Name: Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na Brucella A infecção de células HeLa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Aprenda ensaios de microscopia para screening de alta vazão de fatores hospedeiros envolvidos na infecção de células HeLa por Brucella. Este método utiliza siRNA para identificar proteínas que promovem ou inibem a colonização.

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Este trabalho foi apoiado pelas bolsas 51RT 0_126008 e 51RTP0_151029 para o projeto de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnológico (RTD) InfectX e TargetInfectX, respectivamente, no âmbito da SystemsX.ch, a Iniciativa Suíça para Biologia de Sistemas. Reconhecemos o 310030B_149886 de concessão da Swiss National Science Foundation (SNSF). O trabalho de S.H.L. e A.C. foi apoiado pelo Programa Internacional de Doutorado "Fellowships for Excellence" da Biozentrum. Simone Muntwiler é reconhecida pela assistência técnica. Gostaríamos de agradecer a Dirk Bumann por fornecer o pNF106 e Jean Celli pelo pJC43 e pJC44.

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<li>Celli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+evades+macrophage+killing+via+VirB-dependent+sustained+interactions+with+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum.</a> J Exp Med. 198, 545-556 (2003).</li>
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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Os patógenos bacterianos desenvolveram inúmeras estratégias para manipular as células hospedeiras eucarióticas em seu benefício. Os patógenos que causam infecções agudas geralmente apresentam rápida proliferação, acompanhada por alarmismo significativo do sistema imunológico e perda de viabilidade das células infectadas. Em contraste, Brucella e outros patógenos que causam infecções crônicas conseguem estabelecer interações duradouras dentro das células hospedeiras. Portanto, as bactérias precisam ajustar as fun...

