Name: Determinar a supressão imune Sistema contra CNS Proteção para farmacológicos intervenções na desmielinização auto-imune (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a distinguir efeitos imunomoduladores de neuroprotetores em modelos de encefalomielite autoimune experimental usando citometria de fluxo e análise de imagem. Este método auxilia no desenvolvimento de terapias para esclerose múltipla.

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Este trabalho foi financiado pelo NINDS P30-NS069324, The National Multiple Sclerosis SocietyRG 4587-A-1, A Fundação Civitan International Research, The Mike L. Jezdimir Myelitis transversal Foundation, The University of Alabama Serviços Fundação de Saúde - Fundo Geral Endowment, The National Science Foundation 1355183, e T32 AI007051 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, Instituto Nacional de Saúde.

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Os autores não têm nada para revelar.

Os pacientes com MS continuar a ter recaídas da doença ao tomar medicamentos que atenuam a ativação de células T e / ou infiltração no sistema nervoso central, garantindo o desenvolvimento de opções de tratamento que protegem directamente o CNS. A EAE foi classicamente utilizado para modelar os sintomas da esclerose múltipla e pode ser uma ferramenta poderosa ao estudar a natureza das interacções entre o sistema imunitário e do SNC in vivo. Usando temporização de considerações de tratamento na EAE, por exemplo, antes ou após o início da doença, em conjugação com o exame infiltração imune celular no sistema nervoso central e a proliferação e activação na periferia, é possível delinear os efeitos de tratamentos em ambos os sistema imunitário e o SNC. Enquanto EAE no ratinho C57BL / 6 é mais amplamente utilizado, a EAE em ratinhos SJL pode ser mais representativo da maioria dos casos de EM, uma vez que estes ratos têm um fenótipo recorrente-remitente e infiltração de células imunitárias no parênquimado cérebro 10. SJL têm clara recuperação durante a remissão, bem como, tornando possível para começar o tratamento depois que a doença tem apresentado, mas durante os períodos de redução da inflamação. É importante considerar que os ratos SJL nem sempre recaída e remeter em sincronia, resultando em potencialmente grande variabilidade quando os resultados são agrupados. Portanto, alguns pesquisadores podem optar por mostrar resultados representativos para escores clínicos de um animal, tendo os ratos para análise FACS e histologia em pontos individualizados na progressão da doença. Considerando quando manipulações são feitos aos ratos EAE pode auxiliar na determinação de como um tratamento afecta o sistema imunitário ou do SNC. Há muitas opções para quando o tratamento começa, cada um com sua própria conotação para se células imunes entraram no CNS e como eles podem estar interagindo com o CNS. Tratamento antes do início dos sintomas implica que células do sistema imunológico ainda não entraram ou causado dano ao CNS.Tratamento após o início dos sintomas implica que as células imunes ter entrado no sistema nervoso central e ter causado algum dano. Utilizando murganhos da estirpe SJL, o tratamento pode também começar durante uma recaída, em que as células imunes são activamente infiltrante e causando inflamação, ou durante a remissão, em que as células imunes pode ser menos prevalente no SNC com menor inflamação. As hipóteses iniciais sobre como tratamentos afetam o SNC e sistema imunológico pode ser feito quando se considera que as células imunes são no processo patológico durante o tratamento. Há um certo número de maneiras em que os tratamentos podem afectar as células do sistema imunológico e o sistema nervoso central, cada um com o resultado final de reduzir a gravidade dos sintomas de EAE. Portanto, é necessário o uso de análise de citometria de fluxo e imuno-histoquímica para ver como as células imunes são afectadas na periferia e no SNC, células do sistema imunológico se ter introduzido o SNC, e como o sistema nervoso central reage ao tratamento. Enquanto a análise de citometria de fluxo da medula espinal pode determinar quantas células have entrou no SNC em um determinado momento, não se pode determinar que este efeito é devido à reduzida tráfico de células imunitárias, a menos que a proliferação de células imunes não é afectado no baço. Por conseguinte, é necessário analisar ambos os tecidos periféricos e sistema nervoso central e determinar o que resultados médios mecanicamente quando ambos os tecidos são comparados. É também possível para perfis de actividade de células imunitárias de ser alterada por tratamento, por exemplo, possuindo um interruptor