Name: Preparação de Núcleos de tecido parafina-encaixados formalina-fixados para RNA e DNA Extraction (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a extrair RNA e DNA de núcleos de tecido fixado em formalina e embebido em parafina. Este método melhora os rendimentos de ácidos nucleicos de regiões específicas em amostras de câncer de próstata arquivadas.

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Esta pesquisa foi apoiada por uma doação da equipe da Movember/Prostate Cancer Canada para JMSB, DMB, PCP e JL, e pelo Instituto de Pesquisa do Câncer de Ontário (JMSB, DMB e PCP) e Passeio de Motocicleta para o Pai Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).

1. Tissue Coring <ol><li> Comente a lâmina de microscópio e delinear a região (s) de interesse usando um marcador permanente de ponta fina. Cortar uma seção do filme de parafina suficientemente grande para cobrir a região de interesse sobre a lâmina de microscópio. Coloque filme firmemente no slide e enrole filme sobre arestas para manter o filme de escorregar. Usando um marcador permanente de ponta fina, o contorno do tecido inteiro e região (s) de interesse dentro do tecido, mantendo o toque esboço - mas fora - a região (s). </li><li> Retire o filme e transferi-lo para o bloco de tecido correspondente. Orientar o filme por invertendo ou girando-a de modo que o contorno de todo o tecido observado corresponde à forma do tecido no bloco (Figura 1). Pressionar a secção de película firmemente à superfície do bloco, para impedir o escorregamento. </li><li> Com a ponta do marcador permanente, fazer entalhes rasos mas visíveis (~ 0,2 milímetros) ao longo do contorno da região (s) de noteresse, em seguida, retire o filme. Carga de 1 ml de lixívia, 70% de etanol, e água em 1,5 ou 2,0 ml tubos de microcentrífuga separados. </li><li> Limpe o perfurador receptor (vermelho) do perfurador 0,6 milímetros definir deslizando o soco para cima e para baixo várias vezes enquanto a ponta está submerso na água sanitária tubo contendo. Repetir o passo anterior com 70% de etanol e, em seguida, água (crítica para assegurar que branqueador é removido). </li><li> Pressionar o perfurador para dentro do tecido, no interior da região de interesse para uma profundidade de 3 mm e retirar o soco. Solte o núcleo em uma ligação de tubo de 1,5 ou 2 ml, empurrando-o para fora do soco com a caneta baixa. Armazenar os núcleos a -20 ° C (a longo prazo) ou 4 ° C para utilização a curto prazo. </li><li> Limpe o soco acordo com o passo 1.4 e continue com as próximas regiões ou amostra. </li></ol> 2. Desparafinar os núcleos de tecido FFPE <ol><li> desparafinização Carryout em 1,5 ou tubos de 2 ml pela adição de 1 ml de xileno ao núcleo tecido e vortex vigorosamente durante 10 sec. Ele umT durante 3 min a 50 ° C. </li><li> Centrifugar durante 2 minutos à temperatura ambiente (RT) e a velocidade máxima (21130 xg) e o tubo de colocar em gelo durante 5 min (permite o resíduo ceroso a solidificar no topo). </li><li> Remova cuidadosamente a parafina acumulada em torno de menisco com sobrenadante utilizando uma ponta de pipeta e repita o tratamento xileno (passos 2,1-2,2). </li><li> Adicionar 1 ml de etanol (100%) e agitar vigorosamente em vórtice durante 10 seg. Centrifugar durante 2 minutos à temperatura ambiente (velocidade máxima), e rejeitar cuidadosamente o etanol. Repita o passo anterior uma vez. </li></ol> 3. A homogeneização dos núcleos desparafinadas <ol><li> Ressuspender os núcleos em 700 uL de etanol (100%) antes da homogeneização. Usando um homogeneizador de tecido motorizado, moer os núcleos em partículas de tecidos finos (~ 1 min no ajuste médio). Limpe a sonda homogeneizador entre cada amostra para minimizar carry-over contaminação. <ol><li> Encher tubos de 15 ml com ~ 10 ml de lixívia, solução de neutralização de RNase e 70% de etanol. Após homo amostrahomoge-, lava-se a sonda homogeneizador em cada uma das soluções de limpeza, na ordem indicada acima. Executar o homogeneizador de velocidade mais elevada durante a fase de lavagem. </li><li> Limpe a sonda com o tecido e permitir que sonda para secar completamente antes de homogeneizar a amostra seguinte. Inspecione visualmente as lâminas de sonda para pedaços de tecido residual. Se encontrado, limpe a sonda novamente. Mudar as soluções de limpeza (lixívia, etanol, solução de RNase e de neutralização) por dia. </li></ol></li><li> Após homogeneização, trazer o volume da amostra de 1 ml pela adição de mais etanol a 100% (~ 300 mL). Centrifugar a uma velocidade máxima durante 15 min, aspirar cuidadosamente o etanol e o sedimento seca do ar durante aproximadamente 15-20 minutos antes de prosseguir com a extração de RNA. </li></ol> 4. A digestão com proteinase K <ol><li> Ressuspender o sedimento em 150 ul de proteinase K e tampão de digestão tubo de filme para soltar o sedimento. Adicionar 10 ml de proteinase temperatura estável K e misture por um movimento súbito (nãovortex o tubo). Incubar o conteúdo do tubo, a 56 ° C durante 15 min com agitação suave. </li><li> Permitir tubo a incubar em gelo durante 3 min. completo arrefecimento é importante para a precipitação eficiente no passo seguinte. Centrifugar durante 15 minutos à velocidade máxima. </li></ol> 5. RNA separado do DNA <ol><li> Transferir cuidadosamente o sobrenadante, sem perturbar o sedimento, para um novo 1,5 ml de purificação de ARN. </li><li> Manter o pellet para a purificação de DNA (pelete pode ser armazenada durante 2 h à RT, durante até 1 dia a 2-8 ° C, ou por períodos mais longos à temperatura de -20 ° C). </li></ol> 6. RNA Purificação <ol><li> Incubar o sobrenadante contendo o ARN a 80 ° C durante 15 minutos (não exceder este tempo). Em seguida, o tubo de Centrifugar