Name: Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda a converter fibroblastos embrionários murinos em células-tronco trofoblásticas induzidas usando expressão transgênica temporária de fatores de transcrição. Este método permite estudar a diferenciação celular e desenvolvimento placentário.

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Todas as experiências de rato foram conduzidos de acordo com a lei alemã de protecção dos animais e de acordo com a aprovação dos comités Institutional Animal Care locais (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia [número de identificação de aprovação: AZ 84-02.04.2013 .A428]). 1. Preparação de Meios <ol><li> Prepare forma 293T: de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), 10% (v / v) de FBS, L-glutamina (2 mM), piruvato de sódio (1 mM), penicilina / estreptomicina (1x). </li><li> Prepare MEF meio: DMEM, 10% (v / v) de FBS, L-glutamina (2 mM), aminoácidos não essenciais 1x, penicilina / estreptomicina (1x). </li><li> Preparar o meio TS (w / o FGF4 / heparina): meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, 20% (v / v) de FBS (célula estaminal cultura grau), penicilina / estreptomicina (1x), L-glutamina (2 mM ), piruvato de sódio (1 mM), 2-mercaptoetanol (0,1 mM). </li><li> Preparar o meio TS com FGF4 / heparina (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v / v) de FBS (célula estaminalcultura grau), penicilina / estreptomicina (1x), L-glutamina (2 mM), piruvato de sódio (1 mM), 2-mercaptoetanol (0,1 mM), 25 ng / ml FGF4, 1 ug / ml de heparina. Nota: FGF4 e heparina são adicionados diretamente para a mídia imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepare TS-CM com FGF4 / heparina (TS-CM + F4H): 70% ar-MEF TS meio + 30% preparado de fresco TS meio + 25 ng / ml FGF4, 1 ug / ml de heparina. Nota: FGF4 e heparina são adicionados diretamente para a mídia imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepare meio de transfecção: avançada DMEM, 2% (v / v) de FBS (grau de cultura de células-tronco), L-glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (1x). </li><li> Prepare forma Virus-produção: avançada DMEM, 5% (v / v) de FBS (grau de cultura de células-tronco), L-glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (1x). </li></ol> 2. Murino Embryonic de fibroblastos Derivação <ol><li> Definir acasalamentos cronometrados usando peso 129S2SV fêmeas e machos homozigotos ratos R26 :: rtTA (nome estirpe; B6.Cg-Gt (Rosa) 26Sor TM1 (rtTA* M2) Jae / J 7). Em E13.5 sacrifício ratinhos por deslocamento cervical e isolar fibroblastos primários de murino embrionárias (MEFs) de acordo com protocolos padrão 8. Em seguida, células de chapa a partir de um embrião de um prato de 150 mm à media MEF. </li><li> Uma vez que as culturas primárias MEF atingem a confluência em pratos de 150 mm, lavar as células duas vezes com 10 ml de PBS e adicionar uma solução de tripsina / EDTA 4 ml de 0,05%. Incubar pratos para 3-4 min no incubador a 37 ° C. </li><li> Após incubação de verificação se as células isoladas a partir da placa, utilizando um microscópio invertido (usando uma lente de 10X). Adicionar 5 ml de meio de MEF para parar tripsinização e recolher suspensão de células para um tubo de 50 ml. </li><li> suspensão de células piscina de vários pratos e recolher em um tubo de 50 ml. suspensão de células Centrifugar durante 3 min a 200 xg e 10 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em FBS contendo 10% (v / v) de sulfóxido de dimetilo. Congelar MEFs em alíquotas para posterior utilização. Nota: Como alternativa, use typ selvageme MEFs primárias; No entanto, um vector lentiviral expressando rtTA adicional necessita de ser transduzidas juntamente com os outros vectores lentivirais (por exemplo, utilizando o plasmídeo FUdeltaGW-rtTA descrito por Maherali et al. 9). </li><li> Preparação de meio TS MEF-condicionado Nota: Antes de experiências de conversão, MEF-condicionado (CM) TS mídia tem que estar preparado, o que é necessário para subcultura de linhas ITSC individuais (descritos na secção 6). <ol><li> Placa 1 x 10 7 MEFs mitoticamente inactivadas por mm prato 150 em meio MEF no número desejado de pratos. Inactivar MEFs por irradiação com raios γ com uma dose de 9 Gy. Nota: O rendimento per mm prato 150 é de aproximadamente 60 ml de CM. </li><li> No dia após o plaqueamento, aspirado e descartar forma MEF e adicionar 20 ml de meio TS preparadas de fresco (sem FGF4 / heparina) em cada prato de MEFs e pratos lugar mitoticamente inactivados de volta na incubadora a 37 ° C. </li><li> após incubaçãomeio TS durante três dias em MEFs mitoticamente inactivadas, recolher meio em tubos de 50 ml cônico. Filtrar através de um filtro de 0,2 um e prosseguir com 2.6.4. Substitua CM com 20 ml de meio TS fresco para a preparação de um lote adicional de CM. Nota: mitoticamente inactivadas MEFs pode ser utilizado para a preparação CM até três vezes. </li><li> Aliquota de 35 ml de CM filtrado para tubos de 50 mL cónicos e armazenar a -20 ° C até serem necessários. Após descongelação, adicionar 15 ml de meio TS preparado de fresco, a fim de obter 70% de TS-CM e armazenar a 4 ° C durante até um mês. </li></ol></li></ol> 3. Lentivirus Vector Produção em células 293T Nota: Todos os passos são realizados no espaço de laboratório licenciado para o Nível de Biossegurança 2. <ol><li> Antes de experiências de conversão, prepare lentivirais para a doxiciclina (DOX) dependentes sobre-expressão de Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2 e mCherry. Para cada um lentivírus, as células 293T co-transfectar utilizando orespectivo vector de transferência de lentivírus em conjunto com um plasmídeo de empacotamento e um VSV-G plasmídeo que expressa o envelope (para informações plasmídeo referem-se à Tabela Materiais). Nota: Para obter informações úteis sobre a produção de vírus referem-se a Gavrilescu et al 10.. Embora ele descreve a produção de retrovírus, os comentários gerais a respeito da qualidade das células 293T e DNA plasmídeo são verdadeiras para a produção de lentivírus também. CUIDADO: medidas de segurança apropriadas devem ser tomadas, quando se trabalha com vetores de lentivírus e trabalho tem de ser realizado numa instalação de Nível de Biossegurança 2. </li><li> Revestimento cinco placas de 100 mm com solução cobrindo os pratos com 5 ml de solução e agitação ligeira para distribuir uniformemente solução de revestimento de poli-L-lisina (100 ug / ml). Colocar as cápsulas de volta na incubadora a 37 ° C durante 30 min. Após a solução de revestimento aspirado 30 min e lavar pratos uma vez com PBS. </li><li> Placa 7 x 10 6 293T células por placa em 10 ml de meio de células 293T, sWirl pratos para distribuir uniformemente as células e pratos lugar de volta na incubadora a 37 ° C. </li><li> Na manhã seguinte, substituir o meio de crescimento com 5 ml de meio de transfecção. Adicionar 6 ul de uma solução de estoque 1.000x cloroquina (25 mM) e pratos lugar de volta na incubadora a 37 ° C. </li><li> Enquanto isso, prepare mistura de transfecção: <ol><li> Para cada vector lentiviral preparar dois tubos de 5 ml de reacção, identificado como A e B. </li><li> Adicionar 600 ul de solução salina tamponada com HEPES 2x (HBS) ao tubo A. </li><li> No tubo de mistura B 61,5 ul solução de CaCl 2 (2 M), com 18,5 ug de ADN lentivector e 9,25 ug psPAX2 e 9,25 ug de pMD2.G. Ajustar o volume para 600 mL com a cultura estéril grau de H 2 O. </li><li> Adicionar solução de