em um perfil de célula T auxiliar-pesado patogénico para um perfil de célula-T reguladoras pesada. Olhando para marcadores para os diferentes tipos de células e comparando a percentagem de expressão entre os animais tratados e não tratados, por conseguinte, é também uma consideração importante. Um conceito emergente de pesquisa MS sugere que as células B desempenham um papel importante na desmielinização auto-imune. Isto baseia-se em estudos que mostram que as células B são necessárias para a reactivação das células T 20. Este conceito é apoiado pelo sucesso dos tratamentos, tais como rituximab, um anticorpo contra CD20 expressionada na superfície de células B 21,22. Como demonstrado pelo sucesso do anticorpo monoclonal ocrelizumab em ensaios clínicos, fármacos dirigidos a diferentes epitopos de CD20 pode melhorar a eficácia da terapêutica alvo de células-B 23. Uma limitação das técnicas aqui apresentados é que é possível que as células imunes para entrar no SNC, mas ser incapaz de viajar no parênquima. A imuno-histoquímica pode ser usada para detectar infiltrados perivasculares de células do sistema imunológico e avaliar a distância percorrida no parênquima entre animais tratados e não tratados. Outra limitação potencial envolve os efeitos do microbioma na EAE patogênese. Commensal microbiota intestinal pode influenciar fortemente doença patogênese 24; portanto, os ratos alojados em diferentes colônias e até mesmo em gaiolas diferentes podem ter grandes diferenças na gravidade da doença. Assim, é sempre preferível sempre que possível usar controles da mesma ninhada levantadas na mesma gaiola paraexperimentos envolvendo EAE. Uma observação final é que se experimentalmente que é desejável para eliminar os efeitos de alterações proliferativas de células imunitárias na periferia, pode ser possível fazê-lo usando indução transferência passiva em vez da indução activo descrito neste protocolo. A confirmação adicional para a neuroprotecção pode ser conseguida utilizando um sistema de co-cultura para testar 11 mecanismos específicos de morte celular ou através da utilização de ratinhos knockout condicionais que permite a eliminação de proteínas selectivamente em um tipo de célula. Além disso, para estender a exploração de agentes farmacológicos que são neuroprotectores, marcadores de transecção axonal e morte neuronal deve ser incluída. Outra área de grande importância é a remielinização. axônios lesionados são incapazes de remielinar dando mais apoio que tratamentos neuroprotetores devem ser uma parte importante de terapias remielinização. Além disso, os axônios não mielinizados são mais vulneráveis ​​a lesões do que myelinaaxônios o Ted. Isto sugere que, quando um axônio torna-se intervenções terapêuticas de desmielinização que promovem a remielinização oportuna irá impedir lesão axonal. Para explorar estas pistas, outros modelos in vivo para a desmielinização e remielinização pode ser utilizado (isto é, cuprizona e lisolecitina). O método aqui descrito foco na avaliação neuroproteção, quantificando a perda de mielina. Para a avaliação da remielinização o número de células progenitoras, bem como a sua capacidade para proliferar e amadurecer também seria importante para investigar. Com a menção desses modelos alternativos, deve-se também considerar diferentes modelos de encefalite que são viralmente mediadas. Existem dois bem caracterizados modelos virais de ARN que produzem a perda de mielina: um é encefalomielite de Theiler murino, um vírus não envelopados Picornaviridae, e o outro é o vírus da hepatite do rato, um membro da família Coronaviridae vírus 25,26. EAE é uma ferramenta valiosa para studies de manipulações como tratamentos ou afectam o sistema imunológico e o sistema nervoso central in vivo. O protocolo aqui descrito pode ajudar a determinar onde os tratamentos estão a afectar o processo da doença, quer seja na periferia, na barreira sangue-cérebro, ou no sistema nervoso central. Não há tratamentos atuais para MS curar a doença e os pacientes muitas vezes experiência de declínio ao longo do tempo. Da mesma forma, outras doenças envolvendo a infiltração de células imunes para o SNC e degradação de mielina, incluindo a encefalomielite aguda disseminada, mielite transversa, e neuromielite óptica, tratamentos falta que protegem o sistema nervoso central, uma vez que está diretamente sob ataque por infiltração de células do sistema imunológico. Tomando em consideração o tempo de tratamento e utilizando análise de citometria de fluxo do baço e da medula espinhal em conjunto com imuno-histoquímica do SNC para avaliar a inflamação e dano irá permitir determinações mecanicistas a ser feita sobre tratamentos.

