Name: Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprenda um método simplificado para isolar lipoproteínas de alta densidade purificadas do plasma sanguíneo humano para análise de microRNAs. Esta técnica rápida permite estudar mecanismos moleculares e funções protetoras do HDL em hepatologia e cardiologia com eficiência.

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Este trabalho foi apoiado, no todo ou em parte, pelos NIH Grants R01 AA 020758-04, U01DK 061731-13 e T32 DK 007150-38 para AJS e T32 DK 007150-38 para AA. Este é um trabalho original e não está sendo considerado em outro lugar para publicação.

1. Recolha de amostras de sangue <ol><li> Recolha de amostras de sangue em jejum venosos periféricos em tubos de 10 ml em plástico contendo anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (que tem diversas vantagens sobre os outros anticoagulantes) por punção venosa de uma veia padrão proeminente na fossa antecubital. </li><li> Centrifugar as amostras de sangue a 1600 xg durante 20 min a 4 ° C numa centrífuga de mesa a obter o plasma livre de células vermelhas do sangue e pequenas quantidades de ARN. </li><li> Sequencialmente centrifugar o sobrenadante a 3000 g (4 ° C) num rotor de balde oscilante durante 10 min para remover WBC e plaquetas e, em seguida, mais 15 min para remover as partículas remanescentes de células, respectivamente. </li><li> Medir a densidade do plasma, utilizando um densitómetro à TA de acordo com as instruções de fabrico. NOTA: O ajuste da densidade (d = 1,023 g / ml), com solução salina a 0,9% pode ser necessário após a remoção de exossomas, mas antes a uma ultracentrifugação de gradiente de densidade. </li></ol&gt; 2. exossomo Remoção de Plasma <ol><li> Retire os exossomos circulantes que têm uma densidade semelhante ao HDL e representam uma fonte quantitativamente significativo de miRNA 3. <ol><li> Para fazer isso, a adição de 252 ul de solução exossomo precipitação a 1 ml de plasma, seguido por incubação durante 30 min a 4 ° C. Para peletizar os exossomas, centrifugar a mistura durante 30 min a 1500 g a 4 ° C. </li><li> Para isolar o HDL, Transferir 1 ml do sobrenadante resultante para um tubo de ultracentrífuga policarbonato de parede espessa para processamento adicional com ultracentrifugação em gradiente de densidade (ver abaixo). </li></ol></li></ol> 3. gradiente de densidade Ultracentrifugação (Figura 1). <ol><li> Para separar HDL usar um processo de três passos empregando uma ultracentrífuga chão com um rotor de ângulo fixo operando a 448811 x G e 8 ° C, respectivamente. </li><li> Preparar três soluções de densidade diferentes sequencialmente e fresco para cada isolamento. <ol><li> Preparar a solução de A (isolamento de VLDL, d = 1,006 g / ml) por dissolução de 11,4 g de NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na e 1 ml de NaOH 1 N em 1000 mL de água destilada autoclavada-. Em seguida, adicionar um adicional de 3 ml de água esterilizada destilada. </li><li> Preparar a solução de B (isolamento de LDL, d = 1,182 g / ml) por adição de 25,2 g de NaBr a 100 ml de solução A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol). </li><li> Preparar a solução de C (isolamento de HDL, d = 1,470 g / ml) por mistura de 78,8 g de NaBr com 100 ml de solução A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Confirmar a densidade adequada à temperatura ambiente usando um densitômetro. Mantenha todas as soluções a 4 ° C até uso posterior. </li></ol></li></ol> 4. Isolamento de VLDL <ol><li> Misture 1 ml de plasma (densidade média = 1,023 g / ml) e nuclease livre 200 mL de Fat Red 7B em um tubo de ultracentrífuga 6,5 ​​ml de policarbonato de paredes espessas. </li><li> Em seguida, a camada cuidadosamente 5 ml de solução A em cima da mistura. Se necessário, adicionar gordura adicional Red 7B no topo da solução A, TO equilibrar o peso de cada tubo. Centrifugar durante 2 h (aceleração - 5), (desaceleração - 7). Nota: Durante a centrifugação, as lipoproteínas são acumulados como uma banda nas suas regiões de densidade de equilíbrio. </li><li> No final da corrida observar 2 camadas. Remover 1,5 mL da fracção VLDL representando a camada superior e armazenar a 4 ° C. </li><li> Finalmente, usando uma pipeta de transferência de 4 ml a partir do fundo do tubo contendo o LDL, HDL, albumina e fracção de ácido gordo para um novo tubo de policarbonato para o isolamento de LDL. </li></ol> 5. Isolamento de LDL <ol><li> Misturar 2 ml de solução B e 100 ul de nuclease isenta de gordura Red 7B para dentro do tubo que contém a fracção LDL e HDL (ponto 4), respectivamente. </li><li> Em seguida, centrifugar