml a partir do fundo do tubo contendo o LDL, HDL, albumina e fracção de ácido gordo para um novo tubo de policarbonato para o isolamento de LDL. </li></ol> 5. Isolamento de LDL <ol><li> Misturar 2 ml de solução B e 100 ul de nuclease isenta de gordura Red 7B para dentro do tubo que contém a fracção LDL e HDL (ponto 4), respectivamente. </li><li> Em seguida, centrifugar para fora para 3 horas (aceleração 9, desaceleração 7). Em seguida, remover 1,5 ml da fracção de LDL que representa a camada superior e manter a 4 ° C ou armazenar a -80 ° C. Finalmente, transferir 4 ml a partir do fundo do tubo contendo a HDLfracção para um novo tubo de policarbonato. </li></ol> 6. Isolamento de HDL <ol><li> Misturar 2 ml de solução C, 100 ul de nuclease isenta de gordura Red 7B e 15 ul de 98% β-mercaptoetanol para o tubo contendo a fracção HDL, respectivamente. </li><li> Centrifugar durante 3 h (9 aceleração, desaceleração 7). Em seguida remover 2 ml da fracção de HDL que representam a camada de topo e, ou manter a 4 ° C ou armazenar a -80 ° C. </li></ol> 7. A dessalinização e concentração da lipoproteína de Frações <ol><li> Para evitar a interferência com electroforese em gel de agarose subsequente e PCR, remover excesso de sal adicionada durante a ultracentrifugação em gradiente de densidade usando dispositivos de filtro centrífugo com o corte de peso molecular apropriado (tubo 3K para VLDL e tubo de 10K para LDL / HDL) tal como descrito nas instruções do fabricante. <ol><li> Resumidamente, após a adição de 2,5 ml de PBS frio (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 2 mM; pH 7,4) centrifuGE toda a fracção VLDL recolhidos durante densidade-gradiente ultracentrifugação a 4 ° C durante 60 min, utilizando um rotor basculante. </li><li> Dessalinizar a fracção LDL duas vezes com 10 ml de PBS frio de gelo durante 30 min cada. Em seguida, use 13 ml de gelo frio PBS duas vezes para dessalgar a fração HDL. O volume PBS maior é necessário para melhorar a mobilidade com eletroforese em gel de agarose. Após centrifugação, remove as lipoproteínas contendo solutos e manter a 4 ° C, ou armazenada a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 8. Agarose Gel Eletroforese <ol><li> Perfrom electroforese em gel de agarose utilizando o kit lipoproteína com pequenas modificações de instruções do fabricante, tal como se segue. Nota: Esta etapa é apenas para avaliar a qualidade e pureza das amostras de lipoproteína concentradas. <ol><li> Resumidamente, 6 ul de obter a fracção de lipoproteína dessalinizada com ultracentrifugação em gradiente de densidade e carregar num gel de lipoproteína de pré-molde. Use lipop humananormas rotein para VLDL, LDL e HDL como referência de tamanho. Realizar electroforese a RT a 100 V durante 60 min utilizando tampão de Rep Prep. </li><li> Seca-se o gel durante 10 min e em seguida corar durante 10 min à TA com Fat Red 7B. Destain o gel em uma mistura de metanol-água 75:25 (v / v) e seco de novo durante 5 min. </li></ol></li></ol> 9. Extracção e purificação de ARN <ol><li> Perfrom isolamento de miARN pela HDL humana purificada utilizando o kit de soro / plasma de miARN isolamento e purificação. <ol><li> Resumidamente, adicionar 1 ml de reagente de lise de ARN de 200 ul de HDL purificada, misturar com um vortex e depois incubada durante 5 min à temperatura ambiente para garantir a completa dissociação de complexos nucleoproteicos e inactivação de RNases. </li><li> Em seguida 3,5 ul de pico sintético Caenorhabditis elegans microARN (CEL-miR-39; 1,6 x 10 8 cópias / ul) na mistura. Em seguida, realizar a extracção de ARN de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> execute purificatina de extraiu-miARN com colunas de giro eluir conforme as instruções do fabricante. Medir a concentração de miARN de HDL purificada com um spectrophorometer. NOTA: eluição de miRNA das colunas de spin empregadas 16 mL de água livre de RNase. </li></ol> 10. Transcrição Reversa (RT-PCR) <ol><li> Isolar 100 ng do miARN de HDL enriquecida com miARN sintético (CEL-miR-39) e sujeitos a transcrição reversa num volume de reacção de 20 ul utilizando o kit de transcrição reversa e de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Realizar os controlos adequados, sem modelo de miRNA (NTC) e sem mistura de enzima transcriptase reversa (NRT). </li></ol> 11. Real-time PCR (qRT-PCR) <ol><li> Perfrom-PCR em tempo real em um volume total de 20 ul com 2 ul de uma diluição 1: 2 do ADNc, 10 ul de mistura de PCR, 2 ul de iniciador universal, 2 ul de iniciadores de miARN e 4 ul de água livre de RNase-. </li><li> Execute os Reactiem em placas de 96 poços a 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C durante 15 seg e 55 ° C durante 30 s e uma fase de extensão a 70 ° C durante 30 s.ec perfrom todas as reacções em triplicado . </li><li> Em seguida, calcuate quantidades relativas de miARN usando o método 2 -ΔΔ Ct após a normalização para o gene doméstico de síntese de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

