Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na Brucella A infecção de células HeLa

O objetivo geral deste ensaio baseado em microscopia de alto rendimento é identificar os fatores do hospedeiro envolvidos na infecção por Brucella de células HeLa. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de interação patógeno hospedeiro, como a identificação de proteínas hospedeiras que promovem ou previnem a colonização pelo patógeno intracelular Brucella. A principal vantagem dessa técnica é que o fluxo de trabalho semiautomatizado do laboratório veterinário para a análise de imagens permite robôs e experimentos eficientes de alto rendimento.

Portanto, este método pode fornecer informações sobre as interações do hospedeiro Brucella usando telas de siRNA. A maior parte do protocolo pode ser aplicada a outras estratégias de triagem. Por exemplo, ou bibliotecas de siRNA.

Após a cultura de células HeLa e a preparação de placas de triagem com siRNAs de acordo com o protocolo de texto, descongele uma placa preta de 384 poços por centrifugação a 300 vezes G e temperatura ambiente por 20 minutos. Prepare o meio de transfecção usando dmem em temperatura ambiente sem FCS. Para diluir o reagente de transfecção um a 200 e misture cuidadosamente antes de usar.

Usando um dispensador de reagente, adicione 25 microlitros de meio de transfecção a cada poço da placa de 384 poços e misture as soluções movendo a placa para frente e para trás. Incube a placa em temperatura ambiente por uma hora para permitir a formação do complexo de reagentes de transfecção de siRNA. Enquanto isso, prepare as células HeLa aspirando o meio de cultura e adicionando 2,5 mililitros de 0,05% de tripsina EDTA em PBS para lavar as células subconfluentes de um frasco de 75 centímetros quadrados uma vez.

Em seguida, adicione 1,5 mililitros de tripsina fresca e transfira o frasco para 37 graus Celsius por dois a três minutos até que as células se arredondem. Use 10 mililitros de dmem 60% FCS pré-aquecido para ressuspender as células. Em seguida, use um contador de células automatizado para contar as células antes de preparar uma suspensão celular de 10.000 células por mililitro em dmem com 16% FCS.

Adicione 50 microlitros de suspensão celular a cada poço de reagente de transfecção. Resultando em 500 células por poço. Mova a placa para frente e para trás para distribuir uniformemente as células.

Em seguida, deixe a placa em temperatura ambiente por cinco a 10 minutos para permitir que as células se acalmem. Use parafilme para selar a placa. E incube-o em uma incubadora úmida em uma placa de alumínio pré-aquecida a 37 graus Celsius com 5% C02 por 72 horas.

Trabalhar com o patógeno de classe três B.abortus é perigoso e os regulamentos locais de biossegurança precisam ser seguidos, o que inclui o uso de um traje de proteção, luvas de proteção, máscara e óculos de proteção. Um dia, antes da infecção, inocular a quantidade previamente determinada de cultura inicial de B. abortus em 50 mililitros de meio TSB KM. Em uma garrafa de 250 mililitros com tampa de rosca.

Use parafilme para selar a garrafa e cultivar bactérias durante a noite a 37 graus Celsius e 100 RPM em um shaker com densidade óptica de 600,8 a 1,1. Meça a densidade óptica 600 da cultura bacteriana. E prepare o meio de infecção diluindo a cultura bacteriana em dmem 10% FCS para atingir a multiplicidade desejada de infecção.

Ou, MOI. Usando uma lavadora de placas automatizada, troque o meio de transfecção por 50 microlitros de meio de infecção. Dentro do exaustor, transfira a placa para a gaiola da centrífuga e centrifugue a placa de 384 poços a 400 vezes G e quatro graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, use o parafilme para selar a placa e incube-a em uma placa de alumínio pré-aquecida a 37 graus Celsius e 5% C02 por quatro horas. Após a incubação com o lavador de placas automatizado, use dmem com 10% FCS contendo 100 microgramas por mililitro de dentrimysen ou GM para lavar as células para inativar bactérias extracelulares. Em seguida, use o parafilme para selar a placa e coloque-a de volta na placa de alumínio pré-aquecida na incubadora por mais 40 horas para o ensaio do ponto final.