brevemente para recolher gotas de dentro da tampa. </li><li> Adicionar 320 ul de tampão RLT para ajustar as condições de ligação, e misture por pipetagem. Em seguida, adicione 720 etanol ul (100%) e vortex. </li><li> transferência 600 ul da amostra, incluindo qualquer precipitado que se possa ter formado, a coluna de spin de ARN (fornecido no kit) colocada num tubo de recolha de 2 ml e anular o conteúdo remanescente. Centrifugar por 15 segundos a ≥8,000 xg, descartar o flow-through e reutilizar o tubo de coleta. </li><li> Transferência restante amostra numa coluna, incluindo as gotículas que podem ter acumulado na tampa do tubo de centrífuga, de 15 segundos a ≥8,000 xg, e descartar o fluxo de passagem. </li><li> Adicionar 350 mL de buffer FRN à coluna de centrifugação e centrifugar por 15 segundos a ≥8,000 xg, descartar o flow-through e reutilizar tubo de coleta. </li><li> Misturar suavemente 10 ul da solução de ADNase I, com 70 ul de tampão de RDD, adicionar directamente para a membrana da coluna de spin, e incubar à TA durante 15 min. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de FRN para a coluna de centrifugação, centrifugar durante 15 segundos a ≥8,000 xg e guardar o fluxo de passagem para uso no passo seguinte. Para melhorar a recuperação de pequenos RNAs, coloque a coluna de rotação em umnovo tubo de recolha de 2 mL e aplicar o fluxo através do passo anterior para a coluna de centrifugação. </li><li> Centrifugar por 15 segundos a ≥8,000 xg, descartar o flow-through e reutilizar o tubo de coleta no passo seguinte. Adicionar 500 ul de tampão de RPE para a coluna de centrifugação e centrifugar durante 15 segundos a ≥8,000 xg, descartar o fluxo de passagem e reutilizar o tubo de recolha no passo seguinte. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de RPE para a coluna de centrifugação e centrifugar durante 15 segundos a ≥8,000 xg e rejeitar o tubo de recolha com o fluxo de passagem. </li><li> Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml, abrir a tampa e de centrifugação à velocidade máxima durante 5 min. Rejeitar o tubo de recolha com o fluxo de passagem. </li><li> Colocar a coluna de centrifugação numa nova recolha de 1,5 ml, adicionar 20 ul de água isenta de RNase directamente para a membrana da coluna de spin, e incuba-se o tubo durante 1 min à temperatura ambiente. Centrifugar a uma velocidade máxima durante 1 min para eluir o ARN. Armazenar a amostra de ARN eluído a -80 ° C. </li></ol><ol><li> Ressuspender o sedimento obtido da extracção de RNA por adição gradual de 45 ul de tampão de proteinase K (400 mM de Tris 7,5, NaCl 400 mM, MgCl2 3 mM, 4% de SDS); 45 ul de H2O; e 400? g de alta potência proteinase K. </li><li> Incubar a solução acima referida a 56 ° C durante 24 h (recomendado) ou durante a noite. Performincubation a 90 ° C durante 2 h sem agitação e centrifugar brevemente o tubo de microcentrífuga para recolher gotas de dentro da tampa. </li><li> Deixar a amostra arrefecer até à temperatura ambiente e, em seguida, adicionar 4 mL de RNase A (100 mg / ml). Incubar a amostra durante 2 minutos à TA. </li><li> Adicionar 200 ul de tampão AL à amostra, e misture bem em vórtice. Em seguida, adicione 200 mL de etanol 100% e misturar bem em vórtice. Transfira a totalidade da amostra para a coluna fornecida rotação, no lugar de um tubo de recolha de 2 ml e centrifugar durante 1 min a ≥8,000 x g. </li><li> Descarte o tubo de coleta com oflow-through e colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml. Adicionar 700 mL de buffer AW1 à coluna de centrifugação, centrifugar por 15 segundos a ≥8,000 xg, descartar o flow-through e reutilizar o tubo de coleta. </li><li> Adicionar 700 mL de buffer AW2 à coluna de centrifugação, centrifugar por 15 segundos a ≥8,000 xg, descartar o flow-through e reutilizar o tubo de coleta. Em seguida, adicionar 700 ul de etanol a 100% para a coluna de centrifugação, centrifugar durante 15 segundos a ≥8,000 xg e rejeitar o tubo de recolha com o fluxo de passagem. </li><li> Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml, abrir a tampa da coluna de centrifugação, e centrifugação à velocidade máxima durante 5 min. Rejeitar o tubo de recolha com o fluxo de passagem. </li><li> Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 1,5 ml e adicionar 25 ul de água isenta de nuclease aquecida (50 ° C). Incubar coluna e o tubo a 50 ° C durante 10 min. Centrifugar durante 1 minuto à velocidade máxima, adicionar 25 ul de água isenta de nuclease (RT) para a coluna e incubar durante1 min a RT. </li><li> Centrifugar durante 1 minuto à velocidade máxima (21130 xg) e colheita de fluxo contendo ADN genómico (aproximadamente 50 ul de ADN total). Armazenar a coluna à temperatura de -20 ° C (no caso de outro eluição é necessária mais tarde). </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Para a extracção bem sucedida de DNA e RNA a partir de regiões de tecido de interesse, de descaroçamento precisas é crítica. Este protocolo descreve a utilização de um punção de tecidos para isolar núcleos de 0,6 mm de diâmetro e descreve o processo de transferência de lâminas de microscópio notações para blocos FFPET correspondente. Modificações com o protocolo do fabricante foram necessária para extrair eficientemente os ácidos nucleicos a partir de núcleos, que são cerca de 50 vezes mais espessas do que as secções de micrótomo para que o protocolo foi pretendidos. Uma vez que os núcleos podem conter mais de cera de parafina em relação a cortes de tecido, desparafinização eficaz de núcleos através de passos xileno e tratamento de etanol repetidas foram necessários. O sucesso das etapas de pós-desparafinização dependia adequada mecânica núcleos de tecido homogeneização e proteinase