Preparação de Núcleos de tecido parafina-encaixados formalina-fixados para RNA e DNA Extraction

O objetivo geral deste procedimento é extrair sequencialmente RNA e DNA de núcleos de tecido fixados em formalina e embebidos em parafina. Este é um protocolo para colheita de núcleos de tecido dos quais extrairemos RNA e DNA. A principal vantagem deste protocolo é que ele melhora os rendimentos de RNA e DNA de regiões precisamente direcionadas no bloco de tecido.

Este procedimento é amplamente desenvolvido em tecidos de arquivo de câncer de próstata. Também pode ser aplicado a outros tipos de tecidos de arquivo. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de retirada do núcleo do tecido não são comumente usadas em laboratórios de pesquisa.

A maioria dos laboratórios de pesquisa usa seções transversais, o que esgota os tecidos mais rapidamente e adiciona heterogeneidade significativa à amostra. Comece revisando a lâmina do microscópio e delineando a região de interesse usando um marcador permanente de ponta fina. Em seguida, corte uma seção de filme de parafina grande o suficiente para cobrir a região de interesse na lâmina do microscópio.

Em seguida, coloque o filme firmemente na lâmina, enrolando-o nas bordas para evitar que escorregue. Usando um marcador permanente de ponta fina, contorne todo o tecido e a região de interesse dentro do tecido. Em seguida, remova o filme da lâmina e transfira-o para o bloco de tecido correspondente.

Oriente o filme virando-o ou girando-o de modo que o contorno de todo o tecido corresponda à forma observada do tecido no bloco. Pressione a seção do filme firmemente na superfície do bloco para evitar deslizamento. Usando a ponta do marcador permanente, faça recortes superficiais, mas visíveis, ao longo do contorno da região de interesse e, em seguida, remova o filme.

Em seguida, limpe o punção do receptor do conjunto de punção de 0,6 milímetro submergindo a ponta em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo um mililitro de alvejante e deslizando o punção para cima e para baixo várias vezes. Repita a lavagem com o tubo contendo 70% de etanol e depois água. Agora pressione o punção limpo na região de interesse a uma profundidade de três milímetros e retire.

Solte o núcleo em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação, empurrando-o para fora do punção com a caneta. Adicione um mililitro de xileno aos tubos de microcentrífuga contendo os núcleos de tecido e vortex vigorosamente por dez segundos. Em seguida, coloque em um bloco de calor ajustado para 50 graus Celsius por três minutos.

Após a incubação, centrifugue durante dois minutos à temperatura ambiente à velocidade máxima. Após a centrifugação, coloque os núcleos no gelo por cinco minutos para solidificar o resíduo ceroso. Agora, remova cuidadosamente a parafina que se acumulou ao redor do menisco junto com o sobrenadante usando uma ponta de pipeta.

Em seguida, repita o tratamento com xileno. Depois de remover a mistura de parafina xileno, adicione um mililitro de etanol 100% e vortex vigorosamente por dez segundos. Após centrifugar na velocidade máxima durante dois minutos, rejeitar cuidadosamente o etanol.

Repetir a lavagem com etanol mais uma vez antes de iniciar a homogeneização. Ressuspenda os núcleos desparafinizados em 700 microlitros de etanol 100% antes da homogeneização. Use um homogeneizador de tecidos motorizado em uma configuração média para moer os núcleos em partículas finas.

A homogeneização completa dos núcleos de tecido é necessária para o rendimento ideal de DNA e RNA. Em seguida, encha tubos separados de 15 mililitros com aproximadamente dez mililitros de alvejante, solução neutralizante de RNase e etanol a 70%. Após a homogeneização da amostra, lave a sonda homogeneizadora em cada uma das soluções de limpeza em ordem.

Execute o homogeneizador na velocidade mais alta durante a fase de lavagem. Limpe a sonda com um lenço de papel e deixe-a secar completamente antes de homogeneizar a próxima amostra. Inspecione visualmente as lâminas da sonda em busca de pedaços de tecido residual e, se encontrados, limpe a sonda novamente.

Após a homogeneização, leve o volume da amostra a um mililitro com etanol a 100% e centrifugue na velocidade máxima por 15 minutos. Aspire cuidadosamente o etanol e seque os pellets ao ar por aproximadamente 15 a 20 minutos antes de iniciar a extração da proteinase K. Ressuspenda os pellets em 150 microlitros de tampão de digestão de proteinase K e agite os tubos para soltar o pellet.

A digestão noturna da proteinase K é recomendada para maior recuperação do DNA. Adicione 10 microlitros de proteinase K estável à temperatura e misture agitando. Incube a 56 graus Celsius por 15 minutos com agitação leve.

Incube os tubos no gelo por três minutos. Após o resfriamento, centrifugue o tubo por 15 minutos na velocidade máxima. Em seguida, sem perturbar os pellets, transfira cuidadosamente cada sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga para purificação do RNA.

Extraia RNA e DNA usando o procedimento otimizado no protocolo escrito, que inclui um tempo de digestão de tecido estendido para extração de DNA. O RNA e o DNA podem ser recuperados de amostras de tecido mais antigas fixadas em formalina e embebidas em parafina usando este método. Os ácidos nucléicos foram coextraídos de amostras de câncer de próstata variando de três a 14 anos na idade da amostra.

O rendimento médio foi de 2.270 nanogramas de RNA e 820 nanogramas de DNA. Curiosamente, não houve correlação significativa entre a idade da amostra de tecido e a recuperação do ácido nucleico. No geral, os rendimentos de RNA e DNA foram correlacionados entre as amostras, embora na maioria dos casos, mais do que o dobro de RNA tenha sido recuperado em relação ao DNA.

Para demonstrar o desempenho do DNA genômico extraído com este protocolo, extratos de DNA convertidos em bissulfito de amostras de câncer de próstata de arquivo foram amplificados por PCR específico de metilação. Elementos repetitivos da ALU foram usados como controle de metilação e apresentaram pouca variação entre as amostras. GSTP1, um gene conhecido por ser hipermetilado no câncer de próstata, não mostrou amplificação detectável por PCR específico de metilação quando o DNA extraído de amostras benignas foi usado.

Amostras de DNA de pacientes com câncer de próstata agressivo exibiram valores de limiar de ciclo de QPCR detectáveis que eram mais baixos do que os de células de câncer de próstata indolentes, indicando aumento da metilação de GSTP1 em câncer de próstata agressivo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita dentro de três a quatro horas para o RNA e, após a digestão durante a noite, em quatro horas para o DNA, se for realizada corretamente. Essa técnica deve permitir que pesquisadores em patologia molecular explorem biomarcadores diagnósticos de DNA e RNA em uma variedade de cânceres.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar núcleos de tecido para extração de DNA e RNA de áreas de interesse mapeadas com precisão em blocos de tecido de arquivo.