para fora para 3 horas (aceleração 9, desaceleração 7). Em seguida, remover 1,5 ml da fracção de LDL que representa a camada superior e manter a 4 ° C ou armazenar a -80 ° C. Finalmente, transferir 4 ml a partir do fundo do tubo contendo a HDLfracção para um novo tubo de policarbonato. </li></ol> 6. Isolamento de HDL <ol><li> Misturar 2 ml de solução C, 100 ul de nuclease isenta de gordura Red 7B e 15 ul de 98% β-mercaptoetanol para o tubo contendo a fracção HDL, respectivamente. </li><li> Centrifugar durante 3 h (9 aceleração, desaceleração 7). Em seguida remover 2 ml da fracção de HDL que representam a camada de topo e, ou manter a 4 ° C ou armazenar a -80 ° C. </li></ol> 7. A dessalinização e concentração da lipoproteína de Frações <ol><li> Para evitar a interferência com electroforese em gel de agarose subsequente e PCR, remover excesso de sal adicionada durante a ultracentrifugação em gradiente de densidade usando dispositivos de filtro centrífugo com o corte de peso molecular apropriado (tubo 3K para VLDL e tubo de 10K para LDL / HDL) tal como descrito nas instruções do fabricante. <ol><li> Resumidamente, após a adição de 2,5 ml de PBS frio (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 2 mM; pH 7,4) centrifuGE toda a fracção VLDL recolhidos durante densidade-gradiente ultracentrifugação a 4 ° C durante 60 min, utilizando um rotor basculante. </li><li> Dessalinizar a fracção LDL duas vezes com 10 ml de PBS frio de gelo durante 30 min cada. Em seguida, use 13 ml de gelo frio PBS duas vezes para dessalgar a fração HDL. O volume PBS maior é necessário para melhorar a mobilidade com eletroforese em gel de agarose. Após centrifugação, remove as lipoproteínas contendo solutos e manter a 4 ° C, ou armazenada a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 8. Agarose Gel Eletroforese <ol><li> Perfrom electroforese em gel de agarose utilizando o kit lipoproteína com pequenas modificações de instruções do fabricante, tal como se segue. Nota: Esta etapa é apenas para avaliar a qualidade e pureza das amostras de lipoproteína concentradas. <ol><li> Resumidamente, 6 ul de obter a fracção de lipoproteína dessalinizada com ultracentrifugação em gradiente de densidade e carregar num gel de lipoproteína de pré-molde. Use lipop humananormas rotein para VLDL, LDL e HDL como referência de tamanho. Realizar electroforese a RT a 100 V durante 60 min utilizando tampão de Rep Prep. </li><li> Seca-se o gel durante 10 min e em seguida corar durante 10 min à TA com Fat Red 7B. Destain o gel em uma mistura de metanol-água 75:25 (v / v) e seco de novo durante 5 min. </li></ol></li></ol> 9. Extracção e purificação de ARN <ol><li> Perfrom isolamento de miARN pela HDL humana purificada utilizando o kit de soro / plasma de miARN isolamento e purificação. <ol><li> Resumidamente, adicionar 1 ml de reagente de lise de ARN de 200 ul de HDL purificada, misturar com um vortex e depois incubada durante 5 min à temperatura ambiente para garantir a completa dissociação de complexos nucleoproteicos e inactivação de RNases. </li><li> Em seguida 3,5 ul de pico sintético Caenorhabditis elegans microARN (CEL-miR-39; 1,6 x 10 8 cópias / ul) na mistura. Em seguida, realizar a extracção de ARN de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> execute purificatina de extraiu-miARN com colunas de giro eluir conforme as instruções do fabricante. Medir a concentração de miARN de HDL purificada com um spectrophorometer. NOTA: eluição de miRNA das colunas de spin empregadas 16 mL de água livre de RNase. </li></ol> 10. Transcrição Reversa (RT-PCR) <ol><li> Isolar 100 ng do miARN de HDL enriquecida com miARN sintético (CEL-miR-39) e sujeitos a transcrição reversa num volume de reacção de 20 ul utilizando o kit de transcrição reversa e de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Realizar os controlos adequados, sem modelo de miRNA (NTC) e sem mistura de enzima transcriptase reversa (NRT). </li></ol> 11. Real-time PCR (qRT-PCR) <ol><li> Perfrom-PCR em tempo real em um volume total de 20 ul com 2 ul de uma diluição 1: 2 do ADNc, 10 ul de mistura de PCR, 2 ul de iniciador universal, 2 ul de iniciadores de miARN e 4 ul de água livre de RNase-. </li><li> Execute os Reactiem em placas de 96 poços a 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C durante 15 seg e 55 ° C durante 30 s e uma fase de extensão a 70 ° C durante 30 s.ec perfrom todas as reacções em triplicado . </li><li> Em seguida, calcuate quantidades relativas de miARN usando o método 2 -ΔΔ Ct após a normalização para o gene doméstico de síntese de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