eficiente digestão K. Além disso optimização da digestão com proteinase K pode ser realizado. Vale ressaltar que este método identiFIES áreas de interesse sobre a superfície do bloco, tal como identificadas em lâminas de histopatologia correspondente. Como o tecido colheitas principais que podem ser de 3 ou 4 mm de profundidade, os usuários deste protocolo pode estar preocupado com o que as células ou tecidos jazia sob a superfície do bloco. Embora esta seja uma preocupação válida, vários estudos (revistos em referência 27) demonstraram que os núcleos de tecido representam fielmente o histológica e características moleculares dos blocos de tecido patológico, especialmente quando duplicado ou triplicado núcleos são provenientes da área de interesse. À medida que o kit de extracção comercial modificado adoptada neste protocolo permite a extracção simultânea de DNA e RNA a partir do mesmo tecido, o protocolo economiza material biológico precioso e permite uma comparação directa entre os dois ácidos nucleicos resultantes da mesma amostra. extração simultânea de RNA e DNA reduz trabalho e tecido exaustão pela metade, e permite a análise integrada precisa de expr geneESSÃO, bem como características epigenética e genéticas encontradas no DNA. Uma vez que os teores de ambos ARN e ADN a partir destes núcleos de tecido representativo tipicamente superior a 600 e 300 ng, respectivamente, e uma vez que a maioria das aplicações de PCR e sequenciação próxima geração de correntes requerem tipicamente 10-100 ng, a maioria das amostras purificadas por este protocolo deve fornecer adequada material para vários ensaios a jusante. Este protocolo foi mostrado para ser reprodutível entre laboratórios independentes (Selvarajah et ai., Na Prep.). RNA a partir deste protocolo era de qualidade suficiente para a análise da expressão gênica usando RT-PCR ou uma plataforma multianalitos popular, e DNA bom desempenho em ensaios de PCR específicos de metilação. Futuros estudos que visam avaliar a utilidade de ácidos nucleicos recuperados em próxima geração seqüenciamento são garantidos. Assim, várias modificações foram feitas para um protocolo disponível no mercado, projetado para seções FFPET finas, tornando-o adequado for o co-extracção de ARN e ADN de núcleos FFPET 0,6 mm. O protocolo consistentemente demonstrado altos rendimentos em um grande grupo de amostras de câncer de próstata e em um conjunto limitado de amostras de cancros da mama, do cérebro e da bexiga. No geral, o protocolo deve permitir que os utilizadores efectuem análises baseadas em genes-alvo de grandes coleções de tecidos bem anotados. É importante ressaltar que o protocolo permite eficiente de amostragem focalizado de regiões de interesse em FFPET, relativamente poucos hands-on tempo, e os rendimentos suficientemente altos para a maioria das aplicações a jusante.

Pesquisa com biomarcadores Genomic procura identificar correlatos moleculares que precisa e confiável reflectem o estado da doença, e fazê-lo de uma forma clinicamente útil. 1 Desenvolvimento de biomarcador é dependente de análise retrospectiva de amostras de tecido bem anotados. amostras de tecidos doentes e normais são armazenadas tecido como fresco congelado em biobancos especializadas ou como tecido embebido em parafina (FFPET) bloqueia formalina-fixo em arquivos clínicos. O tecido fresco congelado permite a extracção de ácidos nucleicos de elevada qualidade e tem sido amplamente utilizado em estudos genómicos descoberta de biomarcadores 2,3. No entanto, menos amostras de tecido estão disponíveis em bancos biológicos e estudando tais tecido apresenta uma tendência para as amostras maiores, categorias incomuns da doença, e pacientes atendidos em centros especializados com maiores capacidades para o tecido banco. 4 FFPET, em contraste, é o método de armazenamento padrão para tecidos humanos e animais doentes. Enquanto blocos FFPET m manter celularorphology, o processo de fixação ligações cruzadas outros constituintes celulares para os ácidos nucleicos. ARN e ADN com ligações cruzadas são recuperáveis, mas apenas em formas degradadas, altamente fragmentados 5,6. No entanto, estes fragmentos de ADN e ARN são acessíveis à análise por uma variedade crescente de ensaios, incluindo a expressão de mRNA, a hipermetilação do ADN, e a sequência alvo. 7,8 para explorar esta possibilidade na grande quantidade e variedade de FFPET disponível para investigação, existe uma necessidade de um protocolo de extracção eficiente e fiável. Uma grande proporção de pesquisa com biomarcadores em tecidos concentra-se em câncer. Como outros tipos de tecido doente, tecido de câncer muitas vezes mostra heterogeneidade regional significativa na preservação celular e tipo de célula. Uma vez que a investigação biomarcador baseia-se na capacidade de correlacionar componentes do tecido doente com características moleculares, um passo fundamental deste processo é o de colheita precisa do tecido que é bem conservada e enriquecido para o disease em estudo. Em FFPET, duas técnicas de enriquecimento são frequentemente utilizados: captura a laser microdissecção (LCM), e secção micrótomo. LCM permite altamente focalizado de colheita de tecido e pode ser utilizado para isolar os tipos de células específicas, bem preservadas em tecidos heterogéneos. 9,10 No entanto, LCM requer equipamento caro e é proibitivamente tempo para consumir um grande número de amostras. Micrótomo de corte é um processo mais amplamente utilizado em secções finas foram cortadas de blocos FFPET. 