Espécies de Brucella são gram-negativas, agentes patogénicos intracelulares facultativos que pertencem à classe de α-Proteobacteria. Eles causar abortos e infertilidade em seus hospedeiros naturais, tais como gado, cabras, ou ovelhas, resultando em graves perdas económicas em áreas endêmicas. A brucelose é uma das doenças zoonóticas mais importantes do mundo, causando mais de meio milhão de novas infecções humanas por ano 1. A transmissão para humanos é mais comumente causada por contato direto com animais infectados ou pela ingestão de alimentos contaminados, como leite não pasteurizado. Os sintomas da doença são febril inespecífica, o que provoca dificuldades no diagnóstico de brucelose. Se não forem tratados, os pacientes podem desenvolver uma infecção crónica com sintomas mais graves, tais como a artrite, endocardite, e neuropatia 2. No nível celular Brucella é capaz de invadir células fagocíticas e não fagocíticas e replica no interior de uma intracelularcompartimento conhecido como o Brucella molecular contendo vacúolo (BCV). Internalização de bactérias requer rearranjos do citoesqueleto de actina por Rac, Rho, e ativação direta de Cdc42 3. Dentro da célula hospedeira eucariótica, o BCV transita ao longo da via endocítica e apesar da interacção com os lisossomas, bactérias conseguem evitar a degradação 4. A acidificação do BCV pelo vesicular ATPase é necessária para induzir a expressão do sistema de secreção de tipo IV bacteriana (T4SS) 5. Acredita-se que efectores bacterianas secretadas pela T4SS são essenciais para Brucella a estabelecer o seu nicho replicativa, uma vez que a deleção de 6 T4SS ou inibição da ATPase de chumbo vesicular a defeitos no estabelecimento do nicho intracelular 7. As bactérias não replicar durante a fase de tráfico até que eles alcançar um compartimento vacuolar derivada de ER-8. Uma vez que a proliferação ocorre intracelular, o BCV é encontrado em CLose associação com marcadores, tais como ER calnexina e glucose-6-fosfatase 6. Os mecanismos moleculares pelos quais Brucella entra nas células, evita a degradação lisossomal, e, finalmente, se replica em um compartimento do ER semelhante permanecer em grande parte desconhecida. Fatores do hospedeiro envolvidos em diferentes etapas de infecção foram principalmente identificado por abordagens específicas ou uma interferência tela pequena escala pequena RNA (siRNA), realizado em células de Drosophila 9. Estes têm lançar luz sobre a contribuição de fatores do hospedeiro individuais durante a infecção Brucella mas ainda estamos longe de uma compreensão abrangente de todo o processo. Aqui, os protocolos que permitem a identificação de factores do hospedeiro humano com RNA de interferência de rastreio em larga escala (RNAi) em combinação com a microscopia de fluorescência de campo amplo automatizado e de análise de imagem automatizada são apresentados. Reverso transfecção siRNA de células HeLa é realizada como describEd anteriormente com modificações menores 10,11. O ensaio endpoint abrange uma grande parte do ciclo de vida intracelular Brucella, exceto a saída e a infecção das células vizinhas. Para caracterizar ainda mais os hits identificadas no ensaio de ponto final, um protocolo modificado para identificar factores envolvidos nos passos iniciais da infecção é utilizado. Uma estirpe de Brucella abortus, que expressa constitutivamente GFP é utilizado para o ensaio de ponto final em que as bactérias são permitidos para infectar as células durante dois dias. Durante este tempo, as bactérias entram nas células, o tráfego para o nicho de replicação derivada de ER, e replicam no espaço peri-nuclear. Os altos níveis de sinal de GFP podem então ser usadas para detectar com fiabilidade as células individuais que contêm bactérias replicantes. Para estudar a entrada de Brucella num ensaio de elevado rendimento, é importante ser capaz de distinguir entre as bactérias intracelulares e extracelulares. O método aqui apresentado circumventos coloração de anticorpos diferencial de bactérias intracelulares e extracelulares. Ele baseia-se numa estirpe que expressa uma GFP Brucella induzível por tetraciclina em combinação com a expressão constitutiva de dsRed. A presença de um marcador dsRed constitutivo permite a identificação de todas as bactérias que estão presentes na amostra. expressão da GFP é induzida através da adição de tetraciclina anidrotetraciclina o análogo não-tóxico (ATC), simultaneamente com a inactivação de bactérias extracelulares por gentamicina (Gm). Enquanto o antibiótico Gm célula impermeável mata as bactérias extracelulares, atc pode entrar na célula hospedeira e induzir a expressão da GFP selectivamente em bactérias intracelulares. Esta dupla repórter permite a separação robusto de bactérias intracelulares individuais (GFP e de sinal dsRed) de bactérias extracelulares (somente sinal dsRed) por microscopia de campo amplo. De modo a alcançar a expressão da GFP intracelular detectável por Brucella verificou-se que 4 horas de indução por ATC resulta em um relisinal de poder. Esquemas de indução similares para expressar seletivamente GFP em bactérias intracelulares tem sido usado anteriormente para estudar Shigella intracelular 12.

