Comparação de tabaco métodos de remoção de células hospedeiras de proteínas por descascamento plantas intactas ou por tratamento térmico de extratos
8 de agosto de 2016
Três métodos de precipitação de calor são apresentados de forma eficaz que remova mais do que 90% de proteínas da célula hospedeira (HCPs) a partir de tabaco extrai antes de qualquer outro passo de purificação. A planta HCPs agregar irreversivelmente a temperaturas superiores a 60 ° C.
O objetivo geral deste conjunto de experimentos é precipitar proteínas de células hospedeiras vegetais utilizando calor, facilitando assim a purificação cromatográfica subsequente de proteínas bioterapêuticas recombinantes. Este método pode ajudar a otimizar o desenvolvimento do processo e aumentar a estabilidade do produto, por exemplo, ativando proteases do hospedeiro.
A principal vantagem desta técnica é que ela é fácil de implementar em proteases existentes e pode ser rapidamente adaptada a diferentes proteínas-alvo. Demonstrará o procedimento Hannah Gruchow, uma estudante de mestrado do meu laboratório. Para precipitar termicamente as proteínas das células hospedeiras.
Por exemplo, de folhas de tabaco. Após cultivar as plantas de tabaco de acordo com o protocolo descrito no texto, prepare um banho de água com volume útil de oito litros em um balde de isopor termicamente isolado. Transfira todo o conjunto para uma placa de agitação magnética e coloque uma barra magnética no banho de água.
Em seguida, envolva o agitador magnético com uma placa de suporte não magnética, cobrindo o agitador por aproximadamente um centímetro. Sobre essa placa será colocado posteriormente um cesto de polipropileno durante o procedimento. Adicione oito litros de tampão ao banho-maria.
Em seguida, coloque um cesto de polipropileno de 23 por 23 por 23 centímetros sobre os azulejos de suporte. Certifique-se de que o suporte não interfira na rotação da barra de agitação e de que o cesto esteja completamente submerso no líquido. Em seguida, remova o cesto.
Use um termostato ajustável para aquecer o banho-maria até 70 graus Celsius. Aguarde pelo menos 15 minutos após atingir a temperatura desejada para garantir que todo o conjunto tenha alcançado o equilíbrio térmico. Em seguida, prepare alíquotas de 150 gramas das folhas de tabaco.
Coloque uma alíquota no cesto evitando compressão irreversível e danos às folhas, por exemplo, por rasgo. Mergulhe cuidadosamente, mas rapidamente, o cesto no líquido quente e coloque-o sobre os azulejos de suporte.
Em seguida, coloque um bloco de aço inoxidável sobre o cesto para evitar flutuação. Incube as folhas por cinco minutos no fluido de escaldamento. Ou selecione um tempo adequado para o delineamento experimental.
Monitore a temperatura do líquido durante todo o período de incubação. Após a incubação, remova cuidadosamente a cesta do líquido de escaldamento e deixe as folhas escorrerem por 30 segundos. Em seguida, retire as folhas da cesta, transfira-as para o liquidificador e inicie imediatamente a extração de acordo com os protocolos descritos no texto.
Para precipitar termicamente as HCPs em um recipiente com agitação. Transfira um banho-maria para uma placa de agitação magnética e coloque um recipiente de aço inoxidável de dois litros dentro do banho-maria, de modo que o centro do recipiente esteja alinhado ao centro da placa de agitação. Coloque uma barra de agitação magnética no recipiente de aço inoxidável.
Encha o recipiente com o tampão de extração. Em seguida, com água desionizada. Encha o banho-maria até cinco centímetros abaixo da borda superior do recipiente de aço inoxidável.
Use uma tampa de espuma de poliestireno para cobri-lo. Em seguida, insira um termômetro no recipiente de aço inoxidável através de um orifício na tampa. Depois, ajuste a temperatura do banho-maria para 78 graus Celsius e incube todo o conjunto por 15 minutos para atingir o equilíbrio térmico.
Quando a montagem atingir o equilíbrio, esvazie o recipiente e despeje 300 mililitros do extrato no recipiente enquanto ele ainda estiver no banho-maria e inicie o cronômetro. Agite o extrato a 150 rpm durante a incubação de cinco minutos. Certifique-se de que o extrato atinja uma temperatura de 70 graus Celsius por pelo menos dois minutos durante o período de incubação.
Após a incubação, remova o banho-maria quente do agitador magnético. Retire o recipiente de aço inoxidável e coloque-o em um balde com água gelada. Em seguida, coloque o balde sobre a placa de agitação.
Certifique-se de que o homogeneizado vegetal esteja bem agitado a 150 rpm. Coloque o termômetro no extrato e incube-o até que atinja uma temperatura de 20 graus Celsius ou a temperatura especificada. Após preparar dois banhos de água com volume de trabalho de oito litros conforme o protocolo descrito no texto, utilize água desionizada para encher o primeiro banho.