11,12 secções micrótomo de corte muitas vezes incluem tecido que é heterogénea na preservação de células (por exemplo, vs necrótica bem preservada) e a composição (por exemplo, cancro vs parênquima benigna), e, portanto, pode levar à homogeneização de características moleculares melhores investigados separadamente. Assim, existe uma necessidade para um método de alto rendimento que enriquece para células de interesse. Um terceiro método, o isolamento de ácidos nucleicos a partir de núcleos de FFPET, fornece este enriquecimento, é adequado para alta atravhput protocolos, e tem sido utilizado por outros para isolar o ARN ou ADN a partir de núcleos de tecido separadas. 7,13,14 Um certo número de protocolos publicados especificar métodos de extracção de ácidos nucleicos a partir de FFPET (Tabela 1). No entanto, os protocolos onde RNA e DNA são extraídos do mesmo tecido foram otimizados para secções de tecido do micrótomo, mas não para núcleos de tecido. 15,16 protocolos Da mesma forma, publicados que oferecem uma maior especificidade de tecido, seja através de núcleos de tecidos ou microdissecações de slides, especifique procedimentos para a extracção do ADN, mas não ARN. 7,17 Aqui, um protocolo optimizado para extracção dupla de ambos o ADN e ARN a partir do mesmo núcleo tecido é demonstrada. núcleos de tecido são colhidas através da inserção de tissue microarray (TMA) socos em regiões de interesse mapeadas em blocos FFPET. O mapeamento é realizado por anotar uma lâmina de microscópio com uma caneta de marcador e transferir a anotação para a superfície correspondente da FFPEBloco t (Figura 1). Antes do trabalho que conduziu ao desenvolvimento da presente protocolo incluiu uma comparação dos vários sistemas de extracção de ácido nucleico disponíveis no comércio. Nesta comparação, as alterações aos protocolos comerciais, como descrito abaixo, desde os mais altos rendimentos de ADN e ARN e de qualidade (Selvarajah et ai., Na Prep). Núcleos de tecido são mais espessas do que as secções 5-10 micron uM tipicamente utilizados em protocolos de extracção FFPET 11,12,14,18 - 20, e pode conter quantidades mais variáveis ​​de parafina. Para compensar esta situação, desparafinização foi melhorada por repetição de xileno e etanol tratamentos e através da introdução de um passo de homogeneização motorizado (Figura 1). Além disso, os tempos de digestão com proteinase K foram alongada para aumentar o rendimento de ADN. No geral, este protocolo é rentável e possibilita o estabelecimento de ligações entre as características moleculares e histopatológicos da doença em large, populações bem caracterizadas. O protocolo em sua totalidade pode ser realizada de forma confiável dentro de 2 dias, incluindo 3 horas de hands-on tempo, com pouca necessidade de equipamento especializado ou caro. O protocolo passo-a-passo é seguir como uma versão modificada do protocolo do fabricante. 21 Por favor, consulte a Tabela de materiais / equipamentos de reagentes específicos, equipamentos e fabricantes.

<table><tbody><tr><td>Filme plástico parafina, "Parafilm 'M'"</td><td>Bemis&nbsp;</td><td>RK-06720-40</td><td>Qualquer filme de parafina genérico funcionará como substituto</td></tr><tr><td>Hipoclorito de Sódio, "Ultra Bleach"</td> <td>Da mesma forma</td><td>53-2879-2</td><td>Qualquer alvejante genérico funcionará como substituto. Material perigoso que pode causar queimaduras em contato.</td></tr><tr><td>Grau de biologia molecular absoluto etanol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2818-500</td><td>Sigma-Aldrich E7023 é suficiente como substituto</td></tr><tr><td>Grau Molecular H2O</td><td>G-Biosciences</td><td>786-293</td><td>Sigma W4502 é suficiente, bem como qualquer outra marca de grau molecular H2O</td></tr><tr><td>0.6 mm Conjunto de Punções para Beecher Instruments&nbsp;</td><td>Estigen</td><td>MPO6[Amarelo]</td><td>Certifique-se de usar o perfurador receptor vermelho do conjunto</td></tr><tr><td>Marcador permanente de ponta fina</td><td>Sharpie</td><td>10365796S</td><td>Usar o marcador em tecidos FFPE faz com que ele seque rapidamente, então vários podem ser necessários</td></tr><tr><td>Bloco</td><td></td><td></td><td></td>de tecido FFPE</tr><tr><td>Lâmina de tecido manchado correspondente ao bloco</td><td></td><td></td><td></td>FFPE</tr><tr><td>Tubos de Micro-Centrífuga de 1,5 ml</td><td>Fisher BioReagents</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de baixa ligação de 2,0 ml (Tubos de Microcentrífuga LoBind)</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de baixa ligação de 1,5 ml (Tubos de Microcentrífuga LoBind)</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Histology Xylene</td><td>VWR</td><td>CA 95057-822</td><td>Fisher Scientific X5-500 é suficiente como substituto</td></tr><tr><td>Biologia Molecular Grau 2-Propanol</td><td>Sigma</td><td>Kit de</td> DNA/RNA AllPrep AllPrep FFPE&nbsp; I9516 <td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td>Prepare tampões de acordo com o AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21</td></tr><tr><td>Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, solução DNaseI</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td>Prepare tampões de acordo com o AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21</td></tr><tr><td>Proteinase estável em temperatura K</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K de alta potência</td><td>Invitrogen</td><td>25530-049</td><td>Invitrogen 25530-015 é suficiente como</td></tr><tr><td>uma solução neutralizante de RNAse substituta (Rnase AWAY)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA 100 mg/ml</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>BD Integra Seringa 3 ml 21G x 1/2</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>305274</tr><tr><td>Homogeneizador de tecidos motorizado (TissueRuptor)</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>9001271</td><td>Fisher Scientific 14-261-29 é