A esclerose múltipla (MS) é caracterizada por lesões inflamatórias predominantemente em regiões de matéria branca do cérebro cedo na doença. Depois de progressão a longo prazo, atrofia matéria cinzenta é detectado por imagem de ressonância magnética e assinala a fase neurodegenerativa da doença. gliose reactiva, desmielinização e lesão axonal na substância branca são atribuídos a células imunes do SNC-infiltrantes. Nenhum dos tratamentos actualmente utilizados em MS reverter ou prevenir a neurodegeneração directamente no sistema nervoso central - em vez disso, eles reduzem a inflamação por meio da atenuação de activação e / ou a infiltração de células T no SNC. Porque não há nenhuma cura para a MS e pacientes em uso de tratamentos atuais continuam a experimentar a progressão da doença, as descobertas de medicamentos que impedem a desmielinização e neuronal perda são extremamente importantes. No entanto, diferenciando entre efeitos nas células do sistema imunológico e aqueles no sistema nervoso central pode ser difícil experimentalmente, como o resultado - isto é, reduziu os danos no SNC - parece o same independentemente dos mecanismos através dos quais ele ocorre. Assim, a avaliação da protecção do SNC deve ser uma parceria com avaliações de CNS-infiltrado de células imunitárias e a proliferação de células imunitárias na periferia para determinar como agentes farmacológicos afectar mecanismos da doença. Encefalomielite auto-imune experimental (EAE) é um modelo animal bem estabelecido de desordens inflamatórias auto-imunes que foi directamente responsável pela descoberta de drogas actualmente usadas para tratar a MS 1-4. Os ratinhos são muitas vezes utilizados para a EAE, com ratinhos C57BL / 6 ser uma estirpe popular, com base na disponibilidade de variantes genéticas. Camundongos C57BL / 6 induzidos com EAE apresentam progressão da doença crônica, com início por volta do dia 10 pós-indução. A infiltração do parênquima da medula espinhal e cerebelo são característicos da histopatologia destes animais, com ausência de infiltração no parênquima cortical 5. lesões Além disso, corticais e desmielinização no bchuva são características da doença 6-9, que são relativamente ausente em ratinhos C57BL / 6. Portanto, pode ser preferível quando possível utilizar murganhos da estirpe SJL, que têm a doença recorrente-remitente e lesões encontradas tanto no cérebro e espinal medula que aparecem semelhantes aos do MS 10. O tratamento não pode ser classificado como neuroprotetor se células do sistema imunológico nunca chegar ao CNS. Portanto, este protocolo faz uso de análise de citometria de fluxo de cérebro, a espinal medula, e baços de ratinhos EAE para determinar os efeitos do tratamento sobre a infiltração de células imunitárias para o SNC e proliferação de células imunitárias na periferia, tal como anteriormente demonstrado 11. análises de imuno-histoquímica de tecido do SNC para determinar extensão e natureza da neuroproteção é também descrito. A combinação destes métodos permite a determinação de se as células imunitárias foram activadas proliferaram e na periferia, se as células imunitárias entrou no SNC, e se o SNC foi protected de inflamação ou dano. Se os efeitos neuroprotectores são suspeitos apesar dos efeitos sobre o sistema imunitário, os experimentadores pode alterar o tratamento começar vezes após a infiltração de células imunitárias em que se registou o SNC. Aqui, nós apresentamos um protocolo usando dois diferentes modelos de EAE activa, um modelo animal mediada por células T de MS, e citometria de fluxo combinada com imuno-histoquímica em vários pontos temporais durante a doença para determinar a eficácia de terapias experimentais em diferentes aspectos de patogênese MS. Este método irá auxiliar pesquisadores em diferenciar entre os efeitos sobre a proliferação de células imunes e infiltração e protecção das CNS, tornando mais fácil para limitar como as drogas agem sobre patogênese da doença.