tubo B gota a gota tubo A, enquanto vórtex. Incubar mistura de transfecção durante 15 min à TA. </li></ol></li><li> Adicione a mistura de transfecção com muito cuidado, gota a gota às células 293T preparados na placa de 100 mm. UMAepois de 5 a 6 hr remover o meio e substituir por 10 ml de meio de produção de vírus. Coloque pratos de volta na incubadora a 37 ° C. Nota: Tenha cuidado ao remover e substituir médio vez que as células 293T facilmente destacar do prato. mudança de meio 5-6 h após a transfecção é crucial, uma vez que a exposição prolongada à cloroquina é tóxico para as células. </li><li> Na manhã seguinte, remova cuidadosamente e elimine médio e substituir com 7 ml de meio virus-produção. </li><li> Na manhã seguinte, colher o primeiro lote de meio contendo vírus. Aspirar médio e recolher em um tubo de 15 ml. Mais uma vez, adicionar 7 ml de meio de produção de vírus para as células. Loja vírus contendo meio no frigorífico até que o segundo lote é colhido no dia seguinte. </li><li> Na manhã seguinte, aspirar o segundo lote de meio contendo vírus adicionando-o ao tubo de 15 ml contendo o primeiro lote. células 293T pode agora ser descartada. Filtro contendo vírus do meio através de um sur 0,45acetato de celulose livre de factant filtro -membrane. Aliquota filtrada, meio e armazenar a -80 ° C para posterior utilização contendo vírus. Nota: A produção de vírus também pode ser realizado em placas de 6 poços. Reduza volumes e números de celulares em conformidade. </li></ol> 4. Fibroblasto Transdução com 4 fatores e mCherry controle vetorial Nota: Todos os passos são realizados numa instalação de segurança biológica Nível 2. <ol><li> Para uma representação esquemática do delineamento experimental referem à Figura 1. Descongelar uma alíquota dos primários rtTA-MEFs e placa 3,33 x 10 5 células por poço de um prato de 6 poços, num volume total de 2 ml de meio de MEF. Preparar pelo menos 3 poços e rotulá-los com 4 fatores (4F), mCherry e controle. Nota: Em alternativa, MEFs de tipo selvagem pode ser utilizado, quando um vector lentiviral expressando rtTA é adicionado ao cocktail lentivector durante o passo 4.2. </li><li> No dia seguinte, depois que as células totalmente recuperado da cryopreconservação, substituição de suportes MEF nas três-6 poços com 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) e 1 ml (controlo) de meios de transdução, respectivamente. Descongelar uma alíquota de PLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, -ets e vírus -mCherry à temperatura ambiente e adicionar 100 ml de cada sobrenadante contendo vírus (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) no 4F bem. Nota: Em caso de MEFs de tipo selvagem, reduzir o volume dos meios de comunicação preplated por 100 mL e, adicionalmente, adicione 100 ml de vírus FUdeltaGW-rtTA contendo sobrenadante à mistura 4F. </li><li> Adicionar 100 ul de mCherry meio contendo vírus para o bem marcado com mCherry. Adicionar polibreno a uma concentração final de 8 ug / mL em cada poço. Colocar o prato de volta na incubadora a 37 ° C e incubar MEFs O / N com o sobrenadante que contém o vírus. Nota: Em caso de MEFs de tipo selvagem, reduzir o volume de meio por 100 ul preplated e, adicionalmente, adicionar 100 ul de FUdeltaGW-rtTA sobrenadante contendo vírus. </li><li> Na manhã seguinte, retire cuidadosamentee meios contendo vírus lavar três vezes com 2 ml de PBS. Finalmente, adicione 2 ml de meio TS (sem FGF4 / heparina). Nota: MEFs transduzidas podem ser utilizadas directamente para ensaios de indução ITSC ou congeladas para utilização posterior. </li></ol> 5. Fibroblasto a conversão ITSC Nota: Todos os passos são realizados no espaço de laboratório licenciado para o Nível de Biossegurança 2. <ol><li> Lavar MEFs transduzidas duas vezes com 2 ml de PBS e após a adição de 0,5 ml de solução de tripsina / EDTA a incubar-los no incubador durante 3-4 min. Verificar sob um microscópio invertido para o desprendimento adequado das células. <ol><li> Inativar a tripsina, adicionando 1 ml de meio TS. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifugar durante 3 min a 200 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 ml de meio TS. Use a amostra de controlo não transduzidas para contar as células. </li><li> Placa 4F-MEFs, mCherry-MEFs e MEFs controlo não transduzidas cada um a uma densidade de 2 x 10 5células por prato de cultura de células de 100 mm de 10 ml TS meio contendo 2 ug / ml de DOX (TS meio + FGF4 / heparina + DOX). </li><li> Como alternativa, executar transdiferenciação em pratos menores. Placa 3,6 x 10 3 células por cm 2 sobre o tamanho do prato desejado, o volume de escala em conformidade. </li></ol></li><li> No dia seguinte, utilizando um microscópio de epifluorescência (usando uma lente de 10X e um filtro adequado para excitação de fluorescência vermelha) monitorizar a expressão da proteína mCherry, a fim de estimar a eficácia de transdução. Nota: eficiência de transdução deve ser perto de 100%. Se o aumento da morte celular é aparente após a indução do transgene, isto significa que o título do vírus era demasiado elevada. Transdução deverá ser repetido com uma quantidade reduzida de meio contendo vírus. </li><li> De agora em diante media mudança em todos os pratos em dias alternados até o dia 10 após o plaqueamento. Em seguida, alimentar as células com meio sem DOX TS (TS meio + FGF4 / heparina). </li><li> Usando um monitor de microscópio invertidoaparecimento de &#39;transdifferentiated áreas&#39; (consulte a Figura 2B e C) em 4F prato por até 3 semanas. Tais colônias não deve ser visível nos dois pratos de controle (mCherry-MEFs e MEFs não transduzidas). </li></ol> 6. Isolamento de individuais ITSC Lines Nota: Para a etapa 6.3 um capuz de cultura de tecidos não é necessária. Recomenda-se limpar o microscópio invertido com 70% de etanol para minimizar as chances de contaminação bacteriana. colónias ITSC individuais podem ser isolados entre os dias 21 e 28 dias de transdiferenciação. <ol><li> Adicionar 40 ul de solução de tripsina / EDTA a 0,05% em 12 cavidades de uma placa de 96 poços de fundo em U e colocar o prato em gelo. </li><li> Antes de isolamento colónia, médio aspirado em 4F-MEF prato transdiferenciação. Lave as células uma vez com 10 ml de PBS. Mais uma vez, adicione 10 ml PBS e colocar prato sob um microscópio invertido. </li><li> Usando uma pipeta de 100 uL-ajustado para 40 ul elevador colónias individuais, por circling-los com a ponta da pipeta e aspirando a colônia flutuante. Transferir as células de uma colónia em cada um bem do preparado prato de 96 poços. Depois de pegar 12 colónias colocar prato de 96 poços na incubadora a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Separar as células por pipetagem para cima e para baixo várias vezes e suspensão de células de transferência para um poço de um prato de 24 poços com preparados 500 uL de meio TS-CM (30% fresco TS meio + 70% + CM FGF4 / heparina). </li><li> No dia seguinte, substituir o meio com meio TS-CM fresco para remover as células mortas. Mudança de meio todos os outros dias. </li><li> Monitor para o aparecimento de colônias epiteliais com limites claros (veja a Figura 2). Uma vez colônias aparecer, cultura até 70% confluentes ou por até uma semana e expandir gradualmente em pratos maiores. A partir de agora, células de cultura como bona fide TSCs, de acordo com protocolos padrão em meio de soro contendo ou em, meios definidos isentos de soro 3,5,11. </li></ol>