<table><tbody><tr><td>Ágar Soja Tríptica (TSA)</td><td>BD</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de Soja Tríptico (TSB)</td><td>Fluka</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Leite</td><td></td><td></td><td></td>desnatado</tr><tr><td>250 ml garrafa com tampa de rosca</td><td>Corning</td><td>8396</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro de bezerro (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10270</td> Tripsina-EDTA <td>inativada por calor</td></tr><tr><td>(0,5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>10x solução estoque, diluir 1:10 em PBS</td></tr><tr><td>Cete 2.0 Contador de células</td><td>Merck Milipore</td><td>PHCC20060</td><td>Dispositivos alternativos de contagem de células podem ser usados</td></tr><tr><td>Placa Greiner CELLSTAR de 384 poços</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2062</td><td></td></tr><tr><td>Folha de alumínio destacável</td><td>Costar</td> Dispensador de reagente <td>6570</td><td></td></tr><tr><td>: "Dispensador de reagente Multidrop 384"</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840150</td><td>Dispensador de reagente alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>Reagente de transfecção: "Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Lavadora de placas automatizada: "Lavadora de placas ELx50-16"</td><td>BioTek</td><td>ELX5016</td><td>Esta lavadora de placas contém um coletor de 16 canais adequado para placas de 384 poços. Ele se encaixa em um gabinete de biossegurança e possui uma tampa cobrindo a placa durante a lavagem, o que reduz o risco de produção de aerossóis. Arruelas de placas alternativas com características semelhantes podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de anidrotetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>100 &#956; g/ml de etanol a 100% é mantida a -20 &graus; C protegido da luz em folha de alumínio</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Dissolver em tampão HEPES 0,2 M, pH 7,4. Armazene a -20 > C e descongele fresco no dia anterior à utilização. Cuidado, o PFA é tóxico por inalação, em contato com a pele e se ingerido.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>siRNA embaralhado</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>Kif11 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003317-00</td><td></td></tr><tr><td>ARPC3 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-005284-00</td><td></td></tr><tr><td>Brucella abortus 2308</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pJC43 (apHT::GFP)</td><td></td><td></td><td>Celli et al.12</td></tr><tr><td>pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP)</td><td></td><td></td><td>Construção: pJC44 4 foi digerido com EcoRI seguido pela geração de extremidades rombas com enzima Klenov e subsequente digestão com SalI. TetR-GFP foi amplificado a partir de pNF106 usando o primer prAC090 e prAC092. Após a digestão com SalI, o produto TetR-GFP foi ligado ao vetor pJC44 digerido.</td></tr><tr><td>Primer prAC090</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC</td></tr><tr><td>Primer prAC092</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT</td></tr><tr><td>TC HeLa CCL-2</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>IXM IMAGING MSCOPE</td><td>Microscópio de imagem celular automatizado equipado com um estágio Z motorizado de precisão. Sistemas alternativos para microscopia automatizada e componentes alternativos para hardware e software especificados abaixo podem ser empregados.</td></tr><tr>Dispositivos Moleculares de <td>Foco Automático a Laser de Alta Velocidade</td><td>&nbsp;</td><td>1-2300-1037</td><td></td></tr><tr><td>CFI Super Fluor 10X objetiva</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>MRF00100</td><td>N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Mola Fotométrica</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ Câmera CCD Monocromática</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>1-2300-1060</td><td>1.392 x 1.040 pixels de imagem, 6,45 x 6,45 &micro; m pixels, digitalização de 12 bits</td></tr><tr><td>Software MetaXpress</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>9500-0100</td><td></td></tr><tr><td>LUI-Spectra-X-7</td><td>Lumencor</td><td>SPECTRA X V-XXX-YZ</td><td>Motor de luz. As seguintes fontes de luz são usadas: violeta (DAPI), ciano (GFP), verde/amarelo (RFP)</td></tr><tr><td>Excitador de banda única para DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF01-377/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Emissor de banda única para DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td></td></tr><tr><td>Banda única dicróica para DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Excitador de banda única para GFP</td><td>Semrock</td><td>FF02-472/30-25</td><td></td></tr><tr><td>Emissor de banda única para GFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-520 / 35-25</td><td></td></tr><tr><td>Banda única dicróica para GFP</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Excitador de banda única para RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-562 / 40-25</td><td></td></tr><tr><td>Emissor de banda única para RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-624 / 40-25</td><td></td></tr><tr><td>Banda única dicróica para RFP</td><td>Semrock</td><td>FF593-Di03-25x36</td><td></td></tr></tbody></table>

os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de fatores hospedeiros envolvidos na<em&gt; brucella</em&gt; a infecção de células hela