Defina o termostato em 74,5 graus Celsius e incube o conjunto por 15 minutos para atingir o equilíbrio térmico. Prepare um recipiente de armazenamento isolado colocando um béquer plástico de 0,5 litro dentro de um béquer plástico de um litro. Utilize um material isolante, como algodão hidrófilo, para preencher as lacunas.
Usando o tubo LS24, conecte o trocador de calor a uma bomba peristáltica em uma extremidade e a uma mangueira de saída na outra extremidade. Coloque ambas as extremidades dos tubos juntamente com o termômetro no recipiente de armazenamento isolado. E preencha com 300 milímetros de tampão de extração.
Em seguida, coloque o trocador de calor no banho-maria quente e inicie a bomba peristáltica a uma taxa de 300 mililitros por minuto. Após três minutos, certifique-se de que a temperatura resultante no vaso seja 70 graus Celsius. Aproximadamente 4,5 graus Celsius abaixo do ponto ajustado do banho-maria.
Descarte o tampão de extração do recipiente isolado e prepare alíquotas de 300 mililitros do extrato vegetal. Em seguida, com uma alíquota, encha o recipiente isolado. Agora, bombeie o extrato vegetal através do trocador de calor a 300 mililitros por minuto durante cinco minutos.
Em seguida, certifique-se de que a temperatura do extrato seja 70 graus Celsius após três minutos ou corresponda à temperatura definida no planejamento experimental. Após cinco minutos, transfira o trocador de calor para o banho de água gelada. Certifique-se de que a temperatura do extrato esteja abaixo de 30 graus Celsius antes de prosseguir.
Remova a mangueira de entrada conectada à bomba peristáltica do recipiente isolado. E continue bombeando para coletar o extrato vegetal precipitado por calor residual dentro do trocador de calor. Em seguida, pare a bomba.
Para realizar a filtração em bolsa do extrato vegetal, monte um filtro em bolsa no respectivo cesto de suporte acoplado à carcaça do filtro. Coloque um recipiente de um litro sob o cesto e aplique as alíquotas do extrato na bolsa a uma taxa de 150 mililitros por minuto. Após a filtração, utilize um turbidímetro para medir a turbidez de uma diluição de um para 10 do filtrado em tampão de extração.
Aliquote uma amostra de um mililitro e processe o filtrado do saco. Por exemplo, por meio de filtração em profundidade e cromatografia. Analise posteriormente a amostra de acordo com o protocolo descrito no texto.
A precipitação térmica de proteínas de células hospedeiras por escaldamento reduz a proteína solúvel total ou TSP em 96 mais ou menos um por cento. O escaldamento recuperou até 83 mais ou menos um por cento de DsRed e 51 por cento da proteína alvo Vax8. Aumentando sua pureza de 0,1 por cento para 1,2 por cento antes da separação cromatográfica.
A capacidade do filtro diminuiu em temperaturas de escaldamento superiores a 63 graus Celsius. O que pode ser resolvido pela adição de floculantes após a extração de proteínas e auxiliares de filtração após a filtração em saco. Um recipiente com agitação para precipitação térmica removeu no máximo 84 ± 1 por cento das HCPs.
Obtendo uma pureza de 0,33 ± 0,02 por cento para Vax8 e 20,2 ± 1,4 por cento para DsRed. Em contraste com o branqueamento e a configuração do trocador de calor, a precipitação de HCP em um vaso aumenta a capacidade da filtração profunda a jusante em 2,5 vezes. Isso reflete as forças de cisalhamento mais baixas no vaso em comparação com o bombeamento do extrato através do trocador de calor ou homogeneização após o branqueamento.
Aproximadamente 88,3 ± 0,7 por cento do conteúdo de HCP foi consistentemente removido do extrato utilizando um trocador de calor entre 60 e 70 graus Celsius. Alcançando uma pureza de 0,31 ± 0,01 por cento para Vax8 e 27,6 ± 2,0 por cento para DsRed.
Por fim, o trocador de calor também apresentou a menor capacidade de filtro de profundidade a jusante. Clareando apenas 13,5 ± 6,0 litros por metro quadrado antes de entupir. Uma vez dominada esta técnica, ela pode ser realizada em menos de 50 minutos mais a amostra, se for executada corretamente.
Ao tentar este método, é importante lembrar-se de garantir que a proteína-alvo seja termoestável. Após este procedimento, outros métodos como a cromatografia podem ser realizados para purificar ainda mais o produto ao nível necessário. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de plantas por meio de uma tecnologia para explorar a purificação de proteínas candidatas a vacinas e espécies de *Nicotiana*.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como precipitar proteínas de células hospedeiras de plantas utilizando escaldamento, vaso agitado ou trocador de calor.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo apresenta três métodos de precipitação térmica que removem efetivamente mais de 90% das proteínas de células hospedeiras (HCPs) de extratos de tabaco. Os métodos facilitam as etapas subsequentes de purificação de proteínas biofarmacêuticas recombinantes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biotecnologia
- Purificação de proteínas
- Desenvolvimento farmacêutico
Antecedentes
- As proteínas de células hospedeiras podem interferir na purificação de proteínas recombinantes.
- A precipitação por calor é uma técnica utilizada para remover proteínas indesejadas.