A identificação de novos biomarcadores a partir de sangue irá ajudar no diagnóstico e prognóstico clínico de várias doenças. MicroRNAs têm conhecido por possuir todas as qualidades de biomarcadores e tem sido demonstrado em vários estudos 14-17. Neste estudo demonstrámos método fácil rápida e simples para isolar miARN de HDL no plasma. Densidade convencional gradiente método ultra-centrifugação de isolamento de VLDL, LDL e HDL depende amostragem exacta de plasma, preparação precisa da solução tampão, a mediçã...

MicroRNAs são minúsculas espécies de RNA endógenas não codificantes que são altamente conservadas e são consideradas atores-chave na regulação de vários processos biológicos, degradando ou reprimindo RNAs mensageiros alvo específicos1. Como os miRNAs agem intracelularmente, eles foram explorados como biomarcadores derivados de tecidos, o que levou à descoberta de funções específicas desses miRNAs para tecidos. No entanto, os miRNAs também são encontrados extracelularmente associados a proteínas ou em exossomos/microvesículas que efetivamente podem protegê-los da degradação por RNases extracelulares2. Estudos mais recentes mostraram que o efeito protetor do HDL pode não estar intimamente ligado à sua capacidade de promover o efluxo de colesterol, mas sim à sua carga sem colesterol, em particular como portador de miRNAs circulantes 3, 4. Esses miRNAs podem não apenas modular o metabolismo lipídico, mas também estão associados a efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes e antitrombóticos do complexo HDL-miRNA 5, 6.
Para explorar ainda mais o papel dos miRNAs transportados nas partículas de HDL, um protocolo simples e fácil precisa ser estabelecido para extração de miRNAs de HDL isolado altamente purificado para uso na rotina clínica. Numerosos métodos foram descritos para isolar a HDL. Esses métodos são muito demorados ou requerem grande volume de plasma que pode exigir agrupamento de amostras, diálise extensa para dessalinização de lipoproteínas isoladas e não removem completamente os exossomos como fonte de miRNAs3, respectivamente. Aqui descrevemos um método simples e rápido que pode isolar miRNA de HDL altamente purificado utilizando pequeno volume de amostras de sangue em maior escala. Acreditamos que este método pode servir como uma boa referência para promover pesquisas sobre o papel dos miRNAs circulantes e, em particular, o papel do HDL na facilitação da comunicação entre várias células e órgãos.

<table><tbody><tr><td>Tubos de plástico Vacutainer Lavender K2EDTA&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Densitômetro 75004261 Densito 30PX</td><td>Mettler Toledo</td><td>MT51324450</td><td></td></tr><tr><td>solução ExoQuick&nbsp;</td><td></td> Tubo de ultracentrífuga de parede espessa de policarbonato <td>Invitrogen</td> 4484451 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>O3237</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX100 ultracentrífuga&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>46902</td><td></td></tr><tr><td>Fat Red 7B&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> 201618-mercaptoetanol<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Dispositivos de filtro centrífugo <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Dispositivos de filtro ultra-centrífugo 3K</td><td>Millipore</td><td>UFC800308</td><td></td></tr><tr><td>QuickGel Lipo kit&nbsp;</td><td>Laboratórios Helena&nbsp;</td><td>3344,3544T</td><td></td></tr><tr><td>Padrões de lipoproteína humana para VLDL, LDL e HDL</td><td>LipoTrol; Helena Laboratories</td><td>5069</td><td></td></tr><tr><td>Rep Prep buffer&nbsp;</td><td>Laboratórios Helena&nbsp;</td>Colunas de spin <td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute&nbsp;</td><td>Analisador Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit&nbsp;</td>Sistema <td>de</td> detecção de PCR em tempo real <td>Qiagen</td> 218161 <td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch</td><td>Kit de</td> soro/plasma bioRad <td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy</td><td>Ensaios de</td><td></td> primer 217184 <td></td></tr><tr><td>miScript</td><td>QIAGEN</td><td>141078139</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control</td><td>QIAGEN</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr> 480878 <tr><td>0,20 &#181; filtro de seringa estéril</td><td>M SIGMA-ALDRICH</td><td>Z227536</td><td></td></tr></tbody></table>

