Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

O objetivo geral deste procedimento é gerar células-tronco trofoblásticas induzidas genuínas ou iTSCs a partir de fibroblastos murinos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células-tronco sobre a natureza da barreira que separa a linhagem embrionária da extra embrionária. A principal vantagem dessa técnica é que a expressão transgênica é ativada apenas transitoriamente, facilitando a seleção de células convertidas de forma estável.

Em um laboratório de nível de biossegurança dois, usando o equipamento de proteção individual apropriado, cubra cinco pratos de 100 mililitros com cinco mililitros de solução de poli-L-lisina, balançando suavemente as placas para distribuir uniformemente a solução de revestimento. Coloque os pratos em uma incubadora de 37 graus Celsius por 30 minutos, depois aspire a poli-L-lisina e lave os pratos uma vez com PBS. Em seguida, coloque sete vezes 10 a sextas células de 293 T por prato em 10 mililitros de meio de células de 293 T, gire os pratos para distribuir uniformemente as células e retorne os pratos à incubadora.

Na manhã seguinte, substitua o meio de crescimento por cinco mililitros de meio de transfecção. Em seguida, trate as culturas com seis microlitros de um estoque 1000X de solução de cloroquina e coloque as placas de volta na incubadora a 37 graus Celsius. Para preparar a mistura de transfecção, para cada vetor lentiviral, adicione 600 microlitros de solução de DNA lentivetor gota a gota em 600 microlitros de solução salina tamponada com HEPES 2X durante o vórtice e incube a mistura de transfecção à temperatura ambiente.

Após 15 minutos, adicione com muito cuidado a mistura gota a gota às células 293 T preparadas e devolva os pratos à incubadora. Após cinco a seis horas, substitua o meio por 10 mililitros de meio de produção de vírus e coloque as placas de volta na incubadora. Na manhã seguinte, substitua cuidadosamente o meio por sete mililitros de meio de produção de vírus fresco para outra incubação noturna.

Em seguida, transfira o meio de cada placa para tubos cônicos individuais de 15 mililitros e adicione sete mililitros de meio de produção de vírus fresco nas placas para outra incubação durante a noite. Na manhã seguinte, colher o segundo lote de meio contendo vírus, agrupar o sobrenadante com o primeiro lote de vírus e coar o meio contendo vírus através de um filtro de membrana de acetato de celulose livre de surfactante de 0,45 mícron para armazenamento em alíquotas de 500 microlitros a menos 80. Para converter os fibroblastos em células-tronco trofoblásticas induzidas, lave os fibroblastos embrionários em massa transduzidos ou MEFs duas vezes com dois mililitros de PBS.

Em seguida, retire as células com 0,5 mililitros de solução de tripsina EDTA a 37 graus Celsius. Após três a quatro minutos, confirme se as células foram retiradas da placa sob um microscópio invertido e, em seguida, ative a tripsina com um mililitro de meio TS. Transferir as suspensões celulares para tubos cónicos individuais de 15 mililitros e centrifugar as células.

Em seguida, ressuspenda os pellets em dois mililitros de meio TS e coloque duas vezes 10 elevado ao quinto mCherry de quatro fatores ou controle MEFs não transduzidos por prato de 100 mililitros em 10 mililitros de meio TS contendo fator de crescimento de fibroblastos quatro e heparina suplementada com doxiciclina para cultura durante a noite. No dia seguinte, sob um microscópio de epifluorescência, use a expressão da proteína mCherry para estimar a eficiência da transdução. Se a eficiência de transdução for de cerca de 100%, retorne as culturas para a incubadora, trocando o meio em todos os pratos em dias alternados até o dia 10.

Em seguida, alimente as células com meio TS fresco contendo fator de crescimento de fibroblastos quatro e heparina sem doxiciclina usando o microscópio invertido para monitorar o aparecimento de áreas transdiferenciadas na placa de quatro fatores por até três semanas. A identificação das áreas transdiferenciadas é crítica, uma vez que, neste ponto, os MEFs não se assemelham morfologicamente às células-tronco trofoblásticas. Procure colônias densamente empilhadas adjacentes às células gigantes do trofoblasto, que são identificadas por seu tamanho celular e núcleo grande.

Para isolar linhas individuais de iTSC, primeiro limpe o microscópio invertido com 70% de etanol para minimizar a chance de contaminação bacteriana. Em seguida, adicione 40 microlitros de 05% de tripsina EDTA em 12 poços de uma placa de fundo de 96 U e coloque a placa no gelo. Agora aspire o meio do prato de transdiferenciação MEF dos quatro fatores e lave as células uma vez com 10 mililitros de PBS.

Após a lavagem, adicione 10 mililitros de PBS fresco às células e coloque a placa no estágio de microscópio invertido. Usando uma pipeta de 100 microlitros ajustada para 40 microlitros, circule cada colônia individual com a ponta da pipeta e aspire a colônia flutuante resultante. Transfira cada colônia para poços individuais da placa de 96 poços até que 12 colônias tenham sido colhidas.

Em seguida, incube as colônias a 37 graus Celsius por cinco minutos. No final da incubação, dissocie as células com pipetagem e transfira as suspensões celulares para poços individuais de uma placa de 24 poços contendo 500 microlitros de TS completo mais fator de crescimento de fibroblastos e meio de heparina para cultura durante a noite. No dia seguinte, substitua o meio por TS completo fresco mais fator de crescimento de fibroblastos e meio de heparina para remover as células mortas e retornar a placa à incubadora.

Monitorando as culturas diariamente quanto ao aparecimento de colônias epiteliais com limites brilhantes. Quando as colônias forem observadas, cultive as células por até uma semana ou até que estejam 70% confluentes. Em culturas onde a expressão transgênica dos quatro fatores é ativada, as células mudam rapidamente de morfologia.

Por volta dos dias 14 a 21, surgem áreas transdiferenciadas distintas. Essas colônias primárias carecem da morfologia típica de células-tronco trofoblásticas, no entanto, uma vez que são subcultivadas, é observada uma morfologia epitelial característica com bordas apertadas e limites brilhantes, altamente reminiscente de células-tronco trofoblásticas genuínas. Quando as células-tronco trofoblásticas induzidas pelos quatro fatores permanecem positivas para o fator de transcrição trofoblasto, Cdx2 e Tfap2c, a ideia dessas linhagens pode ser usada para análises In vitro ou InVivo subsequentes.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em seis semanas se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como injeção assistida por explosão, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre o potencial de quimerização dos iTSCs gerados. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo ou segregação de linhagem inicial explorarem a conversão de destino celular embrionário versus extra embrionário em camundongos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como converter diretamente novos fibroblastos embrionários em células-tronco trofoblásticas induzidas. Não se esqueça de que trabalhar com vetores lentivirais pode ser extremamente perigoso e que precauções como o uso de procedimentos de trabalho apropriados de nível de biossegurança devem sempre ser seguidas.