Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na

O objetivo geral deste ensaio baseado em microscopia de alto rendimento é identificar fatores do hospedeiro envolvidos na infecção de células HeLa por Brucella. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de interação hospedeiro-patógeno, como a identificação de proteínas do hospedeiro que promovem ou impedem a colonização pelo patógeno intracelular Brucella. A principal vantagem desta técnica é que o fluxo de trabalho semi-automatizado, desde o laboratório de vetores até a análise de imagens, permite o uso de robôs e experimentos eficientes de alto rendimento.

Portanto, este método pode fornecer informações sobre as interações do Brucella com o hospedeiro utilizando telas de siRNA. Grande parte do protocolo pode ser aplicada a outras estratégias de triagem. Por exemplo, ou bibliotecas de siRNA.

Após cultivar células HeLa e preparar placas para triagem com siRNAs de acordo com o protocolo descrito no texto, descongele uma placa preta de 384 poços por centrifugação a 300 × g e temperatura ambiente por 20 minutos. Prepare o meio de transfeção utilizando DMEM à temperatura ambiente sem FCS. Dilua o reagente de transfeção na proporção de 1 para 200 e misture cuidadosamente antes do uso.

Usando um dispensador de reagentes, adicione 25 microlitros de meio de transfeção a cada poço de uma placa de 384 poços e misture as soluções movendo a placa para frente e para trás. Incube a placa à temperatura ambiente por uma hora para permitir a formação dos complexos do reagente de transfeção com siRNA. Enquanto isso, prepare as células HeLa aspirando o meio de cultura e adicionando 2,5 mililitros de tripsina 0,05% EDTA em PBS para lavar uma vez as células subconfluentes de um frasco de 75 centímetros quadrados.

Em seguida, adicione 1,5 mililitros de tripsina fresca e transfira o frasco para 37 graus Celsius por dois a três minutos, até que as células fiquem arredondadas. Use 10 mililitros de DMEM pré-aquecido com 60% de FCS para ressuspender as células. Em seguida, use um contador automático de células para contar as células antes de preparar uma suspensão celular com 10.000 células por mililitro em DMEM com 16% de FCS.

Adicione 50 microlitros de suspensão celular a cada poço do reagente de transfeção, resultando em 500 células por poço. Mova a placa para frente e para trás para distribuir uniformemente as células.

Em seguida, deixe a placa em temperatura ambiente por cinco a 10 minutos para permitir que as células sedimentem. Use parafilm para selar a placa. E incube-a em um incubador úmido sobre uma placa de alumínio pré-aquecida a 37 graus Celsius com 5% de CO2 por 72 horas.

Trabalhar com o patógeno de classe três B. abortus é perigoso e é necessário seguir as regulamentações locais de biossegurança, que incluem o uso de um macacão protetor, luvas, máscara e óculos de proteção. Um dia antes da infecção, inocular a quantidade previamente determinada de cultura inicial de B. abortus em 50 mililitros de meio TSB KM. Em um frasco de 250 mililitros com tampa rosqueável.

Use parafilm para vedar o frasco e cultive as bactérias durante a noite a 37 graus Celsius e 100 RPM em agitador até atingir densidade óptica 600 entre 0,8 e 1,1. Meça a densidade óptica 600 do cultivo bacteriano. E prepare o meio de infecção diluindo o cultivo bacteriano em DMEM com 10% de FCS para obter a multiplicidade de infecção desejada.

Ou, MOI. Usando um lavador automático de placas, substitua o meio de transfeção por 50 microlitros de meio de infecção. Dentro da câmara de segurança, transfira a placa para o rotor do centrifugador e centrifugue a placa de 384 poços a 400 × g e 4 °C por 20 minutos.

Em seguida, utilize parafilm para selar a placa e incube-a em uma placa de alumínio pré-aquecida a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por quatro horas. Após a incubação, com o lavador automático de placas, utilize DMEM com 10% de FCS contendo 100 microgramas por mililitro de dentrimisina ou GM para lavar as células e inativar as bactérias extracelulares. Em seguida, utilize parafilm para selar a placa e coloque-a novamente na placa de alumínio pré-aquecida dentro do incubador por mais 40 horas para o ensaio do ponto final.