rápido e simplificado método para isolamento alto através-put de mirna de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Pequenos RNAs não codificantes (miRNAs) têm sido implicados em uma variedade de doenças humanas, incluindo síndromes metabólicas. Eles podem ser utilizados como biomarcadores para diagnóstico e prognóstico ou podem servir como alvos para o desenvolvimento de medicamentos, respectivamente. Recentemente, foi demonstrado que os miRNAs são transportados em lipoproteínas, particularmente lipoproteínas de alta densidade (HDL) e são entregues às células receptoras para absorção. Isso levanta a possibilidade de que os miRNAs desempenhem um papel crítico e fundamental na função celular e orgânica por meio da regulação da expressão gênica, bem como mensageiros para comunicações célula-célula e diafonia entre órgãos. Os métodos atuais para isolamento de miRNA de HDL purificado são impraticáveis quando se utilizam pequenas amostras em grande escala. Isso se deve em grande parte aos métodos demorados e trabalhosos usados para o isolamento de lipoproteínas. Desenvolvemos uma abordagem simplificada para isolar rapidamente o HDL purificado adequado para análise de miRNA de amostras de plasma. Este método deve facilitar as investigações sobre o papel dos miRNAs na saúde e na doença e, em particular, fornecer novos insights sobre a variedade de funções biológicas, fora do transporte reverso do colesterol, que foram atribuídas ao HDL. Além disso, as espécies de miRNAs presentes no HDL podem fornecer informações valiosas de biomarcadores clínicos para o diagnóstico de várias doenças.

Isolamento de lipoproteína de alta densidade após a remoção dos exossomas Para obter a partir de miARN HDL altamente purificada é necessário remover exossomas que representam uma fonte de contaminação miARN 7. Isto foi feito antes de ultracentrifugação em gradiente de densidade com um kit disponível comercialmente. Para fins práticos um padrão de três passos protocolo de ultracentrifugação de gradiente de densidade desenvolvido pela emp...

MicroRNAs desempenhar um papel regulador importante e estão a emergir como novos alvos terapêuticos para várias doenças humanas. Tem sido demonstrado que miARNs são realizadas em lipoproteínas de alta densidade. Nós desenvolvemos um método simplificado para isolar rapidamente HDL purificada adequada para análise de miARN a partir de plasma humano.

Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

O objetivo geral deste método é desenvolver uma abordagem simplificada para o isolamento rápido de lipoproteínas de alta densidade purificadas a partir do plasma sanguíneo humano, destinado à análise de micro RNA. Este método pode auxiliar na resposta de questões fundamentais em hepatologia e cardiologia, como o entendimento dos mecanismos moleculares e das funções protetoras das lipoproteínas de alta densidade. Algumas das principais vantagens desta técnica são que o micro RNA de HDL purificado é pré-isolado a partir de volumes menores de amostras em um curto espaço de tempo.Neste protocolo, o plasma é obtido a partir de amostras de sangue venoso periférico em jejum por meio de múltiplas etapas de centrifugação, conforme descrito no texto do protocolo. Transfira o plasma para um novo tubo e meça a densidade do plasma utilizando um densitômetro à temperatura ambiente, conforme as instruções do fabricante.Para remover os exossomos circulantes que representam uma fonte de contaminação por microRNA, adicione 252 microlitros de solução de precipitação de exossomos a um mililitro de plasma. E incube por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue a mistura por 30 minutos

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Biologia

Aqui nós descrevemos um otimizado multiplex da transcriptase reversa PCR quantitativo protocolo (qRT-PCR) em combinação com uma plataforma microfluídica como ferramenta de triagem de custo e tempo efetivo de alto rendimento para microRNA (miRNA) níveis de expressão, especialmente quando se trabalha com quantidades limitadas de amostra.