<table><tbody><tr><td>Molde de embutir 22 x 22 x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9719245</td><td></td></tr><tr><td>Molde de embutir 22 x 30 x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531194</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>30 x 22 x 20 mm molde de incorporação</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-30</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552775</td><td>0,2 mg/ml de concentração de estoque</td></tr><tr><td>anti-Foxp3-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5773-82</td><td>0,5 mg/ml de concentração de estoque</td></tr><tr><td>anti-GFAP (Coquetel)</td><td>Biolegend</td><td>835301</td><td>1 - 3 mg/ml de</td></tr><tr><td>anticorpo policlonal anti-Iba-1 de concentração de estoque (50 &#181; g)</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>0,5 mg/ml de concentração de estoque</td></tr><tr><td>anti-IFN-&gama; APC</td><td>eBioscience</td><td>17-7311-82</td><td>0,2 mg/ml de concentração de estoque</td></tr><tr><td>anti-IL-17A PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-7177-82</td><td>0,2 mg/ml de concentração de estoque</td></tr><tr><td>anti-Ki-67 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5698-82</td><td>0,2 mg/ml de concentração de estoque</td></tr><tr><td>anti-MBP (D-18)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-13912</td><td>0,2 mg/ml de concentração de estoque</td></tr><tr><td>anti-TCR&beta; FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-85</td><td>0,5 mg/ml de concentração de estoque</td></tr><tr><td>anti-TCR&beta; PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-83</td><td>0,2 mg/ml de concentração de estoque</td></tr><tr><td>Biotinilado Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Vector Labs</td><td>BA-1000</td><td>1,5 mg/ml de concentração de estoque</td></tr><tr><td>Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG</td><td>Vector Labs</td><td>BA-2000&nbsp;</td><td>Concentração de estoque de 1,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Ácido Cítrico, Anidro, 99,5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42356-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), sal tetrassódico di-hidratado, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC446085000</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio Superfrost Plus da Fisherbrand, caixa de 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Golgi Plug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>inibidor de transporte de proteínas</td></tr><tr><td>Immedge Caneta de Barreira Hidrofóbica</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>EMD Millipore</td><td>407952-5mg</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Near IR Vivo/Morto Kit de Coloração</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td>corante de viabilidade</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Vector</td><td>Labs S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Soro normal de cavalo</td><td>Vector Labs</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído, 96%</td>Solução <td>de</td> Penicilina-Estreptomicina AC416785000 <td></td><td>Fisher</td></tr><tr><td>Scientific, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>gradiente de densidade</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td>meio de montagem resinoso</td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma</td><td>P1585-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de proteína básica anti-mielina purificado</td><td>BioLegend</td><td>808401</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>detergente não iônico</td></tr><tr><td>Kit Vectastain Elite ABC (Padrão)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9206402</td><td>avidina-biotina-peroxidase&nbsp; complexo (ABC) na imunoperoxidase&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de substrato de peroxidase da Vector Laboratories (DAB)</td><td>Solução Fisher Scientific</td><td>NC9276270</td><td>DAB</td></tr></tbody></table>

determinar a supressão imune sistema contra cns proteção para farmacológicos intervenções na desmielinização auto-imune

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

Uma das principais características da doença desmielinizante autoimune esclerose múltipla (EM) é a infiltração de células imunes no cérebro e na medula espinhal, resultando na destruição da mielina, que não apenas retarda a condução dos impulsos nervosos, mas causa lesão axonal, resultando em declínio motor e cognitivo. Os tratamentos atuais para a EM se concentram na atenuação da infiltração de células imunes no sistema nervoso central (SNC). Esses tratamentos diminuem o número de recaídas, melhorando a qualidade de vida, mas não eliminam completamente as recaídas, portanto, a incapacidade a longo prazo não é melhorada. Portanto, agentes terapêuticos que protegem o SNC são necessários. Em ambos os modelos animais, bem como em pacientes humanos com EM, a entrada de células T no SNC é geralmente considerada o evento inflamatório inicial. Para avaliar se um medicamento protege o SNC, quaisquer efeitos potenciais na infiltração ou proliferação de células imunes na periferia devem ser descartados. Este protocolo descreve como determinar se a proteção do SNC observada após a intervenção medicamentosa é uma consequência da atenuação das células imunes infiltrantes do SNC ou do bloqueio da morte das células do SNC durante insultos inflamatórios. A capacidade de examinar os tratamentos de EM que protegem o SNC durante insultos inflamatórios é altamente crítica para o avanço das estratégias terapêuticas, uma vez que os tratamentos atuais reduzem, mas não eliminam completamente, as recidivas (ou seja, infiltração de células imunes), deixando o SNC vulnerável à degeneração.

