Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

O objetivo geral deste procedimento é gerar células-tronco de trofoblasto induzidas autênticas, ou iTSCs, a partir de fibroblastos murinos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo das células-tronco sobre a natureza da barreira que separa a linhagem embrionária da linhagem extraembrionária. A principal vantagem desta técnica é que a expressão transgênica é ativada apenas de forma transitória, facilitando a seleção de células estavelmente convertidas.

Em um laboratório de nível biosseguro dois utilizando os equipamentos de proteção individual apropriados, cubra cinco placas de 100 mililitros com cinco mililitros de solução de poli-L-lisina, movimentando suavemente as placas para distribuir uniformemente a solução de revestimento. Coloque as placas em uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos, em seguida aspire a poli-L-lisina e lave as placas uma vez com PBS. Em seguida, plaque sete vezes 10 à sexta células 293 T por placa em 10 mililitros de meio para células 293 T, gire suavemente as placas para distribuir as células de maneira uniforme e devolva as placas à incubadora.

Na manhã seguinte, substitua o meio de crescimento por cinco mililitros de meio de transfeção. Em seguida, trate as culturas com seis microlitros de uma solução estoque de cloroquina 1000X e coloque as placas de volta no incubador a 37 graus Celsius. Para preparar a mistura de transfeção, adicione, para cada vetor lentiviral, 600 microlitros da solução de DNA Lentivector gota a gota em 600 microlitros de solução salina tamponada com HEPES 2X sob agitação em vórtex e incube a mistura de transfeção à temperatura ambiente.

Após 15 minutos, adicione cuidadosamente a mistura gota a gota às células 293 T preparadas e retorne as placas ao incubador. Após cinco a seis horas, substitua o meio por 10 mililitros de meio de produção de vírus e coloque as placas de volta no incubador. Na manhã seguinte, substitua cuidadosamente o meio por sete mililitros de meio fresco de produção de vírus para outra incubação noturna.

Em seguida, transfira o meio de cada placa para tubos cónicos individuais de 15 mililitros e adicione sete mililitros de meio fresco de produção de vírus às placas para uma nova incubação durante a noite. Na manhã seguinte, colete o segundo lote do meio contendo o vírus, reunindo o sobrenadante com o primeiro lote de vírus e filtre o meio contendo o vírus através de um filtro de membrana de acetato de celulose livre de surfactante de 0,45 mícron para armazenamento em alíquotas de 500 microlitros a menos 80. Para converter os fibroblastos em células-tronco trofoblásticas induzidas, lave os fibroblastos embrionários transduzidos ou MEFs duas vezes com dois mililitros de PBS.

Em seguida, desprenda as células com 0,5 mililitros de solução de Tripsina-EDTA a 37 graus Celsius. Após três a quatro minutos, confirme que as células se descolaram da placa em um microscópio invertido e, então, ative a Tripsina com um mililitro de meio TS. Transfira as suspensões celulares para tubos cónicos individuais de 15 mililitros e centrifugue as células.

Em seguida, re-suspenda os pellets em dois mililitros de meio TS e plaque duas vezes 10 à quinta potência de MEFs mCherry com quatro fatores ou MEFs controle não transduzidos por placa de 100 mililitros em 10 mililitros de meio TS contendo fator de crescimento de fibroblastos quatro e heparina suplementado com doxiciclina para cultura noturna. No dia seguinte, sob um microscópio de epifluorescência, utilize a expressão da proteína mCherry para estimar a eficiência de transdução. Se a eficiência de transdução for de aproximadamente 100%, retorne as culturas ao incubador, trocando o meio em todas as placas a cada dois dias até o dia 10.

Posteriormente, alimente as células com meio TS fresco contendo fator de crescimento de fibroblastos quatro e heparina, sem doxiciclina, utilizando o microscópio invertido para monitorar o aparecimento de áreas transdiferenciadas na placa com os quatro fatores por até três semanas. A identificação das áreas transdiferenciadas é fundamental, pois, neste momento, os MEFs não se assemelham morfologicamente a células-tronco de trofoblasto. Procure por colônias densamente empilhadas adjacentes às células gigantes de trofoblasto, que são identificadas pelo seu tamanho celular e núcleo grande.

Para isolar linhagens individuais de iTSCs, primeiro limpe o microscópio invertido com etanol 70% para minimizar a chance de contaminação bacteriana. Em seguida, adicione 40 microlitros de Tripsina 0,5% EDTA em 12 poços de uma placa de fundo em U de 96 poços e coloque a placa no gelo. Agora aspire o meio do prato de transdiferenciação de MEF com os quatro fatores e lave as células uma vez com 10 mililitros de PBS.

Após a lavagem, adicione 10 mililitros de PBS fresco às células e coloque a placa sobre a platina do microscópio invertido. Usando uma pipeta de 100 microlitros ajustada para 40 microlitros, contorne cada colônia individual com a ponteira da pipeta e aspire a colônia resultante em suspensão. Transfira cada colônia para poços individuais da placa de 96 poços até que 12 colônias tenham sido coletadas.

Em seguida, incubar as colônias a 37 graus Celsius por cinco minutos. Ao final da incubação, dissociar as células por pipetagem e transferir as suspensões celulares para poços individuais de uma placa de 24 poços contendo 500 microlitros de meio TS completo mais fator de crescimento de fibroblastos e heparina para cultura noturna. No dia seguinte, substituir o meio por meio fresco de TS completo mais fator de crescimento de fibroblastos e heparina para remover as células mortas e devolver a placa ao incubador.

Monitorar diariamente as culturas quanto ao aparecimento de colônias epiteliais com bordas brilhantes. Quando as colônias forem observadas, cultivar as células por até uma semana ou até que atinjam 70% de confluência. Em culturas onde a expressão do transgene dos quatro fatores é ativada, as células mudam rapidamente a morfologia.

Por volta dos dias 14 a 21, surgem áreas distintas de transdiferenciação. Essas colônias primárias não possuem a morfologia típica de células-tronco de trofoblasto, entretanto, após serem subcultivadas, observa-se uma morfologia epitelial característica com bordas definidas e limites brilhantes, altamente semelhante à de células-tronco de trofoblasto autênticas. Quando as células-tronco de trofoblasto induzidas por quatro fatores permanecem positivas para o fator de transcrição de trofoblasto Cdx2 e Tfap2c, a ideia dessas linhagens pode ser utilizada para análises subsequentes in vitro ou in vivo.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em seis semanas se for realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como a injeção assistida por blastócito, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre o potencial de quimerização dos iTSCs gerados. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de segregação precoce de linhagens explorarem a conversão do destino celular embrionário versus extraembrionário em camundongos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como converter diretamente fibroblastos embrionários novos em células-tronco de trofoblasto induzidas. Não se esqueça de que o trabalho com vetores lentivirais pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de procedimentos apropriados de nível de biossegurança dois, devem sempre ser seguidas.