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Espécies de Brucella são facultativos patógenos intracelulares que infectam os animais como seus hospedeiros naturais. A transmissão para humanos é mais comumente causada por contato direto com animais infectados ou pela ingestão de alimentos contaminados e pode levar a infecções crónicas graves. Brucella podem invadir células fagocíticas profissionais e não profissionais e replica dentro do retículo endoplasmático (ER) vacúolos -derived. Os fatores do hospedeiro necessárias para a entrada Brucella em células hospedeiras, evitar a degradação lisossomal, e replicação no compartimento de ER-like permanecem largamente desconhecidos. Aqui nós descrevemos dois ensaios para identificar fatores do hospedeiro envolvidos na entrada de Brucella e replicação em células HeLa. Os protocolos descrevem a utilização de interferência de ARN, enquanto que os métodos de rastreio alternativos podia ser aplicado. Os ensaios baseiam-se na detecção de bactérias marcadas com fluorescência em células hospedeiras marcados fluorescentemente utilizando automatizadomicroscopia de campo amplo. As imagens fluorescentes são analisados ​​por meio de uma tubagem de análise de imagem normalizado em CellProfiler único que permite marcar a infecção com base em células. No ensaio de ponto final, a replicação intracelular é medido dois dias após a infecção. Isso permite que as bactérias tráfego para o seu nicho de replicação, onde a proliferação é iniciada cerca de 12 horas após a entrada bacteriana. Brucella que estabeleceram com sucesso um nicho intracelular terá assim fortemente proliferaram dentro das células hospedeiras. Uma vez que as bactérias intracelulares irão em muito ultrapassam as bactérias não-replicativos intracelulares ou extracelulares individuais, uma estirpe que expressa constitutivamente a GFP pode ser utilizado. O sinal de GFP forte é então utilizado para identificar as células infectadas. Em contraste, para o ensaio de entrada é essencial para diferenciar entre intracelular e bactérias extracelulares. Aqui, uma estirpe que codifica para uma GFP tetraciclina indutível é utilizado. Induçãode GFP com inactivação simultânea de bactérias extracelulares por gentamicina permite a diferenciação entre as bactérias extracelulares e intracelulares com base no sinal de GFP, com apenas bactérias intracelulares ser capaz de expressar GFP. Isto permite a detecção de bactérias intracelulares robusta simples antes proliferação intracelular é iniciada.

A Figura 1A mostra um exemplo de análise de imagem usado para identificar automaticamente as células infectadas no ensaio de ponto final. Núcleos de células HeLa coradas com DAPI foram identificados, um peri-núcleo de largura 8 pixels em torno do núcleo, e um corpo da célula de Voronoi por extensão do núcleo por 25 pixels foram calculados. Uma vez que as bactérias proliferam principalmente no espaço peri-nuclear, a intensidade de GFP nesta área da célula é a medida mais ...

Dois ensaios para triagem de alto rendimento baseada em microscopia de fatores do hospedeiro envolvidos na infecção por Brucella são descritos. O ensaio de entrada detecta os fatores do hospedeiro necessários para a entrada de Brucella e o ensaio de endpoint aqueles necessários para a replicação intracelular. Embora aplicável para abordagens alternativas, a triagem de siRNA em células HeLa é usada para ilustrar os protocolos.

Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na<em&gt; Brucella</em&gt; A infecção de células HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