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

Este vídeo descreve a extração de microRNA circulante de amostras de plasma de pacientes com câncer colorretal usando extração orgânica seguida de enriquecimento em coluna de fibra de vidro. Os miRNAs são estáveis em fluidos biológicos, como soro e plasma, o que os torna biomarcadores circulantes ideais para diagnóstico de câncer, prognóstico e tomada de decisão e monitoramento de tratamento. Este método ajudará a identificar novos biomarcadores circulantes capazes de prever resultados clínicos...

Extração de miRNA circulante: um método para isolar miRNA de amostras de plasma por meio de extração orgânica e enriquecimento de RNA pequeno

A presença de microRNAs (miRNAs estáveis) em exossomos gerou enorme interesse como um novo modo de comunicação intercelular, pela sua utilidade potencial como biomarcadores e como uma rota para a intervenção terapêutica. Aqui demonstramos purificação exosome de mídia e cultura de sangue, seguido por PCR quantitativo para identificar os miRNAs sendo transportados.

Purificação e microRNA Profiling de Exosomes derivados do sangue e Meios de Cultura

Este protocolo descreve um método para extrair pequenos RNAs de soro humano. Temos utilizado este método para isolar microRNAs de soro câncer para uso em matrizes de DNA e também singleplex PCR quantitativo. O protocolo utiliza fenol e tiocianato de guanidina reagentes com modificações para produzir RNA de alta qualidade.

Isolamento de ARN a partir de pequenas não-codificante de Soro Humano

MicroRNAs (miRNAs) são uma classe amplamente conservada de moléculas reguladoras. Aqui descrevemos um método de clonagem de miRNA que se baseia em duas etapas de ligação potentes seguidas de sequenciamento de alto rendimento. Nosso método permite a quantificação precisa de miRNAs em todo o genoma.

Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento

O líquido biliar é uma fonte valiosa de vesículas/exossomos extracelulares que contêm biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa um método robusto para isolar exossomos da bile humana para análises adicionais, incluindo perfis de miRNA.

Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

Este protocolo descreve o isolamento e quantificação de pequenos RNAs de lipoproteína de alta densidade.

O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação

Este protocolo estabelece um novo método de isolamento de gotículas lipídicas e purificação do fígado de rato, usando um kit de isolamento bem-estabelecida retículo endoplasmático.

Protocolo de isolamento gota lipídica rápida usando um Kit de isolamento organela bem estabelecidas

Aqui, é apresentado um protocolo de reação em cadeia de polimerase em tempo real quantitativo para a determinação do conteúdo de microRNA nativo (absoluto/relativo) de partículas de lipoproteína. Além, um método para aumentar o nível do Micro-RNA, assim como um método para determinar a taxa de captação celular de partículas da lipoproteína, é demonstrado.

Enriquecimento de partículas de lipoproteína nativa com microRNA e subsequente determinação de seu conteúdo de microRNA absoluto/relativo e sua taxa de transferência celular

Aqui, descrevemos uma estratégia passo a passo para isolar pequenas RNAs, enriquecedora para microRNAs e preparando amostras para sequenciamento de alta taxa de transferência. Em seguida, descrevemos como processar leituras de sequência e alinhá-las ao microRNAs, usando ferramentas de código aberto.

Um pipeline completo para isolar e sequenciar MicroRNAs e analisá-los usando ferramentas de código aberto

Vários métodos têm sido utilizados para analisar lipoproteínas plasmáticas; no entanto, a ultracentrifugação ainda é um dos métodos mais populares e confiáveis. Aqui, descrevemos um método sobre como isolar as lipoproteínas do plasma usando ultracentrifugação de densidade sequencial e como analisar as apolipoproteínas para fins diagnósticos e de pesquisa.

Isolamento e Análise de Lipoproteínas plasmáticas por Ultracentrifugação

Aprenda um método simplificado para isolar lipoproteínas de alta densidade purificadas do plasma sanguíneo humano para análise de microRNAs. Esta técnica rápida permite estudar mecanismos moleculares e funções protetoras do HDL em hepatologia e cardiologia com eficiência.

Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

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