A identificação de novos biomarcadores a partir de sangue irá ajudar no diagnóstico e prognóstico clínico de várias doenças. MicroRNAs têm conhecido por possuir todas as qualidades de biomarcadores e tem sido demonstrado em vários estudos 14-17. Neste estudo demonstrámos método fácil rápida e simples para isolar miARN de HDL no plasma. Densidade convencional gradiente método ultra-centrifugação de isolamento de VLDL, LDL e HDL depende amostragem exacta de plasma, preparação precisa da solução tampão, a mediçã...

MicroRNAs são minúsculas espécies de RNA endógenas não codificantes que são altamente conservadas e são consideradas atores-chave na regulação de vários processos biológicos, degradando ou reprimindo RNAs mensageiros alvo específicos1. Como os miRNAs agem intracelularmente, eles foram explorados como biomarcadores derivados de tecidos, o que levou à descoberta de funções específicas desses miRNAs para tecidos. No entanto, os miRNAs também são encontrados extracelularmente associados a proteínas ou em exossomos/microvesículas que efetivamente podem protegê-los da degradação por RNases extracelulares2. Estudos mais recentes mostraram que o efeito protetor do HDL pode não estar intimamente ligado à sua capacidade de promover o efluxo de colesterol, mas sim à sua carga sem colesterol, em particular como portador de miRNAs circulantes 3, 4. Esses miRNAs podem não apenas modular o metabolismo lipídico, mas também estão associados a efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes e antitrombóticos do complexo HDL-miRNA 5, 6.
Para explorar ainda mais o papel dos miRNAs transportados nas partículas de HDL, um protocolo simples e fácil precisa ser estabelecido para extração de miRNAs de HDL isolado altamente purificado para uso na rotina clínica. Numerosos métodos foram descritos para isolar a HDL. Esses métodos são muito demorados ou requerem grande volume de plasma que pode exigir agrupamento de amostras, diálise extensa para dessalinização de lipoproteínas isoladas e não removem completamente os exossomos como fonte de miRNAs3, respectivamente. Aqui descrevemos um método simples e rápido que pode isolar miRNA de HDL altamente purificado utilizando pequeno volume de amostras de sangue em maior escala. Acreditamos que este método pode servir como uma boa referência para promover pesquisas sobre o papel dos miRNAs circulantes e, em particular, o papel do HDL na facilitação da comunicação entre várias células e órgãos.

<table><tbody><tr><td>Tubos de plástico Vacutainer Lavender K2EDTA&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Densitômetro 75004261 Densito 30PX</td><td>Mettler Toledo</td><td>MT51324450</td><td></td></tr><tr><td>solução ExoQuick&nbsp;</td><td></td> Tubo de ultracentrífuga de parede espessa de policarbonato <td>Invitrogen</td> 4484451 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>O3237</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX100 ultracentrífuga&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>46902</td><td></td></tr><tr><td>Fat Red 7B&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> 201618-mercaptoetanol<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Dispositivos de filtro centrífugo <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Dispositivos de filtro ultra-centrífugo 3K</td><td>Millipore</td><td>UFC800308</td><td></td></tr><tr><td>QuickGel Lipo kit&nbsp;</td><td>Laboratórios Helena&nbsp;</td><td>3344,3544T</td><td></td></tr><tr><td>Padrões de lipoproteína humana para VLDL, LDL e HDL</td><td>LipoTrol; Helena Laboratories</td><td>5069</td><td></td></tr><tr><td>Rep Prep buffer&nbsp;</td><td>Laboratórios Helena&nbsp;</td>Colunas de spin <td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute&nbsp;</td><td>Analisador Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit&nbsp;</td>Sistema <td>de</td> detecção de PCR em tempo real <td>Qiagen</td> 218161 <td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch</td><td>Kit de</td> soro/plasma bioRad <td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy</td><td>Ensaios de</td><td></td> primer 217184 <td></td></tr><tr><td>miScript</td><td>QIAGEN</td><td>141078139</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control</td><td>QIAGEN</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr> 480878 <tr><td>0,20 &#181; filtro de seringa estéril</td><td>M SIGMA-ALDRICH</td><td>Z227536</td><td></td></tr></tbody></table>