<ol><li>Cambuli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+of+the+first+cell+fate+decision+prevents+complete+ES+cell+reprogramming+into+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+commun%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast.</a> Nat commun. 5, 5538(2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Induction+of+Trophoblast+Stem+Cells+from+Murine+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).</li>
<li>Benchetrit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Nuclear+Reprogramming+Underlies+Lineage+Conversion+into+Functional+Trophoblast+Stem-like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanaka%2C+S+%22Science%22">Science</a>. 282 (5396), 2072-2075 (1998).</li>
<li>Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+mouse+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+TGF-beta%2Factivin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin.</a> Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).</li>
<li>Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+Oct-4+blocks+progenitor-cell+differentiation+and+causes+dysplasia+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues.</a> Cell. 121 (3), 465-477 (2005).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. (10), e550(2007).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+Maintenance+of+Murine+Trophoblast+Stem+Cells+under+Defined+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions.</a> Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo de transdiferenciação baseado 4 fator (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) aqui apresentado oferece um método confiável para gerar fielmente convertido iTSCs de fibroblastos de rato embrionárias. Além disso, o método é também aplicável para os fibroblastos da cauda de pós-natal, apesar de com uma queda na eficácia em comparação com os fibroblastos embrionários 3. Em geral, a qualidade de fibroblastos primários é um fator crítico de resultado transdiferenciação e deve ser tomado cuidado de usar células pas...