Para fixar as células, primeiro use PBS para lavar os poços. Em seguida, substitua o PBS por 50 microlitros de PFA a 3,7% em 2 a pH 7,4.

E incubar as células à temperatura ambiente por 20 minutos. Após a incubação, usar 50 microlitros de PBS para trocar o meio de fixação. Para corar as amostras com o lavador automático de placas, começar usando 50 microlitros de Triton X-100 a 1% em PBS por 10 minutos para permeabilizar as células.

Após lavar as células três vezes com PBS, adicione 50 microlitros de PBS contendo um micrograma por mililitro de DAPI e incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, lave as células três vezes com PBS antes de protegê-las da luz. Transfira a placa para o microscópio automatizado.

Configure os parâmetros do microscópio. Selecione a objetiva de 10-X. Em seguida, selecione o formato de placa correspondente à placa de 384 poços.

Adquira nove campos por poço. Selecione Habilitar foco baseado em laser. E, foque no fundo da placa e do poço.

Em seguida, defina o primeiro poço adquirido como poço inicial para localizar a amostra e todos os pontos para o autofoco por ponto. Depois, no canal DAPI, ajuste manualmente o deslocamento Z para o foco. Então, pressione Localizar Amostra para definir o foco no fundo do poço.

Utilizando a função AutoExposição, obtenha uma boa estimativa para o tempo de exposição. Corrija manualmente o tempo de exposição para o canal DAPI para garantir uma ampla faixa dinâmica com baixa superexposição. Utilize este tempo de exposição para imagens de vários locais ao longo da placa.

E ajuste manualmente o tempo de exposição até que os pixels mais brilhantes atinjam aproximadamente 80% do brilho máximo nas áreas. Repita os passos para definir o foco e o tempo de exposição, conforme necessário, para todos os outros canais. Em seguida, inicie a aquisição de toda a placa.

Para o ensaio de ponto final, utilize os canais DAPI e GFP para imaginar toda a placa. Para realizar uma análise de imagem em células coradas no ensaio de ponto final, após calcular um modelo de sombreamento, selecione, de acordo com o protocolo descrito em Configurações de saída de visualização, a pasta de entrada com as imagens e uma pasta de saída para os resultados. Em seguida, defina o texto comum presente nas imagens e carregue os modelos de sombreamento.

Clique em Iniciar modo de teste e certifique-se de que a pausa e a configuração de exibição para todos os módulos estão desativadas. Habilite a pausa e a configuração de exibição para o módulo nove ImageMath. O símbolo de pausa habilitado aparecerá em amarelo.

A função de exibição ativada aparecerá como um olho aberto. Em seguida, clique em Executar para executar a análise até o módulo nove. No módulo nove, ajuste o parâmetro multiplicar a segunda imagem por um valor que suprima o sinal de DAPI em Brucella sem suprimir os núcleos.

Para testar os valores do módulo, pressione Avançar. Clique com o botão direito na imagem recém-aberta e defina o contraste da imagem como normalizado em escala logarítmica. Repetidamente, retorne ao módulo nove.

Ajuste o parâmetro de multiplicação da segunda imagem e percorra novamente o módulo até que o sinal de Brucella seja completamente suprimido, ao mesmo tempo em que as áreas pretas que indicam subtração excessiva sejam minimizadas. Encontrar bons parâmetros para certos módulos exige a otimização gradual desses parâmetros. É definitivamente importante percorrer repetidamente os módulos, testando diferentes valores e observando o efeito no resultado exibido.

Habilite a pausa e a exibição para o módulo 10. Identifique os objetos primários. Defina o limite inferior do parâmetro de limiar alto o suficiente para que os núcleos sejam segmentados e o fundo seja ignorado.

