Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

O objetivo geral deste método é desenvolver uma abordagem simplificada para isolar rapidamente lipoproteínas de alta densidade purificadas do plasma sanguíneo humano para análise de microRNA. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em hepatologia e cardiologia, como a compreensão dos mecanismos moleculares e funções protetoras das lipoproteínas de alta densidade. Algumas das principais vantagens desta técnica é que o micro RNA HDL purificado vem pré-isolado de um menor volume de amostras em um curto período de tempo.

Neste protocolo, o plasma é obtido a partir de amostras de sangue venoso periférico em jejum por várias etapas de centrifugação, conforme descrito no texto do protocolo. Transfira o plasma para um novo tubo. E meça a densidade do plasma usando um densitômetro à temperatura ambiente, de acordo com as instruções do fabricante.

Para remover os exossomos circulantes que representam uma fonte de contaminação por micro RNA, adicione 252 microlitros de solução de precipitação de exossomos a um mililitro de plasma. E incube por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue a mistura por 30 minutos para remover os exossomos.

Transfira um mililitro do sobrenadante resultante para um tubo de ultracentrífuga de parede espessa de policarbonato para processamento posterior, conforme demonstrado no próximo segmento de vídeo. O isolamento de lipoproteínas de alta densidade, ou HDL, é realizado por um protocolo de ultracentrifugação de gradiente de densidade de três etapas, que envolve um isolamento sequencial de lipoproteínas de densidade muito baixa, ou VLDL, lipoproteínas de baixa densidade, ou LDL e HDL. As três soluções de densidade diferentes, A, B e C, devem ser preparadas frescas, seguindo o procedimento descrito no texto do protocolo.

Em um tubo de ultracentrífuga de parede espessa de policarbonato de 6,5 mililitros, misture um mililitro de plasma e 200 microlitros de Fat Red 7B livre de nuclease. Em seguida, coloque cuidadosamente cinco mililitros de solução A em cima da mistura. Se necessário, adicione Fat Red 7B adicional em cima da solução A para equilibrar o peso de cada tubo.

Carregue os tubos em um rotor pré-resfriado. Coloque o rotor em uma centrífuga de piso e centrifugue por duas horas. No final da execução, duas camadas devem estar visíveis.

Remova 1,5 mililitros da camada superior, representando a fração VLDL. E armazene-o quatro graus Celsius. Use uma pipeta para transferir quatro mililitros do fundo do tubo para um novo tubo de 50 mililitros.

Este contém a fração LDL e HDL. O próximo passo é o isolamento do LDL. Misture dois mililitros de solução B e 100 microlitros de Fat Red 7B livre de nuclease no tubo contendo a fração LDL e HDL.

Coloque no gelo por cinco a dez minutos. Transfira 6,5 mililitros da amostra misturada para um tubo de ultracentrífuga de parede espessa de policarbonato. Carregue o tubo em um rotor pré-resfriado e centrifugue por três horas.

Quando a centrifugação estiver completa, remova 1,5 mililitros da camada superior, representando a fração LDL e mantenha a quatro graus Celsius. Transfira quatro mililitros do fundo do tubo, contendo a fração HDL, para um tubo estéril de 50 mililitros. O terceiro passo é o isolamento do HDL.

Misture dois mililitros de solução C, 100 microlitros de Fat Red 7B livre de nuclease e 15 microlitros de 98% de beta mercaptoetanol no tubo, contendo a fração HDL. Verifique a densidade da mistura. Carregue o tubo em um rotor pré-resfriado e centrifugue por três horas.

Em seguida, remova dois mililitros da camada superior, representando a fração HDL, e mantenha a quatro graus Celsius. O excesso de sal deve ser removido das frações lipoproteicas para evitar interferência na eletroforese em gel de agarose e na reação em cadeia da polimerase subsequentes. Neste vídeo, a dessalinização e a concentração serão demonstradas apenas para a fração HDL.

Adicione 13 mililitros de PBS frio à fração HDL e transfira para um dispositivo de filtro centrífugo com o corte de peso molecular de 10K. Centrifugue em um rotor de balde oscilante, a 4000 vezes g e quatro graus Celsius, por 30 minutos. Dessalinize a fração HDL, uma segunda vez, usando 13 mililitros de PBS frio e centrifugando como antes.

Após centrifugação, remover a lipoproteína contendo solutos e mantê-la a quatro graus Celsius. Para avaliar a qualidade e pureza das lipoproteínas isoladas, foi realizada eletroforese em gel de agarose com padrões de lipoproteínas humanas, incluídos como referência de tamanho. Resultados representativos de um isolamento, sem beta mercaptoetanol, mostraram que a fração HDL é desprovida de qualquer contaminação de VLDL e exibe mobilidade alfa típica.

No entanto, a fração HDL também apresenta traços de mobilidade beta devido à contaminação com lipoproteínas. A adição de beta mercaptoetanol à solução C, durante a última etapa de centrifugação, remove efetivamente todas as lipoproteínas contaminantes da fração HDL. Para demonstrar a viabilidade de quantificar micro RNAs, transportados em HDL humano, purificados com este método, dois micro RNAs diferentes foram amplificados por PCR quantitativo em tempo real.

Nesses gráficos de amplificação, as linhas horizontais representam o limiar de detecção. Dados representativos de PCR em tempo real de HDL isolado, obtidos de seis amostras, mostraram a detecção consistente de ambos os micro RNAs. Por fim, as análises da curva de fusão mostram claramente um pico único distinto para ambos os micro RNAs, consistente com a amplificação específica na PCR anterior.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em nove horas, juntamente com os procedimentos de dessalinização, se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante trabalhar de quatro a oito graus centígrados, em todos os momentos. E para ajustar a densidade de cada fração de lipoproteína antes da ultracentrifugação.

Após esse procedimento, outros métodos, como a microscopia eletrônica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a pureza do HDL. Após o seu desenvolvimento, esta técnica permitirá aos investigadores, no campo da síndrome metabólica, explorar micro RNAs associados ao HDL como biomarcadores, em humanos com suspeita de doença hepática gordurosa. Também pode ser usado para entender melhor a função do HDL e os mecanismos moleculares pelos quais ele altera a biologia celular.