O objetivo geral deste ensaio baseado em microscopia de alto rendimento é identificar fatores do hospedeiro envolvidos na infecção de células HeLa por Brucella. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de interação hospedeiro-patógeno, como a identificação de proteínas do hospedeiro que promovem ou impedem a colonização pelo patógeno intracelular Brucella. A principal vantagem desta técnica é que o fluxo de trabalho semi-automatizado, desde o laboratório de vetores até a análise de imagens, permite o uso de robôs e experimentos eficientes de alto rendimento.Portanto, este método pode fornecer informações sobre as interações do Brucella com o hospedeiro utilizando telas de siRNA. Grande parte do protocolo pode ser aplicada a outras estratégias de triagem. Por exemplo, ou bibliotecas de siRNA.Após cultivar células HeLa e preparar placas para triagem com siRNAs de acordo com o protocolo descrito no texto, descongele uma placa preta de 384 poços por centrifugação a 300 × g e temperatura ambiente por 20 minutos. Prepare o meio de transfeção utilizando DMEM à temperatura ambiente sem FCS. Dilua o reagente de transfeção na proporção de 1 para 200 e misture cuidadosamente antes do uso.Usando um dispensador de reagentes, adicione 25 microlitros de meio de transfeção a cada poço de uma placa de 384 poços e misture as soluções movendo a placa para frente e para trás. Incube a placa à temperatura ambiente por uma hora para permitir a formação dos complexos do reagente de transfeção com siRNA. Enquanto isso, prepare as células HeLa aspirando o meio de cultura e adicionando 2,5 mililitros de tripsina 0,05% EDTA em PBS para lavar uma vez as células subconfluentes de um frasco de 75 centímetros quadrados.Em seguida, adicione 1,5 mililitros de tripsina fresca e transfira o frasco para 37 graus Celsius por dois a três minutos, até que as células fiquem arredondadas. Use 10 mililitros de DMEM pré-aquecido com 60% de FCS para ressuspender as células. Em seguida, use um contador automático de células para contar as células antes de preparar uma suspensão celular com 10.000 células por mililitro em DMEM com 16% de FCS.Adicione 50 microlitros de suspensão celular a cada poço do reagente de transfeção, resultando em 500 células por poço. Mova a placa para frente e para trás para distribuir uniformemente as células.Em seguida, deixe a placa em temperatura ambiente por cinco a 10 minutos para permitir que as células sedimentem. Use parafilm para selar a placa. E incube-a em um incubador úmido sobre uma placa de alumínio pré-aquecida a 37 graus Celsius com 5% de CO2 por 72 horas.Trabalhar com o patógeno de classe três B. abortus é perigoso e é necessário seguir as regulamentações locais de biossegurança, que incluem o uso de um macacão protetor, luvas, máscara e óculos de proteção. Um dia antes da infecção, inocular a quantidade previamente determinada de cultura inicial de B. abortus em 50 mililitros de meio TSB KM. Em um frasco de 250 mililitros com tampa rosqueável.Use parafilm para vedar o frasco e cultive as bactérias durante a noite a 37 graus Celsius e 100 RPM em agitador até atingir densidade óptica 600 entre 0,8 e 1,1. Meça a densidade óptica 600 do cultivo bacteriano. E prepare o meio de infecção diluindo o cultivo bacteriano em DMEM com 10% de FCS para obter a multiplicidade de infecção desejada.Ou, MOI. Usando um lavador automático de placas, substitua o meio de transfeção por 50 microlitros de meio de infecção. Dentro da câmara de segurança, transfira a placa para o rotor do centrifugador e centrifugue a placa de 384 poços a 400 × g e 4 °C por 20 minutos.Em seguida, utilize parafilm para selar a placa e incube-a em uma placa de alumínio pré-aquecida a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por quatro horas. Após a incubação, com o lavador automático de placas, utilize DMEM com 10% de FCS contendo 100 microgramas por mililitro de dentrimisina ou GM para lavar as células e inativar as bactérias extracelulares. Em seguida, utilize parafilm para selar a placa e coloque-a novamente na placa de alumínio pré-aquecida dentro do incubador por mais 40 horas para o ensaio do ponto final.Para fixar as células, primeiro use PBS para lavar os poços. Em seguida, substitua o PBS por 50 microlitros de PFA a 3,7% em 2 a pH 7,4.E incubar as células à temperatura ambiente por 20 minutos. Após a incubação, usar 50 microlitros de PBS para trocar o meio de fixação. Para corar as amostras com o lavador automático de placas, começar usando 50 microlitros de Triton X-100 a 1% em PBS por 10 minutos para permeabilizar as células.Após lavar as células três vezes com PBS, adicione 50 microlitros de PBS contendo um micrograma por mililitro de DAPI e incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, lave as células três vezes com PBS antes de protegê-las da luz. Transfira a placa para o microscópio automatizado.Configure os parâmetros do microscópio. Selecione a objetiva de 10-X. Em seguida, selecione o formato de placa correspondente à placa de 384 poços.Adquira nove campos por poço. Selecione Habilitar foco baseado em laser. E, foque no fundo da placa e do poço.Em seguida, defina o primeiro poço adquirido como poço inicial para localizar a amostra e todos os pontos para o autofoco por ponto. Depois, no canal DAPI, ajuste manualmente o deslocamento Z para o foco. Então, pressione Localizar Amostra para definir o foco no fundo do poço.Utilizando a função AutoExposição, obtenha uma boa estimativa para o tempo de exposição. Corrija manualmente o tempo de exposição para o canal DAPI para garantir uma ampla faixa dinâmica com baixa superexposição. Utilize este tempo de exposição para imagens de vários locais ao longo da placa.E ajuste manualmente o tempo de exposição até que os pixels mais brilhantes atinjam aproximadamente 80% do brilho máximo nas áreas. Repita os passos para definir o foco e o tempo de exposição, conforme necessário, para todos os outros canais. Em seguida, inicie a aquisição de toda a placa.Para o ensaio de ponto final, utilize os canais DAPI e GFP para imaginar toda a placa. Para realizar uma análise de imagem em células coradas no ensaio de ponto final, após calcular um modelo de sombreamento, selecione, de acordo com o protocolo descrito em Configurações de saída de visualização, a pasta de entrada com as imagens e uma