suficiente como substituto-20</td></tr> <tr><td>&deg; C e -80 &deg; C Freezer de Laboratório &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Centrífuga com rotor para tubos</td><td></td><td></td><td></td>de 2 ml</tr><tr><td>Misturador</td><td></td><td></td><td></td>Digital Vortex</tr><tr><td>Pipetas e pontas</td><td></td><td></td><td></td>de filtro</tr><tr><td>Blocos de aquecimento ou banhos de água Cloridrato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de Tris&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0234</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0241</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio Anidro</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Sigma</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa Acrodisc 25 mm com 0,45 &#181; m Supor membrana</td><td>Pall</td><td>PN 4614</td><td></td></tr><tr><td>Seringa com agulha retrátil BD PrecisionGlide 3 ml</td><td>BD Integra</td><td>305274</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Clorídrico</td><td>BDH</td><td>3026</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de expressão gênica multianalita (nCounter &reg; Conjunto de códigos CAE e plataforma Nanostring nCounter)</td><td>Plataforma Nanostring nCounter,</td> quantificação de ácido nucleico fluorométrico Nanostring <td></td><td></td></tr><tr><td>(Qubit dsDNA HS Assay Kit e Qubit&reg; Kit de ensaio de RNA BR)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de núcleos de tecido parafina-encaixados formalina-fixados para rna e dna extraction

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

O tecido embebido em parafina fixado em formalina (FFPET) representa um substrato valioso e bem anotado para investigações moleculares. A utilidade do FFPET na análise molecular é complicada tanto pela composição heterogênea do tecido quanto pelos baixos rendimentos na extração de ácidos nucléicos. Uma pesquisa bibliográfica revelou uma escassez de protocolos abordando essas questões, e nenhum que mostrasse um método validado para extração simultânea de RNA e DNA de regiões de interesse em FFPET. Este método aborda ambos os problemas. A especificidade do tecido foi alcançada mapeando áreas de interesse do câncer em lâminas de microscópio e transferindo anotações para blocos FFPET. Os núcleos de tecido foram colhidos de áreas de interesse usando punções de microarray de 0,6 mm. A extração de ácido nucleico foi realizada usando um sistema comercial de extração FFPET, com modificações nas etapas de homogeneização, desparafinização e digestão da proteinase K para melhorar a digestão do tecido e aumentar a produção de ácido nucleico. O protocolo modificado produz quantidade e qualidade suficientes de ácidos nucléicos para uso em várias análises downstream, incluindo uma plataforma de expressão gênica multi-analito, bem como análise de PCR em tempo real acoplada à transcriptase reversa da expressão de mRNA e análise de PCR específica de metilação (MSP) da metilação do DNA.

Este protocolo representa um método otimizado para a recuperação de DNA e RNA de núcleos de tecido, utilizando modificações de um sistema de extracção comercial projetado para secções de tecido. Optimização incluiu a introdução de homogeneização de tecidos, a utilização de mais potente proteinase K para a extracção do ADN, e extensão do tempo de digestão de tecido. Gráficos e análises estatísticas incluído 2-way ANOVA, regressão linear e correlação. Otimizações de Proteinase Digestão O kit comercial incluiu uma solução estável de proteinase K à temperatura ambiente, que foi substituído com um mais potente de proteinase K, resultando num rendimento de DNA mais elevada (Figura 2A). Para aumentar ainda mais o rendimento de ADN, digestão foi estendido de 2 a 24 horas. Não foram observadas diferenças significativas entre os dois pontos de tempo, mas a digestão 24 hr pareceu oferecer rendimentos mais consistentes em samples. No entanto, a incubação adicional de 48 horas não se melhorar ainda mais a recuperação de ADN (Figura 2B; p = 0,74). A recuperação de DNA típica de Amostras de Tecido FFPE do cancro da próstata Usando o protocolo optimizado, RNA e DNA foram co-extraído de amostras FFPET cancro da próstata 333 que variam de 3 a 14 anos de idade da amostra. De cada amostra, 3 núcleos de tecido (volume de tecido total médio de 0,95 ± 0,13 mm3) foram utilizados como entrada. Embora existam outros métodos baseados em electroforese em gel de microfluidos, que pode estimar concentrações e proporcionam avaliações da distribuição do tamanho das moléculas de ácidos nucleicos, tais métodos não fornecem reprodutível ácidos nucleicos quantificação, e não pode distinguir entre ARN e ADN como ensaios baseados em flourometrically fazer. 22 E, porque microfluídicos com base resultados de electroforese em gel não são confiáveis ​​para fragmentadaácidos nucleicos derivados de FFPET, 23 rendimentos de ácidos nucleicos foram medidos fluorometricamente (ver lista de reagentes para detalhes). O rendimento médio foi de 2270 ng de ARN e 820 ng de ADN (Figura 3A). Aproximadamente 90% de todas as amostras FFPET analisados ​​neste estudo produziu ≥100 ng de ADN e ≥ 500 ng de ARN. Curiosamente, não houve correlação significativa entre a idade da amostra FFPET e a recuperação do ácido nucleico (Figura 3B). Em geral, os rendimentos de DNA e RNA foram correlacionados em todas as amostras (R 2 = 0,39; p &lt;0,0001), apesar de mais do que duas vezes mais ARN de ADN foi recuperado a partir de cada amostra (Figura 3C). Enquanto o piloto e otimização trabalho foi realizado em tecidos da próstata, o próximo passo foi investigar o desempenho deste protocolo sobre alguns tipos adicionais de tecido de arquivo. Começando com cirurgicamente