Este protocolo descreve como determinar se os tratamentos farmacológicos para encefalomielite autoimune experimental mostram proteção do SNC como consequência da supressão da infiltração de células imunes ou são neuroprotetores durante o ataque de infiltração de células imunes.

Determinar a supressão imune Sistema contra CNS Proteção para farmacológicos intervenções na desmielinização auto-imune

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

O objetivo geral deste método conceitual é determinar se os tratamentos farmacológicos para a encefalomielite autoimune experimental demonstram sua proteção no sistema nervoso central durante o ataque da infiltração de células imunes ou como consequência da supressão dessa infiltração. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunologia neural, como, por exemplo, como a manipulação dos tempos de tratamento da EAE diferencia os efeitos sobre a infiltração de células imunes versus a proteção.As implicações dessa técnica também se estendem para a terapia da esclerose múltipla, já que atualmente não existem tratamentos neuroprotetores para esta doença. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando descobrimos que tratar camundongos com EAE com um inibidor do transportador sistema Xc- era ao mesmo tempo neuroprotetor e imunomodulador. Embora este método possa ser usado para estudar tratamentos farmacológicos, ele também pode ser aplicado a estudos que utilizam camundongos com genes knockout submetidos à EAE ou outras manipulações.Comece usando tesouras estéreis para picar os cérebros e medulas espinhais de animais individuais em pequenos pedaços. Em seguida, utilize o êmbolo de uma seringa de três mililitros por tecido para esmagar cada amostra sobre peneiras celulares de 70 microns individuais, direcionando para tubos cônicos de 50 mililitros individuais, enquanto enxágua as peneiras com meio. Quando todos os pedaços tiverem sido macerados, complete o volume final nos tubos até 50 mililitros com meio fresco e, então, centrifugue as suspensões celulares.Resuspenda cada pellet em quatro mililitros de solução de gradiente de densidade a 40%. Em seguida, sobreponha cuidadosamente as células lentamente ao longo das paredes de tubos cónicos individuais de 15 mililitros, sobre dois mililitros de solução de gradiente de densidade a 70% por tubo. Separe as células por centrifugação e utilize pipetas de transferência de um mililitro para descartar cuidadosamente as camadas superiores de mielina.Em seguida, transfira as células viáveis das interfaces da amostra para novos tubos cónicos de 15 mililitros e lave as células em um volume final de 15 mililitros de meio fresco por tubo. Re-suspenda os pellets em 200 microlitros de meio fresco e transfira as suspensões celulares para poços individuais de uma placa de fundo redondo com 96 poços. Centrifugue a placa e remova os sobrenadantes com um movimento rápido.Em seguida, re-suspenda os pellets em 200 microlitros de meio de restimulação e incube as células a 37 graus Celsius por quatro horas. Ao final da incubação, centrifugue a placa novamente e remova os sobrenadantes. Em seguida, lave as células com 200 microlitros de PBS suplementado com 2% FCS e re-suspenda as células em 200 microlitros de PBS suplementado com 2% FCS e bloqueador FC por 10 a 15 minutos no gelo.No final da incubação, lave as células conforme acabou de ser demonstrado e re-suspenda os pellets em 15 microlitros de coquetel de coloração da superfície celular por 15 minutos no gelo. Em seguida, centrifugue as células e lave as amostras duas vezes em 200 microlitros de PBS. A seguir, re-suspenda as células em reagentes de coloração do fator de transcrição FOXP3 de acordo com as instruções do fabricante, por 30 minutos a toda a noite a 4 graus Celsius.No final da incubação, lave as células em 150 microlitros de tampão de permeabilização. Em seguida, centrifugue as células e reconstitua os pellets nos anticorpos intracelulares de interesse em 15 microlitros de tampão de permeabilização sobre gelo. Após 30 minutos, centrifugue as células, seguido por três lavagens em 200 microlitros de tampão de permeabilização.Após a última lavagem, ressuspender os pellets em 200 microlitros de PBS e analisar as amostras por citometria de fluxo, selecionando as células vivas positivas para CD4 e positivas para TCR beta. Também é importante avaliar a proliferação de linfócitos T periféricos, pois alterações na periferia podem afetar a infiltração de células imunes no SNC. Para quantificar o número de astrócitos e células gliais presentes