Para consertar as células, primeiro use PBS para lavar os poços. Em seguida, troque o PBS por 50 microlitros de 3,7% de PFA. Em 2 a pH 7,4.

E incube as células em temperatura ambiente por 20 minutos. Após a incubação, use 50 microlitros de PBS para trocar o meio de fixação. Para corar as amostras com a lavadora de placas automatizada, comece usando 50 microlitros de 1% Triton X-100 em PBS por 10 minutos para permeabilizar as células.

Depois de usar PBS para lavar as células três vezes, adicione 50 microlitros de PBS com um micrograma por mililitro de DAPI e incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, use PBS para lavar as células três vezes antes de protegê-las da luz. Transfira a placa para o microscópio automatizado.

Configure os parâmetros do microscópio. Selecione o subjetivo 10-X. Em seguida, selecione o formato da placa correspondente à placa de 384 poços.

Adquira nove locais por poço. Selecione Ativar foco baseado em laser. E concentre-se na placa e no fundo do poço.

Em seguida, defina primeiro bem adquirido como o poço inicial para encontrar a amostra e todos os locais para o foco automático do local. Em seguida, para o canal DAPI, ajuste manualmente o deslocamento Z para o foco. Em seguida, pressione Localizar amostra para definir o foco no fundo do poço.

Usando a função AutoExposure, obtenha uma boa estimativa do tempo de exposição. Corrija manualmente o tempo de exposição do canal DAPI para garantir uma ampla faixa dinâmica com baixa superexposição. Use esse tempo de exposição para obter imagens de vários locais em toda a placa.

E ajuste o tempo de exposição manualmente até que os pixels mais brilhantes atinjam aproximadamente 80% do brilho máximo sobre os locais. Repita as etapas para definir o foco e o tempo de exposição, de acordo com todos os outros canais. Em seguida, inicie a aquisição da placa cheia.

Para o ensaio do ponto final, use os canais DAPI e GFP para obter imagens da placa completa. Para executar uma análise de imagem em células coradas no ensaio de ponto final, depois de calcular um modelo de sombreamento, de acordo com o protocolo de texto em Exibir configurações de saída, selecione a pasta de entrada com as imagens e uma pasta de saída com os resultados. Em seguida, defina o texto que as imagens têm em comum e carregue os modelos de sombreamento.

Clique em Iniciar modo de teste e certifique-se de que a configuração de pausa e exibição de todos os módulos esteja desativada. Ative a configuração de pausa e exibição para o módulo nove ImageMath. O símbolo de pausa ativado aparecerá em amarelo.

A função de exibição ativada aparecerá como um olho aberto. Em seguida, clique em Executar para executar a análise até o módulo nove. No módulo nove, ajuste o parâmetro multiplique a segunda imagem por um valor que suprimirá o sinal DAPI em Brucella sem suprimir os núcleos.

Para testar os valores do módulo, pressione Etapa. Clique com o botão direito do mouse na imagem recém-aberta e defina o contraste da imagem para log normalizado. Repetidamente, volte para o módulo nove.

Ajuste o parâmetro, multiplique a segunda imagem e passe sobre o módulo novamente até que o sinal de Brucella seja totalmente suprimido, enquanto ao mesmo tempo as áreas pretas que indicam subtração excessiva são minimizadas. Encontrar bons parâmetros para determinados módulos requer a otimização gradual dos parâmetros. É definitivamente importante passar repetidamente pelos módulos, tentando valores diferentes e observar o efeito no resultado exibido.

Ative a pausa e a exibição do módulo 10. Identifique os objetos primários. Defina o limite inferior do parâmetro no limite, alto o suficiente para que os núcleos sejam segmentados e o plano de fundo seja ignorado.