removidos e as amostras de autópsia FFPET ser representandofígado benignos (uma amostra a partir de um caso), cancros do cérebro (8 amostras a partir de um caso), bexiga urinária (2 amostras de 2 casos), e mama (3 amostras de 3 casos), o protocolo produziu&gt; 100 ng de DNA e RNA a partir de 90% das amostras (Figura 3D). Enquanto os rendimentos de ácidos nucleicos foram menores em tecidos de autópsia do que em tecidos cirúrgicos, resultados representativos indicam que o protocolo produz rendimentos semelhantes em toda cancros derivados de diferentes sites. Avaliação de RNA e DNA Integridade e seu desempenho Representante na Análise Downstream A análise de 47 genes em 8 amostras de cancro da próstata FFPET seleccionados e um PC-3 de amostra de linha celular de cancro da próstata fresco (como um controlo positivo) expressão do RNA foi realizada utilizando uma plataforma de expressão do gene multianalitos comercial, que é optimizada para FFPET. As contagens de ARNm em PC3 foram tipicamente mais elevados do que os de sa FFPETmples (Figura 4A). No entanto, comparando a expressão relativa de todos os genes, as amostras de cancro da próstata FFPET mostrou perfis de expressão semelhantes a ARN PC-3, o que indica que ambas as fontes de ARN são adequados para o perfil de expressão de ARN. Para demonstrar o desempenho de DNA genômico extraído com este protocolo, extratos de DNA bissulfito-convertido a partir de amostras FFPET foram amplificados por metilação PCR específico (MSP). 24 A análise MSP da ALU elementos repetitivos, regiões altamente metilados presentes em milhões de cópias no genoma humano, 25 foi usada como um controle de metilação do genoma, e espera-se que mostram variações mínimas entre as amostras. Como mostrado na Figura 4B, houve pouca ou nenhuma variação observada entre amostras diferentes em níveis de metilação ALU MSP. Além disso, os ensaios com base em MSP de GSTP1, um gene conhecidos a ser hipermetilado em cancro da próstata, mas não em amostras benignas, 26 não mostrou nenhum amplif detectávelications no DNA a partir de amostras benignas. Tal como esperado, mais baixos valores de limiar de ciclo qPCR foram detectados em DNA de tecidos de cancro, indicando enriquecimento de cópias GSTP1 metilados. O utilitário de ácidos nucleicos recuperados por este protocolo foi adicionalmente testada em ensaios típicos a jusante, utilizando ácidos nucleicos recuperados a partir de fígado benigno e de um cérebro (post-mortem) e a partir de duas amostras de cancro da mama removidos cirurgicamente. Ambos expressão com base e MSP ensaios de RT-qPCR um bom desempenho em cancro da mama e FFPET fígado, mas o ensaio de RT-PCR não conseguiram amplificar um ARNm altamente expresso a partir da amostra de tumor cerebral post-mortem (Figura 4C), sugerindo que o RNA tinha degradado, provavelmente devido à fixação do tecido atrasado. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54299/54299fig1.jpg" /> Figura 1:. Visão geral do processo de extracção de amostras FFPET A figura ilustra como uma área de interesse em umbloco de tecido é mapeado com base na seleção histopatológico de uma lâmina de microscópio. Três núcleos de tecido de 0,6 mm são então obtidos a partir de cada área de tecido usando socos biópsia, homogeneizada em conjunto e, em seguida, submetido a extração de RNA e DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54299/54299fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54299/54299fig2.jpg" /> Figura 2: Ácidos Nucleicos (DNA e RNA) rendimentos em ng / mm 3 de FFPET de dois Proteinase K (temperatura estável e de alta potência enzimas), e testado em uma série de Incubação vezes para o último (A) Desempenho de Proteinase K. de diferentes fornecedores. extracções de ADN foram realizadas em uma amostra representativa utilizando FFPET temperatura enzima estável fornecido com o K-lo contra uma enzima mais potente de outro fabricante. (B) determinar o tempo de incubação óptimo proteinase K para maximizar o rendimento de ADN. Desempenho de alta concentração digestão com proteinase K foi avaliado em três diferentes períodos de incubação utilizando 3 amostras FFPET. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54299/54299fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54299/54299fig3.jpg" /> Figura 3:., Nucleic Acids (ADN e ARN) os rendimentos em ng / mm 3 de FFPET no total, ao longo dos anos de exemplo e tipos de tecidos representativos (A) total recuperado ácidos nucleicos a partir de tecido embebido em parafina e fixado em formalina. As quantidades de ácidos nucleicos apresentadas baseiam-se nas extracções de 333 amostras FFPET ucantar o protocolo optimizado. (B) curva de correlação entre o DNA e RNA total recuperada e a idade das amostras FFPET. As amostras FFPET extraídos utilizados foram obtidos a partir dos anos de 2000 a 2012. (C) Correlação entre os rendimentos de DNA simultaneamente extraído e RNA a partir de 333 amostras de próstata. Existe uma correlação positiva entre o DNA e RNA rendimentos. (D) Demonstração do protocolo utilizando outros tipos de tecido de arquivamento. O protocolo optimizado foi usado para extrair os ácidos nucleicos a partir de 14 de cancro (mama, da bexiga e do cérebro) e as amostras normais (fígado). As barras de erro representam SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54299/54299fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54299/54299fig4.jpg" /> Figura 4: Desempenho de ARN e ADN extraído de Co-Teciduale núcleos em aplicações a jusante. (A) mRNA conta para tecidos de câncer de próstata FFPE e para o controle de linha de células frescas PC-3. Cada ponto representa a média de 3 repetições técnicas extraídos separadamente. valores de ARN fresca linha