nas amostras de tecido da medula espinhal após a indução de EAE, obter imagens de cada corte com aumento de 4x e salvar as imagens como arquivos TIFF.Em seguida, no ImageJ, selecione a imagem de interesse e use a ferramenta de seleção poligonal para delinear toda a seção do tecido espinhal. No menu imagem, selecione tipo e 16 bits para converter a imagem em 16 bits. Depois, abra o menu processar e selecione subtrair fundo, definindo o raio da bola rolante como pelo menos o tamanho do maior objeto que não faz parte do fundo.Verifique o paraboloide deslizante e clique em OK. Em seguida, em imagem, selecione ajustar e limite, e use as barras deslizantes para definir o nível inferior do limite. Para obter a porcentagem da área com limite dentro da região selecionada, em analisar e definir medidas, selecione fração de área. Certifique-se de que a opção limitar ao limite esteja desmarcada e que a opção exibir rótulo esteja marcada, e clique em OK. Para obter as medidas, em analisar, selecione medir.Uma caixa de pop-up de resultados aparecerá. Salve esses dados e compare os valores da fração de área entre os grupos tratados. Para quantificar a coloração da básica da mielina por densidade óptica, abra a imagem de interesse e use a ferramenta de seções poligonais para desenhar uma região de interesse dentro da amostra.Em analisar e definir medições, selecione o valor médio de cinza e confirme que a opção limitar ao limiar está desmarcada e que a exibição de rótulo está marcada. Clique em OK. Em seguida, no menu analisar, selecione medir. Uma nova janela pop-up de resultados aparecerá com os dados do valor médio de cinza da proteína básica da mielina.A remoção da medula espinhal e a análise por citometria de fluxo permitem a avaliação da infiltração de células imunes no sistema nervoso central, onde a infiltração celular imune é máxima no pico da doença. A análise estatística dos números de células positivas para CD4, positivas para interferon gama, positivas para IL-17 e positivas para FOXP3 pode revelar a significância das alterações observadas nos números de linfócitos T infiltrantes positivos para CD4 em animais tratados com fármacos, em comparação com animais controle, sendo essencial uma análise detalhada da coexpressão para descartar desvios como fator de confusão na redução global do número de linfócitos T infiltrantes positivos para CD4. Para eliminar a possibilidade de que a redução das células T infiltrantes no sistema nervoso central seja uma consequência da inibição da proliferação, ativação e diferenciação na periferia, pode-se avaliar o número de linfócitos T em proliferação ativa e a proporção dos subtipos de linfócitos T.Para avaliação quantitativa da integridade da mielina, pode-se realizar uma análise estatística da densidade óptica da coloração da proteína básica da mielina, revelando uma desmielinização significativa no tecido da medula espinhal de animais com nocaute genético não especificado em comparação com os irmãos selvagens, por exemplo. Para corroborar ainda mais que a neuroinflamação é mantida ou reduzida por intervenções terapêuticas, a gliose reativa também pode ser avaliada mediante a medição da fração média de área para gliose reativa, conforme acabou de ser demonstrado. Uma vez dominada, a técnica de citometria de fluxo pode ser concluída em dois dias, se realizada corretamente, enquanto a quantificação da coloração tecidual pode ser realizada em cerca de duas horas por coloração.A imunomodulação pode ser avaliada mediante a introdução dos tratamentos antes da infiltração das células imunes, a fim de quantificar as alterações na migração e na proliferação das células T. A proteção do SNC pode ser avaliada introduzindo os tratamentos durante o pico da doença, quando as células imunes já infiltraram o SNC. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de avaliar as configurações ideais de limiar no ImageJ para destacar especificamente a marcação celular.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar os efeitos de tratamentos específicos sobre o sistema nervoso central, a proliferação de linfócitos T e as respostas de migração. Ao alterar os tempos de tratamento antes e após a infiltração de células imunes.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Linhagens determinados são capazes de resistir a indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) com proteína básica de mielina. Descrito aqui é um simples protocolo de imunização que reverte a apatia e induz a doença paralítica em vários típicos EAE manchas resistentes do mouse.