Para identificar um bom valor, passe o cursor sobre o módulo, clique com o botão direito na imagem de entrada e exiba o histograma, onde o pico geralmente indica o fundo. A partir da intensidade do fundo, aumente o parâmetro até obter uma boa segmentação dos núcleos, conforme exibido na imagem de saída. O objetivo do fluxo de análise de imagem é identificar células que contenham bactérias em replicação.

Isso é alcançado definindo diferentes limiares para o sinal do patógeno no núcleo, no perinúcleo e no corpo celular de Voronoi. Habilite a pausa e a exibição para o módulo 15. Filtre os objetos, conforme mostrado anteriormente, e pressione Executar.

Defina o valor mínimo do parâmetro suficientemente alto para que apenas as células com Brucella claramente visível no núcleo sejam mantidas, e todas as demais sejam filtradas. Para identificar um bom valor, percorra o módulo e exiba a imagem de saída. Aumente o valor progressivamente até que apenas células com Brucella claramente visível no núcleo sejam mantidas.

Após filtrar as células com bactérias no peri-núcleo e no corpo celular de Voronoi nos módulos 16 e 17 de acordo com o protocolo descrito no texto, saia do modo de teste e desmarque todos os símbolos de olho ao lado dos módulos para garantir que nenhum dos módulos exiba sua visualização antes de executar a análise completa. Por fim, pressione Analisar Imagens para iniciar a análise. Quando a análise for concluída, inspecione as imagens PNG resultantes, bem como a planilha CSV, para assegurar que a análise funcionou de forma confiável em toda a placa.

Realize o ensaio de entrada e a pontuação da infecção de acordo com o protocolo descrito no texto. Esta figura mostra um exemplo de análise de imagem utilizada para identificar automaticamente células infectadas no ensaio de ponto final. Os núcleos de células HeLa corados com DAPI foram identificados.

Um peri-núcleo com largura de oito pixels ao redor do núcleo e um corpo celular de Voronoi por extensão do núcleo, em 25 pixels, foram calculados. Uma célula foi considerada infectada se o sinal do patógeno excedesse o limiar correspondente em pelo menos um compartimento.

A Brucella requer reorganizações do citoesqueleto para o engajamento bem-sucedido das células hospedeiras. Assim, o esgotamento de ARP23 é um controle positivo adequado para triagem com siRNA. A redução de ARPC3 diminuiu o número de células com bactérias em proliferação dois dias após a infecção.

Em comparação com as células controle tratadas com sequência scramble. A análise automatizada de imagens observou quantitativamente uma diminuição na infecção de células HeLa com depleção de ARPC3 em comparação com as células controle neste gráfico. A depleção de ARPC3 também mostrou uma redução na infecção por Brucella no ensaio de entrada em comparação com as células controle.

Como observado pela redução do número de Brucella intracelular representada em amarelo. Por fim, a quantificação da infecção por análise automatizada de imagens confirmou que o número de células infectadas, bem como o número de bactérias intracelulares nas células infectadas, foi reduzido pela diminuição de ARPC3. Uma vez dominado, este protocolo pode fornecer resultados de análise de imagens em até uma semana e meia após o início do experimento.

Ao realizar este procedimento, é importante revisar cuidadosamente os resultados da análise de imagem para garantir que os parâmetros escolhidos funcionem adequadamente em toda a placa. Após este procedimento, outras técnicas, como o imageamento de células vivas, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais, como quando um determinado fator do hospedeiro interage com a Brucella durante o tráfego.

Ou como o esgotamento de um gene afeta a dinâmica intracelular da infecção. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia da infecção explorarem fatores do hospedeiro necessários para a infecção por Brucella em um ensaio com células HeLa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar fatores do hospedeiro que promovem ou impedem a colonização bem-sucedida de células HeLa pelo patógeno intracelular Brucella abortus.

Não se esqueça de que trabalhar com Brucella abortus pode ser extremamente perigoso e as regulamentações locais de biossegurança devem ser rigorosamente seguidas.