- A remoção eficaz de HCPs é crucial para a estabilidade do produto.
- Este método pode ser adaptado para diversas proteínas-alvo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para precipitar proteínas de células hospedeiras vegetais utilizando calor.
- Agilizar o desenvolvimento do processo de biofármacos recombinantes.
- Ampliar a estabilidade do produto final.
Métodos Utilizados
- Precipitação térmica de extratos de tabaco.
- Controle de temperatura para induzir agregação proteica.
- Técnicas subsequentes de purificação cromatográfica.
- Demonstração realizada por um estudante de mestrado no laboratório.
Resultados Principais
- Mais de 90% das HCPs foram removidas dos extratos.
- O tratamento térmico agrega efetivamente as HCPs vegetais acima de 60 °C.
- O método é fácil de implementar e adaptável.
- Facilitou a purificação de proteínas recombinantes.
Conclusões
- A precipitação por calor é um método viável para remoção de HCP.
- Essa técnica pode melhorar a eficiência dos processos de purificação de proteínas.
- Estudos futuros podem explorar sua aplicação a outras proteínas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A contaminação por proteínas de células hospedeiras (HCP) continua sendo um gargalo crítico na purificação de biofármacos, especialmente em sistemas de expressão baseados em plantas, onde altas concentrações de HCP prejudicam a eficiência cromatográfica. Este estudo avalia três métodos escaláveis de precipitação térmica — escaldamento de folhas intactas de tabaco, tratamento em vaso com agitação e processamento em trocador de calor — para agregar e remover seletivamente HCPs em temperaturas acima de 60 °C, melhorando assim os resultados da purificação em etapas subsequentes. Ao permitir maior pureza da proteína-alvo antes da cromatografia, essas abordagens favorecem a intensificação do processo, reduzem o consumo de tampão e aumentam a robustez geral da produção de candidatos a vacinas e proteínas terapêuticas obtidas em plantas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a avaliação funcional de proteínas-alvo mediante a redução da interferência de proteínas hospedeiras celulares no início dos fluxos de trabalho de purificação.
- Valor Operacional: Oferece um passo rápido de clarificação baseado em calor, compatível com a triagem de expressão em pequena escala em Nicotiana spp.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera extratos clarificados com redução do background de HCP, melhorando as relações sinal-ruído em imunoensaios e medições de atividade posteriores.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação do material de partida para garantir desempenho cromatográfico consistente em corridas replicadas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a produção de candidatos a vacinas, como o Vax8, com pureza aprimorada, facilitando as avaliações de imunogenicidade e segurança.
- Valor Operacional: Integra-se aos processos existentes de perfusão ou colheita em batelada sem exigir modificação genética do hospedeiro.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A precipitação por calor atua como uma operação unitária entre a colheita e a cromatografia, aplicável em fluxos de trabalho de proteínas recombinantes baseadas em plantas, desde a descoberta inicial até a geração de suprimento pré-clínico.
- Biologia de Descoberta: Reduz o ruído mediado por PCH na detecção da proteína-alvo, auxiliando o desvio mecanicista de candidatos terapêuticos.
- Triagem: Melhora a clareza e a filtrabilidade do extrato, permitindo triagem confiável de purificação em alto rendimento.
- Análises: Fornece métricas quantificáveis de redução de PCH (por exemplo, remoção de 84–96%) e ganhos de pureza (por exemplo, DsRed de 0,1% para 27,6%) para comparação de processos.
- Pesquisa Translacional: Mantém a integridade da proteína-alvo (por exemplo, Vax8, DsRed) após o tratamento, permitindo continuidade para formulação e testes de eficácia.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a diferentes sistemas de expressão vegetal e proteínas-alvo com mínima revalidação, apoiando implementação em nível de plataforma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva nos resultados de purificação por meio da redução consistente de HCP e menor entupimento cromatográfico.
- Valor Operacional: Aumenta a capacidade do filtro profundo a jusante (até 2,5 vezes maior em vaso agitado) e reduz a frequência de troca de tampão.
- Valor Estratégico: Reduz o risco de fabricação ao remover impurezas do processo precocemente, diminuindo a probabilidade de falhas em lotes nas fases finais.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos derivados de plantas ao melhorar métricas precoces de desenvolvibilidade.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em controle de processos térmicos e avaliação da estabilidade de proteínas para evitar a desnaturação do alvo.
- Depende do acesso a recipientes com controle de temperatura, trocadores de calor ou infraestrutura de escaldamento com agitação e monitoramento precisos.
- Necessita padronização do tempo, temperatura e geometria do recipiente durante o escaldamento em diferentes locais, para remoção reprodutível de HCP.
- Envolve compromissos: o escaldamento pode reduzir a capacidade do filtro, enquanto o uso de trocadores de calor apresenta desafios de limpeza, apesar da escalabilidade.
- Exige otimização empírica por meio de planejamento de experimentos, a fim de equilibrar a remoção de HCP, o rendimento do produto e a operabilidade em etapas subsequentes para cada proteína-alvo.