Recentemente, um estudo comparando várias abordagens de células-tronco embrionárias mouse para Trophoblast conversão de células-tronco revelou que em todos os sistemas analisados, a conversão da linhagem permaneceu incompleto. Em vez de células estaminais induzidas trofoblasto (iTSCs) chamados haste trofoblasto células semelhantes a células foram gerados reter uma memória do destino celular de origem 1. Aqui, seguimos uma abordagem diferente da geração de ITSC. Semelhante à indução directa de células estaminais pluripotentes a partir de fibroblastos embrionários de murídeo (MEFs) 2, iTSCs foram convertidos directamente a partir de tecido somático diferenciada. Em primeiro lugar, foram identificados 12 fatores candidatos indutores TSC destino quando overexpressed em MEFs. Mais tarde, os fatores Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 foram identificados como sendo necessária e suficiente para a indução ITSC 3. Simultaneamente, outro grupo verificou independentemente Tfap2c, GATA3 e Eomes ser suficiente para converter em MEFs iTSCs. No entanto, nesseestudo, o tempo necessário para a expressão do transgene é consideravelmente mais longa em comparação com o nosso estudo, indicando diferentes cinéticas de conversão, quando ETS2 está ausente do cocktail transdiferenciação 4. Soro fetal convencional de bovino (FBS) contendo a cultura de células estaminais trofoblásticas blastocisto derivado induzidas e baseia-se na presença de factores segregados por MEFs inactivado pelo crescimento 5,6. Durante a indução ITSC, esses fatores são fornecidos por MEFs, que não têm a combinação cheia de transgenes e não são submetidos a transdiferenciação. No entanto, uma vez ITSC colónias individuais são sub-cultivadas, que exigem meios de comunicação, o qual foi pré-condicionada por MEFs inactivado pelo crescimento. A partir daí, iTSCs podem ser cultivadas e tratadas como blastocisto TSCs derivado de acordo com protocolos padrão. É de notar, em contraste com Tanaka et al. 5, que rotineiramente cultura CET e gelatinizar iTSCs sem pratos de cultura de células.