pasta de saída para os resultados. Em seguida, defina o texto comum presente nas imagens e carregue os modelos de sombreamento.Clique em Iniciar modo de teste e certifique-se de que a pausa e a configuração de exibição para todos os módulos estão desativadas. Habilite a pausa e a configuração de exibição para o módulo nove ImageMath. O símbolo de pausa habilitado aparecerá em amarelo.A função de exibição ativada aparecerá como um olho aberto. Em seguida, clique em Executar para executar a análise até o módulo nove. No módulo nove, ajuste o parâmetro multiplicar a segunda imagem por um valor que suprima o sinal de DAPI em Brucella sem suprimir os núcleos.Para testar os valores do módulo, pressione Avançar. Clique com o botão direito na imagem recém-aberta e defina o contraste da imagem como normalizado em escala logarítmica. Repetidamente, retorne ao módulo nove.Ajuste o parâmetro de multiplicação da segunda imagem e percorra novamente o módulo até que o sinal de Brucella seja completamente suprimido, ao mesmo tempo em que as áreas pretas que indicam subtração excessiva sejam minimizadas. Encontrar bons parâmetros para certos módulos exige a otimização gradual desses parâmetros. É definitivamente importante percorrer repetidamente os módulos, testando diferentes valores e observando o efeito no resultado exibido.Habilite a pausa e a exibição para o módulo 10. Identifique os objetos primários. Defina o limite inferior do parâmetro de limiar alto o suficiente para que os núcleos sejam segmentados e o fundo seja ignorado.Para identificar um bom valor, passe o cursor sobre o módulo, clique com o botão direito na imagem de entrada e exiba o histograma, onde o pico geralmente indica o fundo. A partir da intensidade do fundo, aumente o parâmetro até obter uma boa segmentação dos núcleos, conforme exibido na imagem de saída. O objetivo do fluxo de análise de imagem é identificar células que contenham bactérias em replicação.Isso é alcançado definindo diferentes limiares para o sinal do patógeno no núcleo, no perinúcleo e no corpo celular de Voronoi. Habilite a pausa e a exibição para o módulo 15. Filtre os objetos, conforme mostrado anteriormente, e pressione Executar.Defina o valor mínimo do parâmetro suficientemente alto para que apenas as células com Brucella claramente visível no núcleo sejam mantidas, e todas as demais sejam filtradas. Para identificar um bom valor, percorra o módulo e exiba a imagem de saída. Aumente o valor progressivamente até que apenas células com Brucella claramente visível no núcleo sejam mantidas.Após filtrar as células com bactérias no peri-núcleo e no corpo celular de Voronoi nos módulos 16 e 17 de acordo com o protocolo descrito no texto, saia do modo de teste e desmarque todos os símbolos de olho ao lado dos módulos para garantir que nenhum dos módulos exiba sua visualização antes de executar a análise completa. Por fim, pressione Analisar Imagens para iniciar a análise. Quando a análise for concluída, inspecione as imagens PNG resultantes, bem como a planilha CSV, para assegurar que a análise funcionou de forma confiável em toda a placa.Realize o ensaio de entrada e a pontuação da infecção de acordo com o protocolo descrito no texto. Esta figura mostra um exemplo de análise de imagem utilizada para identificar automaticamente células infectadas no ensaio de ponto final. Os núcleos de células HeLa corados com DAPI foram identificados.Um peri-núcleo com largura de oito pixels ao redor do núcleo e um corpo celular de Voronoi por extensão do núcleo, em 25 pixels, foram calculados. Uma célula foi considerada infectada se o sinal do patógeno excedesse o limiar correspondente em pelo menos um compartimento.A Brucella requer reorganizações do citoesqueleto para o engajamento bem-sucedido das células hospedeiras. Assim, o esgotamento de ARP23 é um controle positivo adequado para triagem com siRNA. A redução de ARPC3 diminuiu o número de células com bactérias em proliferação dois dias após a infecção.Em comparação com as células controle tratadas com sequência scramble. A análise automatizada de imagens observou quantitativamente uma diminuição na infecção de células HeLa com depleção de ARPC3 em comparação com as células controle neste gráfico. A depleção de ARPC3 também mostrou uma redução na infecção por Brucella no ensaio de entrada em comparação com as células controle.Como observado pela redução do número de Brucella intracelular representada em amarelo. Por fim, a quantificação da infecção por análise automatizada de imagens confirmou que o número de células infectadas, bem como o número de bactérias intracelulares nas células infectadas, foi reduzido pela diminuição de ARPC3. Uma vez dominado, este protocolo pode fornecer resultados de análise de imagens em até uma semana e meia após o início do experimento.Ao realizar este procedimento, é importante revisar cuidadosamente os resultados da análise de imagem para garantir que os parâmetros escolhidos funcionem adequadamente em toda a placa. Após este procedimento, outras técnicas, como o imageamento de células vivas, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais, como quando um determinado fator do hospedeiro interage com a Brucella durante o tráfego.Ou como o esgotamento de um gene afeta a dinâmica intracelular da infecção. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia da infecção explorarem fatores do hospedeiro necessários para a infecção por Brucella em um ensaio com células HeLa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar fatores do hospedeiro que promovem ou impedem a colonização bem-sucedida de células HeLa pelo patógeno intracelular Brucella abortus.Não se esqueça de que trabalhar com Brucella abortus pode ser extremamente perigoso e as regulamentações locais de biossegurança devem ser rigorosamente seguidas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Casanova, A., et al. Ensaios baseados em microscopia para triagem de alta produtividade de fatores do hospedeiro envolvidos na infecção por Brucella em células hela. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra imagens de alta taxa da infecção por Brucella abortus em células epiteliais com knockdown STING mediado por siRNA para investigar o papel da detecção do DNA citosólico na replicação intracelular bacteriana e na resposta imune inata do hospedeiro.