de células PC-3 são ilustrados por barras amarelas e valores de tecido FFPET são representados por pontos coloridos. Os ensaios de PCR específicos (B) de metilação no DNA de amostras de cancro da próstata FFPET. valores limiares do ciclo foram obtidos para 10 amostras realizadas como esperado utilizando 50 ng / reacção de ADN convertido com bissulfito. ALU ensaios MSP de todas as amostras FFPET teve limiares ciclo semelhantes (p&gt; 0,67). Os ensaios de MSP de GSTP1 metilação apresentaram maior (menor limiar de ciclo) níveis no cancro da próstata do que na próstata benigna. (C) Avaliação da qualidade do DNA e RNA a partir de tipos de tecidos adicionais. Os ensaios de expressão de gene de metilação do gene HPRT1 e Alu foram realizados em ácidos nucleicos (RNA e DNA, respectivamente) extraídos nemfígado mal (autópsia) e cerebrais (autópsia) e de mama (todos FFPET). Os resultados da próstata são mostrados para comparação. Nota: Foram observados resultados semelhantes a partir de cada tipo de tecido, excepto para a amplificação de ARNm de uma amostra falhou autópsia. Cada ponto ou barra representa uma amostra, e barras de erro representam SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54299/54299fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="12"> Cores de tecido </td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> Entrada de tecido (mm3) </td><td rowspan="2"> Extraído Ácido Nucleico </td><td colspan="2"> Validação </td><td colspan="3"> verificação de qualidade: DNA </td><td colspan="4"> verificação de qualidade: RNA </td></tr><tr><td> (# De amostras) </td><td> Age of Sample (anos) </td><td> Rendimento total (ng) </td><td> O tamanho dos fragmentos (pb) </td><html><td> PCR </td><td> Rendimento total (ng) </td><td> O tamanho dos fragmentos (pb) </td><td> PCR </td><td> NanoString </td></tr><tr><td> Pikor et ai. </td><td> 43-129 </td><td> DNA </td><td> Não existem dados </td><td> Não existem dados </td><td> Não existem dados </td><td> Não existem dados </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Montaser-Kouhsari et ai. </td><td> 18-29,5 </td><td> RNA </td><td> 763 </td><td> 0-25 </td><td></td><td></td><td></td><td> 843 </td><td> Não existem dados </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Este papel </td><td> 1,71 </td><td> ADN e ARN </td><td> &gt; 350 </td><td> 3-12 </td><td> 820 </td><td> 100 - 500 </td><td><img alt="Traço" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td> 2270 </td><td> 100-500 </td><td><img alt="Traço" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td>/ftp_upload/54299/check_mark.jpg &quot;/&gt; </td></tr><tr><td colspan="12"> As secções de tecido </td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> Entrada Tissue </td><td rowspan="2"> Extraído Ácido Nucleico </td><td colspan="2"> Validação </td><td colspan="3"> verificação de qualidade: DNA </td><td colspan="4"> verificação de qualidade: RNA </td></tr><tr><td> (# De amostras) </td><td> Age of Sample (anos) </td><td> Rendimento total (ng) </td><td> O tamanho dos fragmentos (pb) </td><td> PCR </td><td> Rendimento total (ng) </td><td> O tamanho dos fragmentos (pb) </td><td> PCR </td><td> NanoString </td></tr><tr><td> Heikal et ai. </td><td> 5 x 5 mm </td><td> DNA </td><td> 12 </td><td> 7-22 </td><td> 88-300 </td><td> 103-351 </td><td><img alt="Traço" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chung et ai. </td><td> 1 x 20 hum </td><td> RNA </td><td> 9 </td><td> &gt; 5 </td><td></td><td></td><td></td><td> 16.000 23.000 </td><td> 100-200 </td><td><img alt="Traço" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td> Antica et al. </td><td> 2 x 4 mm </td><td> RNA </td><td> 18 </td><td> Não existem dados </td><td></td><td></td><td></td><td> Desconhecido (621 ng / mL) </td><td> 80-202 + </td><td><img alt="Traço" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td> Ghatak et ai. </td><td> 5 x 5 mm </td><td> ADN e ARN </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 14 256 </td><td> &lt;1030 </td><td><img alt="Traço" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td> 16 000 </td><td> 109-400 + </td><td><img alt="Traço" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td> Hennig et ai. </td><td> 1 x 10 ^ M </td><td> ADN e ARN </td><td> 210 </td><td> 1-25 </td><td> Não existem dados </td><td> Não existem dados </td><td><img alt="Traço" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td> Não existem dados </td><td> Não existem dados </td><td><img alt="Traço" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td colspan="12"> Microdissecção Captura Laser </td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> Entrada de tecido (mm2) </td><td rowspan="2"> Extraído Ácido Nucleico </td><td colspan="2"> Validação </td><td colspan="3"> verificação de qualidade: DNA </td><td colspan="4"> verificação de qualidade: RNA </td></tr><tr><td> (# De amostras) </td><td> Age of Sample (anos) </td><td> Rendimento total (ng) </td><td> O tamanho dos fragmentos (pb) </td><td> PCR </td><td> Rendimento total (ng) </td><td> O tamanho dos fragmentos (pb) </td><td> PCR </td><td> NanoString </td></tr&gt; <tr><td> Snow et ai. </td><td> 1-2 </td><td> DNA </td><td> 110 </td><td> 0-2 </td><td> 430 </td><td> Não existem dados </td><td><img alt="Traço" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Uma comparação de protocolos de DNA e de extração de RNA publicadas para núcleos de tecidos, cortes e microdissecações captura a laser Também estão incluídos vários terminais moleculares avaliação destes métodos usando ensaios de PCR e Nanostring.

Este protocolo de extracção modificado melhora RNA e DNA rendimentos provenientes de regiões mais precisamente alvo de interesse nos blocos de tecido histopatológicos.