<table><tbody><tr><td>Hidrato de doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-10G</td><td>Dissolva em PBS estéril, prepare 2 mg / ml de solução estoque. Armazene alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Sal de difosfato de cloroquina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td>Prepare a solução estoque de 25 mM em água estéril para cultura de células. Armazene alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Polibreno (brometo de hexadimerina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Prepare a solução-mãe de 8 mg/ml em água estéril para cultura de células. Armazene alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>humano recombinante Fator de Crescimento de Fibroblastos 4</td><td>ReliaTech</td><td>300-131L</td><td>Dissolver em estéril 0,1% BSA em PBS, preparar 25 &micro; g/ml de solução-mãe. Armazene alíquotas em -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Sal de heparina sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>Prepare 1 mg / ml de solução estoque dissolvendo em PBS estéril. Armazene alíquotas a -80&deg; C</td></tr><tr><td>ProFection Sistema de Transfecção de Mamíferos</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>PBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1419-094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, sem glutamina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03IR</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de membrana de acetato de celulose sem surfactante</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos</td> <td>não essenciaisThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-24</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO), grau de cultura de células</td><td>Panreac AppliChem GmbH</td><td>A3672,0100</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Tfap2c</td><td>Addgene</td><td>70269</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Gata3</td><td>Addgene</td><td>70270</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Eomes</td><td>Addgene</td><td>70271</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Ets2</td><td>Addgene</td><td>70272</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-mCherry</td><td>Addgene</td><td>70273</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19780</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm1 (rtTA * M2) Jae / J 7</td> <td>JAX Ratos</td><td>6965</td><td></td></tr><tr><td>129S2SV</td><td>Charles River</td><td>129</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