Imagem de Alta Capacidade de Infecção Intracelular por Brucella abortus em Células Epiteliais do Hospedeiro

Descreve-se um método para controlar a ruptura endomembranar provocada pelas bactérias...

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Esta técnica proporciona um método para colher, normalizar e quantificar o crescimento intracelular das bactérias, que são pré-cultivadas em células hospedeiras naturais protozoários antes da infecção de células de mamíferos. Este método pode ser modificado para acomodar uma grande variedade de células hospedeiras para a fase de escorvamento, bem como tipos de células-alvo.

Tratáveis ​​mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

Nós descrevemos um método de microscopia correlativa que combina alta velocidade de microscopia de luz fluorescente de células vivas 3D de alta resolução tomografia crio-eletrônico. Nós demonstrar a capacidade do método dinâmico de imagem por correlativo, as pequenas partículas de HIV-1 que interagem com células HeLa hospedeiras.

Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

Aqui, descrevemos um ensaio fenotípico aplicável às telas de alto rendimento/alto conteúdo de pequenas interfissões de RNA sintético (siRNA), composto químico e bibliotecas mutantes mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se na detecção de Mycobacterium tuberculosis rotulado fluorescentemente dentro de célula hospedeira fluorescente rotulada usando microscopia confocal automatizada.

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Coxiella burnetii é uma bactéria intracelular obrigatório Gram-negativa responsável pela febre Q doença zoonótica. Aqui, descrevemos métodos para a geração de mutantes por transposões Coxiella fluorescente, bem como a identificação e análise automatizada dos internalização, replicação e citotóxicos fenótipos resultantes.

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

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High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

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