Para identificar um bom valor, passe sobre o módulo, clique com o botão direito do mouse na imagem de entrada e exiba o histograma onde o pico normalmente indica o plano de fundo. A partir da intensidade de fundo, aumente o parâmetro até que a boa segmentação dos núcleos seja alcançada, conforme exibido na imagem de saída. O objetivo do pipeline de análise de imagem é identificar células que contêm bactérias replicantes.

Isso é obtido definindo diferentes limites para o sinal do patógeno no núcleo, perinúcleo e corpo celular de Voronoi. Ative a pausa e a exibição do módulo 15. Filtre objetos, como mostrado anteriormente, e pressione Executar.

Defina o valor mínimo do parâmetro suficientemente alto para que apenas as células com Brucella claramente visível no núcleo sejam mantidas e todas as outras sejam filtradas. Para identificar um bom valor, passe por cima do módulo e exiba a imagem de saída. Aumente o valor passo a passo até que apenas as células com Brucella claramente visível no núcleo sejam mantidas.

Depois de filtrar as células com bactérias no perinúcleo e no corpo celular de Voronoi nos módulos 16 e 17 de acordo com o protocolo de texto, saia do modo de teste e desmarque todos os símbolos de olho ao lado dos módulos para garantir que nenhum dos módulos mostre sua exibição antes de executar a análise completa. Por fim, pressione Analisar imagens para iniciar a análise. Quando a análise terminar, inspecione as imagens PNG resultantes, bem como a planilha CSV, para garantir que a análise tenha funcionado de forma confiável em toda a chapa.

Realize o ensaio de entrada e pontuação de infecção de acordo com o protocolo de texto. Esta figura mostra um exemplo de análise de imagem usada para identificar automaticamente células infectadas no ensaio de ponto final. Núcleos de células HeLa corados com DAPI foram identificados.

Um perinúcleo de oito pixels de largura ao redor do núcleo. E um corpo celular de Voronoi por extensão do núcleo, por 25 pixels, foram calculados. Uma célula foi considerada infectada se o sinal do patógeno excedesse o limite correspondente em pelo menos um compartimento.

Brucella requer rearranjos de ação para o engajamento bem-sucedido das células hospedeiras. Assim, a depleção de ARP23 é um controle positivo adequado para a triagem de siRNA. A depleção de ARPC3 reduziu o número de células com bactérias em proliferação dois dias após a infecção.

Em comparação com células controladas tratadas embaralhadas. A análise automatizada de imagens observou quantificavelmente a diminuição da infecção de células HeLa empobrecidas em ARPC3 em comparação com células controladas neste gráfico. A depleção de ARPC3 também mostrou uma redução na infecção por Brucella no ensaio de entrada em comparação com as células controladas.

Como visto pelo número reduzido de Brucella intracelular representado em amarelo. Finalmente, a quantificação da infecção por análise automatizada de imagens confirmou que o número de células infectadas, bem como o número de bactérias intracelulares nas células infectadas, foi reduzido pela depleção de ARPC3. Uma vez dominado, este protocolo pode fornecer resultados de análise de imagem dentro de uma semana e meia após o início do experimento.

Ao tentar este procedimento, é importante revisar cuidadosamente os resultados da análise de imagem para garantir que os parâmetros escolhidos tenham um bom desempenho em toda a placa. Após este procedimento, outros métodos, como imagens de células vivas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Como quando você está traficando, um determinado fator hospedeiro interage com Brucella.

Ou como a depleção de um gene afeta a dinâmica intracelular da infecção. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia da infecção explorarem os fatores do hospedeiro necessários para a infecção por Brucella em um ensaio de células HeLa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar os fatores do hospedeiro que promovem ou impedem a colonização bem-sucedida de células HeLa pelo patógeno intracelular Brucella abortus.

Não se esqueça de que trabalhar com Brucella abortus pode ser extremamente perigoso e os regulamentos locais de biossegurança devem ser rigorosamente seguidos.