células-tronco trofoblasto (CET) surgem como consequência da primeira decisão destino celular no desenvolvimento dos mamíferos. Eles podem ser cultivadas in vitro, conservando a capacidade de auto-renovação e de se diferenciar em todos os subtipos da linhagem trofoblasto, equivalente ao in vivo haste população de células que dá origem à porção fetal da placenta. Portanto, TSCs oferecer um modelo único para estudar o desenvolvimento da placenta e embrionárias contra decisão destino celular extra-embrionário in vitro. Desde a fase de blastocisto em diante, uma barreira epigenética distinto constituído por metilação do DNA e histonas modificações firmemente separa as duas linhagens. Aqui, descrevemos um protocolo para superar totalmente essa barreira linhagem pela transitória sobre-expressão de trofoblastos reguladores chave Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 em fibroblastos embrionárias de ratinho. As células-tronco induzidas trofoblastos são capazes de auto-renovação e são quase idênticas às blastocisto células-tronco trofoblasto derivados in termos de morfologia, expressão do gene marcador e padrão de metilação. Funcional in vitro e em ensaios in vivo confirmam que estas células são capazes de se diferenciar ao longo da linhagem trofoblasto gerar células trofoblásticas gigantes poliplóide e chimerizing a placenta quando injectadas em blastocistos. A indução de células estaminais a partir de tecido somático trofoblasto abre novas vias para estudar as características genéticas e epigenética desta linhagem extra-embrionárias e oferece a possibilidade de gerar linhas de células estaminais trofoblasto sem destruir o respectivo embrião.

No prato onde a expressão do transgene do 4F é activado, as células mudam rapidamente morfologia (comparar a Figura 2A e B). Por volta do dia 14 - 21 transdifferentiated áreas distintas emergem (dois exemplos são apresentados na Figura 2B e C). Estas colónias primárias não possuem morfologia típica TSC; No entanto, uma vez que são sub-cultivadas, a morfologia característica epitelial com bordas apertadas e limites brilhantes altamente reminiscentes dos C...

Aqui apresentamos um protocolo para a conversão direta de fibroblastos embrionários murinos em células-tronco trofoblásticas totalmente funcionais e estáveis por meio da superexpressão de dez dias de Tfap2c, Gata3, Eomes e Ets2.