Superando indiferença em Encefalomielite autoimune experimental (EAE) linhagens mais resistentes por transferência adotiva e desafio antigênico

Uma nova ex vivo preparação para a imagem latente o mouse medula espinhal. Este protocolo permite a dois fotões imagiologia de interacções celulares vivos ao longo da medula espinal.

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

Doenças desmielinizantes podem ser modeladas em animais por aplicação focal de lisolecitina no SNC. Uma única injeção de lisolecitina na medula espinhal do camundongo produz uma lesão que se repara espontaneamente com o tempo. O objetivo é estudar os fatores envolvidos na desmielinização e remielinização e testar agentes para melhorar o reparo.

Experimental desmielinização e remielinização de Medula Espinhal Murino por Injeção Focal de lisolecitina

Este manuscrito descreve os métodos de indução e pontuação do modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE), juntamente com a avaliação da distribuição de células imunes e níveis de citocinas de mRNA em linfonodos, baço, sangue e medula espinhal usando citometria de fluxo e PCR quantitativo, respectivamente, em várias fases da doença.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Aqui, apresentamos os protocolos para investigar o comprometimento da unidade neurovascular durante encefalomielite auto-imune experimental in vivo. Abordamos especificamente como determinar a permeabilidade da barreira hemato - encefálica e gelatinase atividade envolvida na migração de leucócitos através da limitans da glia.

Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e Glial da unidade Neurovascular durante encefalomielite auto-imune Experimental In Vivo

Este manuscrito apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental ativa (EAE) em camundongos. Um método de isolamento e caracterização dos linfócitos infiltrados no sistema nervoso central (SNC) também é apresentado para mostrar como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune cns.

Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

O presente protocolo descreve uma injeção de dois pontos de linfosfatilcolina através de um quadro estereotaxico para gerar um modelo de desmielinização estável e reprodutível em camundongos.

Uma injeção de dois pontos estabelecida stably de lysophosphatidylcoline-Induced Focal Demyelination Modelo em camundongos

Até o momento, os protocolos para o isolamento simultâneo de todos os principais tipos celulares residentes no sistema nervoso central do mesmo camundongo são uma demanda não atendida. O protocolo mostra um procedimento aplicável em camundongos ingênuos e experimentais com encefalomielite autoimune para investigar redes celulares complexas durante a neuroinflamação e, simultaneamente, reduzir o número necessário de camundongos.

Isolamento Simultâneo dos Principais Tipos Celulares Residentes no Sistema Nervoso Central de Camundongos Adultos com Encefalomielite Autoimune

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) serve como modelo animal de esclerose múltipla. Este artigo descreve uma abordagem para pontuar inflamação medular, desmielinização e lesão axonal em EAE. Adicionalmente, um método para quantificar os níveis de luz solúvel dos neurofilamentos no soro de camundongos é apresentado, facilitando a avaliação da lesão axonal em camundongos vivos.

Pontuação de Inflamação, Desmielinização e Lesão do Axônio do Sistema Nervoso Central na Encefalomielite Autoimune Experimental

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal de esclerose múltipla (EM), que compartilha com a doença humana uma resposta autoimune humoral robusta. Aqui, relatamos um protocolo ELISA simples e flexível para quantificar autoanticorpos no soro de camundongos imunizados com EAE.

Quantificação de anticorpos autorreativos em camundongos após encefalomielite autoimune experimental

Aprenda a distinguir efeitos imunomoduladores de neuroprotetores em modelos de encefalomielite autoimune experimental usando citometria de fluxo e análise de imagem. Este método auxilia no desenvolvimento de terapias para esclerose múltipla.

Determinar a supressão imune Sistema contra CNS Proteção para farmacológicos intervenções na desmielinização auto-imune

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