Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

O objetivo geral deste método é desenvolver uma abordagem simplificada para o isolamento rápido de lipoproteínas de alta densidade purificadas a partir do plasma sanguíneo humano, destinado à análise de micro RNA. Este método pode auxiliar na resposta de questões fundamentais em hepatologia e cardiologia, como o entendimento dos mecanismos moleculares e das funções protetoras das lipoproteínas de alta densidade. Algumas das principais vantagens desta técnica são que o micro RNA de HDL purificado é pré-isolado a partir de volumes menores de amostras em um curto espaço de tempo.

Neste protocolo, o plasma é obtido a partir de amostras de sangue venoso periférico em jejum por meio de múltiplas etapas de centrifugação, conforme descrito no texto do protocolo. Transfira o plasma para um novo tubo e meça a densidade do plasma utilizando um densitômetro à temperatura ambiente, conforme as instruções do fabricante.

Para remover os exossomos circulantes que representam uma fonte de contaminação por microRNA, adicione 252 microlitros de solução de precipitação de exossomos a um mililitro de plasma. E incube por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue a mistura por 30 minutos para formar um pellet dos exossomos.

Transfira um mililitro do sobrenatante resultante para um tubo de ultracentrifugação de parede grossa de policarbonato para processamento adicional, conforme demonstrado no próximo segmento do vídeo. O isolamento de lipoproteínas de alta densidade, ou HDL, é realizado por um protocolo de ultracentrifugação em gradiente de densidade de três etapas, que envolve o isolamento sequencial de lipoproteínas de muito baixa densidade, ou VLDL, lipoproteínas de baixa densidade, ou LDL, e HDL. As três soluções de densidades diferentes, A, B e C, devem ser preparadas frescas, seguindo o procedimento descrito no texto do protocolo.

Em um tubo de ultracentrífuga de parede grossa de policarbonato de 6,5 mililitros, misture um mililitro de plasma e 200 microlitros de Fat Red 7B livre de nucleases. Em seguida, sobreponha cuidadosamente cinco mililitros da solução A à mistura. Se necessário, adicione Fat Red 7B adicional sobre a solução A para equilibrar o peso de cada tubo.

Carregue os tubos em um rotor pré-resfriado. Coloque o rotor em uma centrífuga de piso e centrifugue por duas horas. Ao final da corrida, devem ser visíveis duas camadas.

Remova 1,5 mililitro da camada superior, representando a fração de VLDL. E armazene-a a quatro graus Celsius. Use uma pipeta para transferir quatro mililitros do fundo do tubo para um novo tubo de 50 mililitros.

Isso contém a fração de LDL e HDL. O próximo passo é o isolamento da LDL. Misture dois mililitros da solução B e 100 microlitros de Fat Red 7B livre de nucleases no tubo contendo a fração de LDL e HDL.

Coloque na gelo por cinco a dez minutos. Transfira 6,5 mL da amostra misturada para um tubo de ultracentrifugação de policarbonato com parede grossa. Coloque o tubo em um rotor previamente resfriado e centrifugue por três horas.

Após a conclusão da centrifugação, remova 1,5 mililitro da camada superior, que representa a fração de LDL, e mantenha a quatro graus Celsius. Transfira quatro mililitros do fundo do tubo, contendo a fração de HDL, para um tubo estéril de 50 mililitros. O terceiro passo é o isolamento de HDL.

Misture dois mililitros da solução C, 100 microlitros de Fat Red 7B livre de nucleases e 15 microlitros de beta-mercaptoetanol a 98% no tubo contendo a fração de HDL. Verifique a densidade da mistura. Coloque o tubo em um rotor previamente resfriado e centrifugue por três horas.

Em seguida, remova dois mililitros da camada superior, representando a fração de HDL, e mantenha a quatro graus Celsius. O excesso de sal deve ser removido das frações de lipoproteínas para evitar interferência com a eletroforese em gel de agarose e com a PCR subsequente. Neste vídeo, a dessalinização e a concentração serão demonstradas apenas para a fração de HDL.

Adicione 13 mililitros de PBS frio à fração de HDL e transfira para um dispositivo de filtro centrífugo com limite de peso molecular de 10K. Centrifugue em rotor de balde oscilante, a 4000 × g e quatro graus Celsius, por 30 minutos. Desalifique a fração de HDL uma segunda vez, usando 13 mililitros de PBS frio e centrifugando como anteriormente.

Após a centrifugação, remova os solutos contendo lipoproteínas e mantenha a quatro graus Celsius. Para avaliar a qualidade e a pureza das lipoproteínas isoladas, realizou-se eletroforese em gel de agarose com padrões de lipoproteínas humanas, incluídos como referência de tamanho. Resultados representativos de um isolamento, sem beta-mercaptoetanol, mostraram que a fração de HDL está isenta de qualquer contaminação por VLDL e exibe mobilidade alfa típica.

No entanto, a fração de HDL também apresenta traços de mobilidade beta devido à contaminação com lipoproteínas. A adição de beta-mercaptoetanol à solução C, durante o último passo de centrifugação, remove efetivamente todas as lipoproteínas contaminantes da fração de HDL. Para demonstrar a viabilidade da quantificação de microRNAs transportados na HDL humana, purificada com este método, dois microRNAs diferentes foram amplificados por PCR quantitativa em tempo real.

Nestes gráficos de amplificação, as linhas horizontais representam o limite de detecção. Dados representativos de PCR em tempo real a partir de HDL isolado, obtidos de seis amostras, mostraram a detecção consistente de ambos os microRNAs. Por fim, as análises de curva de dissociação mostram claramente um único pico distinto para ambos os microRNAs, compatível com amplificação específica na PCR anterior.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em nove horas, juntamente com os procedimentos de dessalinização, se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante trabalhar entre quatro e oito graus centígrados, em todo momento. E ajustar a densidade de cada fração de lipoproteína antes da ultracentrifugação.

Após este procedimento, outros métodos, como microscopia eletrônica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a pureza da HDL. Após seu desenvolvimento, esta técnica permitirá que pesquisadores na área da síndrome metabólica explorem microRNAs associados à HDL como biomarcadores em humanos com suspeita de doença hepática gordurosa. Também pode ser utilizada para compreender melhor a função da HDL e os mecanismos moleculares pelos quais ela altera a biologia celular.