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar células-tronco de trofoblasto induzidas autênticas, ou iTSCs, a partir de fibroblastos murinos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo das células-tronco sobre a natureza da barreira que separa a linhagem embrionária da linhagem extraembrionária. A principal vantagem desta técnica é que a expressão transgênica é ativada apenas de forma transitória, facilitando a seleção de células estavelmente convertidas.Em um laboratório de nível biosseguro dois utilizando os equipamentos de proteção individual apropriados, cubra cinco placas de 100 mililitros com cinco mililitros de solução de poli-L-lisina, movimentando suavemente as placas para distribuir uniformemente a solução de revestimento. Coloque as placas em uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos, em seguida aspire a poli-L-lisina e lave as placas uma vez com PBS. Em seguida, plaque sete vezes 10 à sexta células 293 T por placa em 10 mililitros de meio para células 293 T, gire suavemente as placas para distribuir as células de maneira uniforme e devolva as placas à incubadora.Na manhã seguinte, substitua o meio de crescimento por cinco mililitros de meio de transfeção. Em seguida, trate as culturas com seis microlitros de uma solução estoque de cloroquina 1000X e coloque as placas de volta no incubador a 37 graus Celsius. Para preparar a mistura de transfeção, adicione, para cada vetor lentiviral, 600 microlitros da solução de DNA Lentivector gota a gota em 600 microlitros de solução salina tamponada com HEPES 2X sob agitação em vórtex e incube a mistura de transfeção à temperatura ambiente.Após 15 minutos, adicione cuidadosamente a mistura gota a gota às células 293 T preparadas e retorne as placas ao incubador. Após cinco a seis horas, substitua o meio por 10 mililitros de meio de produção de vírus e coloque as placas de volta no incubador. Na manhã seguinte, substitua cuidadosamente o meio por sete mililitros de meio fresco de produção de vírus para outra incubação noturna.Em seguida, transfira o meio de cada placa para tubos cónicos individuais de 15 mililitros e adicione sete mililitros de meio fresco de produção de vírus às placas para uma nova incubação durante a noite. Na manhã seguinte, colete o segundo lote do meio contendo o vírus, reunindo o sobrenadante com o primeiro lote de vírus e filtre o meio contendo o vírus através de um filtro de membrana de acetato de celulose livre de surfactante de 0,45 mícron para armazenamento em alíquotas de 500 microlitros a menos 80. Para converter os fibroblastos em células-tronco trofoblásticas induzidas, lave os fibroblastos embrionários transduzidos ou MEFs duas vezes com dois mililitros de PBS.Em seguida, desprenda as células com 0,5 mililitros de solução de Tripsina-EDTA a 37 graus Celsius. Após três a quatro minutos, confirme que as células se descolaram da placa em um microscópio invertido e, então, ative a Tripsina com um mililitro de meio TS. Transfira as suspensões celulares para tubos cónicos individuais de 15 mililitros e centrifugue as células.Em seguida, re-suspenda os pellets em dois mililitros de meio TS e plaque duas vezes 10 à quinta potência de MEFs mCherry com quatro fatores ou MEFs controle não transduzidos por placa de 100 mililitros em 10 mililitros de meio TS contendo fator de crescimento de fibroblastos quatro e heparina suplementado com doxiciclina para cultura noturna. No dia seguinte, sob um microscópio de epifluorescência, utilize a expressão da proteína mCherry para estimar a eficiência de transdução. Se a eficiência de transdução for de aproximadamente 100%, retorne as culturas ao incubador, trocando o meio em todas as placas a cada dois dias até o dia 10.Posteriormente, alimente as células com meio TS fresco contendo fator de crescimento de fibroblastos quatro e heparina, sem doxiciclina, utilizando o microscópio invertido para monitorar o aparecimento de áreas transdiferenciadas na placa com os quatro fatores por até três semanas. A identificação das áreas transdiferenciadas é fundamental, pois, neste momento, os MEFs não se assemelham morfologicamente a células-tronco de trofoblasto. Procure por colônias densamente empilhadas adjacentes às células gigantes de trofoblasto, que são identificadas pelo seu tamanho celular e núcleo grande.Para isolar linhagens individuais de iTSCs, primeiro limpe o microscópio invertido com etanol 70% para minimizar a chance de contaminação bacteriana. Em seguida, adicione 40 microlitros de Tripsina 0,5% EDTA em 12 poços de uma placa de fundo em U de 96 poços e coloque a placa no gelo. Agora aspire o meio do prato de transdiferenciação de MEF com os quatro fatores e lave as células uma vez com 10 mililitros de PBS.Após a lavagem, adicione 10 mililitros de PBS fresco às células e coloque a placa sobre a platina do microscópio invertido. Usando uma pipeta de 100 microlitros ajustada para 40 microlitros, contorne cada colônia individual com a ponteira da pipeta e aspire a colônia resultante em suspensão. Transfira cada colônia para poços individuais da placa de 96 poços até que 12 colônias tenham sido coletadas.Em seguida, incubar as colônias a 37 graus Celsius por cinco minutos. Ao final da incubação, dissociar as células por pipetagem e transferir as suspensões celulares para poços individuais de uma placa de 24 poços contendo 500 microlitros de meio TS completo mais fator de crescimento de fibroblastos e heparina para cultura noturna. No dia seguinte, substituir o meio por meio fresco de TS completo mais fator de crescimento de fibroblastos e heparina para remover as células mortas e devolver a placa ao incubador.Monitorar diariamente as culturas quanto ao aparecimento de colônias epiteliais com bordas brilhantes. Quando as colônias forem observadas, cultivar as células por até uma semana ou até que atinjam 70% de confluência. Em culturas onde a expressão do transgene dos quatro fatores é ativada, as células mudam rapidamente a morfologia.Por volta dos dias 14 a 21, surgem áreas distintas de transdiferenciação. Essas colônias primárias não possuem a morfologia típica de células-tronco de trofoblasto, entretanto, após serem subcultivadas, observa-se uma morfologia epitelial característica com bordas definidas e limites brilhantes, altamente semelhante à de células-tronco de trofoblasto autênticas. Quando as células-tronco de trofoblasto induzidas por quatro fatores permanecem positivas para o fator de transcrição de trofoblasto Cdx2 e Tfap2c, a ideia dessas linhagens pode ser utilizada para análises subsequentes in vitro ou in vivo.Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em seis semanas se for realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como a injeção assistida por blastócito, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre o potencial de quimerização dos iTSCs gerados. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de segregação precoce de linhagens explorarem a conversão do destino celular embrionário versus extraembrionário em camundongos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como converter diretamente fibroblastos embrionários novos em células-tronco de trofoblasto induzidas. Não se esqueça de que o trabalho com vetores lentivirais pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de procedimentos apropriados de nível de biossegurança dois, devem sempre ser seguidas.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de blastocistos mouse ea derivação de células-tronco de blastocistos trofoblasto. Descrevemos também condições para a manutenção da propriedade de célula-tronco, bem como a indução de diferenciação em cultura.