Preparação de Núcleos de tecido parafina-encaixados formalina-fixados para RNA e DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

O objetivo geral deste procedimento é extrair sequencialmente RNA e DNA de cortes de tecido emblocados em parafina e fixados em formalina, provenientes de acervos. Este é um protocolo para coletar cortes de tecido dos quais extrairemos tanto RNA quanto DNA. A principal vantagem deste protocolo é que ele melhora os rendimentos de RNA e DNA de regiões precisamente direcionadas no bloco de tecido.Este procedimento é amplamente desenvolvido em tecidos arquivados de câncer de próstata. Também pode ser aplicado a outros tipos de tecidos arquivados. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos de extração de núcleos de tecido não são comumente utilizados em laboratórios de pesquisa.A maioria dos laboratórios de pesquisa utiliza cortes transversais, o que esgota os tecidos mais rapidamente e adiciona uma heterogeneidade significativa à amostra. Comece examinando a lâmina do microscópio e delimitando a região de interesse usando uma caneta permanente de ponta fina. Em seguida, corte um pedaço de filme de parafina grande o suficiente para cobrir a região de interesse na lâmina do microscópio.Em seguida, coloque firmemente o filme sobre a lâmina, envolvendo as bordas do filme para evitar que escorregue. Usando uma caneta permanente de ponta fina, contorne todo o tecido e a região de interesse dentro do tecido. A seguir, remova o filme da lâmina e transfira-o para o bloco de tecido correspondente.Oriente o filme girando-o ou rotacionando-o de modo que o contorno de todo o tecido corresponda à forma observada do tecido no bloco. Pressione firmemente a parte do filme contra a superfície do bloco para evitar deslizamento. Usando a ponta da caneta permanente, faça pequenas reentrâncias rasas, porém visíveis, ao longo do contorno da região de interesse e, em seguida, remova o filme.Em seguida, limpe o furo receptor do conjunto de furos de 0,6 milímetro submergindo a ponta em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo um mililitro de água sanitária e movimentando o furo para cima e para baixo várias vezes. Repita a lavagem com o tubo contendo etanol a 70 por cento e, em seguida, com água. Agora, pressione o furo limpo na região de interesse até uma profundidade de três milímetros e retire-o.Libere o núcleo em um tubo microcêntrifugo de baixa ligação empurrando-o para fora do punch com o estilete. Adicione um mililitro de xileno aos tubos microcêntrifugos contendo os núcleos de tecido e vortexe vigorosamente por dez segundos. Em seguida, coloque-os em um bloco térmico ajustado a 50 graus Celsius por três minutos.Após a incubação, centrifugue por dois minutos à temperatura ambiente em velocidade máxima. Após a centrifugação, coloque os fragmentos sobre gelo por cinco minutos para solidificar o resíduo ceroso. Agora, remova cuidadosamente a parafina que se acumulou ao redor do menisco juntamente com o sobrenadante, utilizando a ponteira de uma pipeta.Em seguida, repita o tratamento com xilol. Após remover a mistura de parafina e xilol, adicione um mililitro de etanol a 100% e vortexie vigorosamente por dez segundos. Após centrifugar em velocidade máxima por dois minutos, descarte cuidadosamente o etanol.Repita a lavagem com etanol mais uma vez antes de iniciar a homogeneização. Re-suspenda os fragmentos desparafinizados em 700 microlitros de etanol a 100 por cento antes da homogeneização. Utilize um homogeneizador de tecidos motorizado em velocidade média para triturar os fragmentos em partículas finas.É necessária uma homogeneização completa dos fragmentos de tecido para obter um rendimento ideal de DNA e RNA. Em seguida, encha tubos separados de 15 mililitros com aproximadamente dez mililitros de água sanitária, solução neutralizante de RNase e etanol a 70 por cento. Após a homogeneização da amostra, lave a sonda do homogeneizador em cada uma das soluções de limpeza, em ordem.Execute o homogeneizador na velocidade mais alta durante a etapa de lavagem. Limpe a sonda com um lenço de papel e deixe-a secar completamente antes de homogeneizar a próxima amostra. Inspeccione visualmente as lâminas da sonda em busca de resíduos de tecido e, se encontrados, limpe a sonda novamente.Após a homogeneização, complete o volume da amostra até um mililitro com etanol a 100%, em seguida centrifugue em velocidade máxima por 15 minutos. Aspire cuidadosamente o etanol e seque os pellets ao ar por aproximadamente 15 a 20 minutos antes de iniciar a extração com proteinase K. Re-suspenda os pellets em 150 microlitros de tampão de digestão com proteinase K e agite suavemente os tubos para soltar o pellet.Recomenda-se a digestão com proteinase K durante a noite para maior recuperação de DNA. Adicione 10 microlitros de proteinase K termoestável e misture agitando suavemente. Incube a 56 graus Celsius por 15 minutos com agitação suave.Incube os tubos no gelo durante três minutos. Após o resfriamento, centrifugue o tubo por 15 minutos em velocidade máxima. Em seguida, sem perturbar os pellets, transfira cuidadosamente cada sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga para purificação de RNA.Extraia RNA e DNA utilizando o procedimento otimizado no protocolo escrito, que inclui um tempo prolongado de digestão do tecido para a extração de DNA. RNA e DNA podem ser recuperados de amostras mais antigas de tecido fixado em formalina e emblocado em parafina usando este método. Ácidos nucleicos foram coextraídos de amostras de câncer de próstata com idade variando de três a catorze anos.O rendimento médio foi de 2.270 nanogramas de RNA e 820 nanogramas de DNA. Curiosamente, não houve correlação significativa entre a idade da amostra tecidual e a recuperação de ácidos nucleicos. No geral, os rendimentos de RNA e DNA foram correlacionados entre as amostras, embora na maioria dos casos mais do que o dobro de RNA tenha sido recuperado em relação ao DNA.Para demonstrar o desempenho do DNA genômico extraído com este protocolo, extratos de DNA convertidos por bisulfito provenientes de amostras arquivadas de câncer de próstata foram amplificados por PCR específica de metilação. Elementos repetitivos ALU foram utilizados como controle de metilação e mostraram pouca variação entre as amostras. GSTP1, um gene conhecido por ser hipermetilado no câncer de próstata, não apresentou amplificação detectável por PCR específica de metilação quando o DNA extraído de amostras benignas foi utilizado.Amostras de DNA de pacientes com câncer de próstata agressivo exibiram valores de ciclo limiar de QPCR detectáveis que foram menores do que aqueles de células de câncer de próstata indolente, indicando aumento da metilação de GSTP1 no câncer de próstata agressivo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro horas para RNA, e após digestão noturna, em quatro horas para DNA, se for realizada corretamente. Esta técnica deverá permitir que pesquisadores em patologia molecular explorem biomarcadores diagnósticos de DNA e RNA em uma variedade de cânceres.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar núcleos de tecido para a extração de DNA e RNA de áreas de interesse precisamente mapeadas em blocos de tecido arquivados.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

Este protocolo descreve a preparação de amostras tumorais fixadas em formalina e embebidas em parafina que são usadas para preservar amostras de tecido e citologia de câncer de pulmão de células não pequenas...

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