rápido e simplificado método para isolamento alto através-put de mirna de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Pequenos RNAs não codificantes (miRNAs) têm sido implicados em uma variedade de doenças humanas, incluindo síndromes metabólicas. Eles podem ser utilizados como biomarcadores para diagnóstico e prognóstico ou podem servir como alvos para o desenvolvimento de medicamentos, respectivamente. Recentemente, foi demonstrado que os miRNAs são transportados em lipoproteínas, particularmente lipoproteínas de alta densidade (HDL) e são entregues às células receptoras para absorção. Isso levanta a possibilidade de que os miRNAs desempenhem um papel crítico e fundamental na função celular e orgânica por meio da regulação da expressão gênica, bem como mensageiros para comunicações célula-célula e diafonia entre órgãos. Os métodos atuais para isolamento de miRNA de HDL purificado são impraticáveis quando se utilizam pequenas amostras em grande escala. Isso se deve em grande parte aos métodos demorados e trabalhosos usados para o isolamento de lipoproteínas. Desenvolvemos uma abordagem simplificada para isolar rapidamente o HDL purificado adequado para análise de miRNA de amostras de plasma. Este método deve facilitar as investigações sobre o papel dos miRNAs na saúde e na doença e, em particular, fornecer novos insights sobre a variedade de funções biológicas, fora do transporte reverso do colesterol, que foram atribuídas ao HDL. Além disso, as espécies de miRNAs presentes no HDL podem fornecer informações valiosas de biomarcadores clínicos para o diagnóstico de várias doenças.

Isolamento de lipoproteína de alta densidade após a remoção dos exossomas Para obter a partir de miARN HDL altamente purificada é necessário remover exossomas que representam uma fonte de contaminação miARN 7. Isto foi feito antes de ultracentrifugação em gradiente de densidade com um kit disponível comercialmente. Para fins práticos um padrão de três passos protocolo de ultracentrifugação de gradiente de densidade desenvolvido pela emp...

MicroRNAs desempenhar um papel regulador importante e estão a emergir como novos alvos terapêuticos para várias doenças humanas. Tem sido demonstrado que miARNs são realizadas em lipoproteínas de alta densidade. Nós desenvolvemos um método simplificado para isolar rapidamente HDL purificada adequada para análise de miARN a partir de plasma humano.

Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

O objetivo geral deste método é desenvolver uma abordagem simplificada para o isolamento rápido de lipoproteínas de alta densidade purificadas a partir do plasma sanguíneo humano, destinado à análise de micro RNA. Este método pode auxiliar na resposta de questões fundamentais em hepatologia e cardiologia, como o entendimento dos mecanismos moleculares e das funções protetoras das lipoproteínas de alta densidade. Algumas das principais vantagens desta técnica são que o micro RNA de HDL purificado é pré-isolado a partir de volumes menores de amostras em um curto espaço de tempo.Neste protocolo, o plasma é obtido a partir de amostras de sangue venoso periférico em jejum por meio de múltiplas etapas de centrifugação, conforme descrito no texto do protocolo. Transfira o plasma para um novo tubo e meça a densidade do plasma utilizando um densitômetro à temperatura ambiente, conforme as instruções do fabricante.Para remover os exossomos circulantes que representam uma fonte de contaminação por microRNA, adicione 252 microlitros de solução de precipitação de exossomos a um mililitro de plasma. E incube por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue a mistura por 30 minutos para formar um pellet dos exossomos.Transfira um mililitro do sobrenatante resultante para um tubo de ultracentrifugação de parede grossa de policarbonato para processamento adicional, conforme demonstrado no próximo segmento do vídeo. O isolamento de lipoproteínas de alta densidade, ou HDL, é realizado por um protocolo de ultracentrifugação em gradiente de densidade de três etapas, que envolve o isolamento sequencial de lipoproteínas de muito baixa densidade, ou VLDL, lipoproteínas de baixa densidade, ou LDL, e HDL. As três soluções de densidades diferentes, A, B e C, devem ser preparadas frescas, seguindo o procedimento descrito no texto do protocolo.Em um tubo de ultracentrífuga de parede grossa de policarbonato de 6,5 mililitros, misture um mililitro de plasma e 200 microlitros de Fat Red 7B livre de nucleases. Em seguida, sobreponha cuidadosamente cinco mililitros da solução A à mistura. Se necessário, adicione Fat Red 7B adicional sobre a solução A para equilibrar o peso de cada tubo.Carregue os tubos em um rotor pré-resfriado. Coloque o rotor em uma centrífuga de piso e centrifugue por duas horas. Ao final da corrida, devem ser visíveis duas camadas.Remova 1,5 mililitro da camada superior, representando a fração de VLDL. E armazene-a a quatro graus Celsius. Use uma pipeta para transferir quatro mililitros do fundo do tubo para um novo tubo de 50 mililitros.Isso contém a fração de LDL e HDL. O próximo passo é o isolamento da LDL. Misture dois mililitros da solução B e 100 microlitros de Fat Red 7B livre de nucleases no tubo contendo a fração de LDL e HDL.Coloque na gelo por cinco a dez minutos. Transfira 6,5 mL da amostra misturada para um tubo de ultracentrifugação de policarbonato com parede grossa. Coloque o tubo em um rotor previamente resfriado e centrifugue por três horas.Após a conclusão da centrifugação, remova 1,5 mililitro da camada superior, que representa a fração de LDL, e mantenha a quatro graus Celsius. Transfira quatro mililitros do fundo do tubo, contendo a fração de HDL, para um tubo estéril de 50 mililitros. O terceiro passo é o isolamento de HDL.Misture dois mililitros da solução C, 100 microlitros de Fat Red 7B livre de nucleases e 15 microlitros de beta-mercaptoetanol a 98% no tubo contendo a fração de HDL. Verifique a densidade da mistura. Coloque o tubo em um rotor previamente resfriado e centrifugue por três horas.Em seguida, remova dois mililitros da camada superior, representando a fração de HDL, e mantenha a quatro graus Celsius. O excesso de sal deve ser removido das frações de lipoproteínas para evitar interferência com a eletroforese em gel de agarose e com a PCR subsequente. Neste vídeo, a dessalinização e a concentração serão demonstradas apenas para a fração de HDL.Adicione 13 mililitros de PBS frio à fração de HDL e transfira para um dispositivo de filtro centrífugo com limite de peso molecular de 10K. Centrifugue em rotor de balde oscilante, a 4000 × g e quatro graus Celsius, por 30 minutos. Desalifique a fração de HDL uma segunda vez, usando 13 mililitros de PBS frio e centrifugando como anteriormente.Após a centrifugação, remova os solutos contendo lipoproteínas e mantenha a quatro graus Celsius. Para avaliar a qualidade e a pureza das lipoproteínas isoladas, realizou-se eletroforese em gel de agarose com padrões de lipoproteínas humanas, incluídos como referência de tamanho. Resultados representativos de um isolamento, sem beta-mercaptoetanol, mostraram que a fração de HDL está isenta de qualquer contaminação por VLDL e exibe mobilidade alfa típica.No entanto, a fração de HDL também apresenta traços de mobilidade beta devido à contaminação com lipoproteínas. A adição de beta-mercaptoetanol à solução C, durante o último passo de centrifugação, remove efetivamente todas as lipoproteínas contaminantes da fração de HDL. Para demonstrar a viabilidade da quantificação de microRNAs transportados na HDL humana, purificada com este método, dois microRNAs diferentes foram amplificados por PCR quantitativa em tempo real.Nestes gráficos de amplificação, as linhas horizontais representam o limite de detecção. Dados representativos de PCR em tempo real a partir de HDL isolado, obtidos de seis amostras, mostraram a detecção consistente de ambos os microRNAs. Por fim, as análises de curva de dissociação mostram claramente um único pico distinto para ambos os microRNAs, compatível com amplificação específica na PCR anterior.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em nove horas, juntamente com os procedimentos de dessalinização, se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante trabalhar entre quatro e oito graus centígrados, em todo momento. E ajustar a densidade de cada fração de lipoproteína antes da ultracentrifugação.Após este procedimento, outros métodos, como microscopia eletrônica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a pureza da HDL. Após seu desenvolvimento, esta técnica permitirá que pesquisadores na área da síndrome metabólica explorem microRNAs associados à HDL como biomarcadores em humanos com suspeita de doença hepática gordurosa. Também pode ser utilizada para compreender melhor a função da HDL e os mecanismos moleculares pelos quais ela altera a biologia celular.

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