Derivação de células-tronco do rato trofoblasto de blastocistos

A qualidade de fibroblastos embrionários (MEFs) é ditada pela estirpe direito de rato tal como CF-1. Pluripotência-MEFs apoio e meios condicionados (CM), obtida a partir destes deve conter concentrações ótimas de Activin A, Gremlin e TGF-p1 necessários para a Activin / Nodal e vias FGF para co-operatório manter a auto-renovação e pluripotência.

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

Descrevemos um protocolo para derivar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos livres de fatores reprogramadas e caracterizadas baseadas em lentivirais e conversão em condições putativas de grau clínico.

Derivação e Caracterização de um free-Transgene Human Induced Pluripotent Stem Cell Line e Conversão em Definidas condições clínicas de grau

O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

Neste estudo, geramos células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células de líquido amniótico de camundongo, usando um sistema de transposon baseado em não vírus.

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando proteína morfogênica óssea 4 e inibidores das vias Activina/Nodal. Este método é adequado para a diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas e pode gerar grandes quantidades de células para manipulação genética.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a geração e quantificação de diversos subtipos cardíacos reprogramados usando uma entrega mediada por retrovírus de Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Aqui apresentamos nosso protocolo para produzir induzido eritroide progenitores (iEPs) de fibroblastos adulto de rato usando orientada por factor de transcrição direta linhagem reprogramação (DLR).

Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

Aqui, descrevemos um método para aquecer blastocistos humanos vitrificados, culminando-os através do período de implantação in vitro, digerindo-os em células únicas e coletando células trophoblastas precoces para uma investigação mais aprofundada.

Coleção celular única de células trophoblastos em embriões humanos de estágio de peri-implantação

Este protocolo descreve uma técnica para avaliar alterações na vasculatura materna durante a gravidez em camundongos. Usando métodos estereológicos, o remodelamento das artérias espirais deciduais é avaliado quantitativamente e os resultados confirmados qualitativamente por imuno-histoquímica.

Avaliação do Maternal Vascular Reformas durante a gravidez no mouse Útero

Aprenda a converter fibroblastos embrionários murinos em células-tronco trofoblásticas induzidas usando expressão transgênica temporária de fatores de transcrição. Este método permite estudar a diferenciação celular e desenvolvimento placentário.

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

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