Determinar a supressão imune Sistema contra CNS Proteção para farmacológicos intervenções na desmielinização auto-imune

O objetivo geral deste método conceitual é determinar se os tratamentos farmacológicos para encefalomielite autoimune experimental demonstram sua proteção do sistema nervoso central durante o ataque de infiltração de células imunes ou como consequência da supressão da infiltração de células imunes. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo imunológico neural. Por exemplo, como a manipulação dos tempos de tratamento com EAE diferencia os efeitos na infiltração de células imunes versus proteção.

As implicações dessa técnica também se estendem à terapia da esclerose múltipla, uma vez que atualmente não existem tratamentos protetores neurais para essa doença. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando descobrimos que o tratamento de camundongos EAE com um inibidor do transportador Xc do sistema era neuroprotetor e imunomodulador. Embora esse método possa ser usado para estudar tratamentos medicamentosos, ele também pode ser aplicado a estudos usando camundongos nocaute genético submetidos a EAE ou outras manipulações.

Comece usando uma tesoura estéril para picar os cérebros e a medula espinhal de animais individuais em pequenos pedaços. Em seguida, use um êmbolo de seringa de três mililitros por tecido para triturar cada amostra sobre filtros de células individuais de 70 mícrons em tubos cônicos individuais de 50 mililitros enquanto enxágue os filtros com meio. Quando todas as peças estiverem maceradas, aumente o volume final nos tubos para 50 mililitros com meio fresco e, em seguida, centrifugue as suspensões celulares.

Ressuspenda cada pellet em quatro mililitros de solução de gradiente de densidade de 40%. Em seguida, coloque cuidadosamente a célula lentamente nas paredes de tubos cônicos individuais de 15 mililitros em cima de dois mililitros de solução de gradiente de densidade de 70% por tubo. Separe as células por centrifugação e use pipetas de transferência de um mililitro para descartar cuidadosamente as camadas superiores de mielina.

Em seguida, transfira as células viáveis das interfaces de amostra para novos tubos cônicos de 15 mililitros e lave as células em um volume final de 15 mililitros de meio fresco por tubo. Ressuspenda os pellets em 200 microlitros de meio fresco e transfira as suspensões de células para poços individuais de uma placa inferior redonda de 96 poços. Centrifugar a placa e retirar os sobrenadantes.

Em seguida, ressuspenda os pellets em 200 microlitros de meio de reestimulação e incube as células a 37 graus Celsius por quatro horas. No final da incubação, centrifugue novamente a placa e remova os sobrenadantes. Em seguida, lave as células em 200 microlitros de PBS suplementado com 2%FCS e ressuspenda as células em 200 microlitros de PBS suplementado com 2%FCS e bloqueio FC por 10 a 15 minutos em gelo.

No final da incubação, lave as células como acabamos de demonstrar e ressuspenda os pellets em 15 microlitros de coquetel de coloração de superfície celular por 15 minutos no gelo. Em seguida, gire as células e lave as amostras duas vezes em 200 microlitros de PBS. Em seguida, ressuspenda as células nos reagentes de coloração do fator de transcrição FOXP3 de acordo com as instruções do fabricante por 30 minutos a 4 graus Celsius durante a noite.

No final da incubação, lave as células em 150 microlitros de tampão de permeabilização. Em seguida, centrifugue as células e ressuspenda os pellets nos anticorpos intracelulares de interesse em 15 microlitros de tampão de permeabilização em gelo. Após 30 minutos, gire as células seguidas de três lavagens em 200 microlitros de tampão de permeabilização.

Após a última lavagem, ressuspenda os pellets em 200 microlitros de PBS e analise as amostras por citometria de fluxo, fechando as células vivas CD4-positivas, TCR beta-positivas. Também é importante avaliar a proliferação de células T periféricas porque as mudanças na periferia podem afetar a infiltração de células imunes no SNC. Para quantificar o número de astrócitos e células gliais presentes nas amostras de tecido da medula espinhal após a indução do EAE, obtenha imagens de cada seção com uma ampliação de 4x e salve as imagens como arquivos TIFF.

Em seguida, em ImageJ, selecione a imagem de interesse e use a ferramenta de seleções de polígonos para traçar toda a seção do tecido espinhal. No menu de imagem, selecione o tipo e 16 bits para converter a imagem em 16 bits. Em seguida, abra o menu de processo e selecione o plano de fundo do assunto para definir o raio da bola rolante para pelo menos o tamanho do maior objeto que não faz parte do plano de fundo.

Verifique o parabolóide deslizante e clique em OK. Em seguida, na imagem, selecione ajustar e limite e use as barras deslizantes para definir o nível de limite inferior. Para obter a porcentagem da área limite dentro da região selecionada, em analisar e definir medidas, selecione a fração de área. Certifique-se de que o limite de limite esteja desmarcado e que o rótulo de exibição esteja marcado e clique OK.To obter as medidas, em analisar, selecione medida.

Uma caixa pop-up de resultados aparecerá. Salve esses dados e compare os valores da fração de área entre os grupos de tratamento. Para quantificar a coloração básica da mielina pela densidade óptica, abra a imagem de interesse e use a ferramenta de seções de polígono para desenhar uma região de interesse dentro da amostra.

Em Analisar e definir medidas, selecione o valor médio de cinza e confirme se o limite para o limite está desmarcado e se o rótulo de exibição está marcado. Clique em OK. Em seguida, no menu de análise, selecione medir. Uma nova caixa pop-up de resultados aparecerá com os dados do valor médio de cinza da proteína básica de mielina.

A remoção da medula espinhal e a análise por citometria de fluxo permitem a avaliação da infiltração de células imunes do sistema nervoso central, onde a infiltração de células imunes é máxima no pico da doença. A análise estatística dos números de células CD4-positivas, interferon gama-positivas, IL-17-positivas e FOXP3-positivas pode revelar a importância das alterações observadas no número de células T infiltrantes CD4-positivas em animais tratados com drogas, versus animais controle, com análise aprofundada de coexpressão essencial para descartar a distorção como um fator de confusão na redução geral do número de células T infiltrantes CD4-positivas. Para eliminar a possibilidade de que uma redução nas células T infiltrantes do sistema nervoso central seja uma consequência da inibição da proliferação, ativação e diferenciação na periferia, o número de células T em proliferação ativa e a proporção de subtipos de células T podem ser avaliados.

Para avaliação quantitativa da integridade da mielina, a análise estatística da densidade óptica da coloração da proteína básica da mielina pode ser realizada, revelando uma desmielinização significativa do tecido da medula espinhal em animais nocaute genético não especificados em comparação com irmãos de ninhada do tipo selvagem, por exemplo. Para comprovar ainda mais que a neuroinflamação é sustentada ou diminuída por intervenções terapêuticas, a gliose reativa também pode ser avaliada medindo a área média da fração para gliose reativa, conforme demonstrado. Uma vez dominada, a técnica de citometria de fluxo pode ser concluída em dois dias se for realizada corretamente, enquanto a quantificação da coloração do tecido pode ser realizada em cerca de duas horas por coloração.

A imunomodulação pode ser avaliada introduzindo os tratamentos antes da infiltração de células imunes para quantificar as alterações migratórias e proliferativas nas células T. A proteção do SNC pode ser avaliada introduzindo os tratamentos durante o pico da doença, quando as células imunes já se infiltraram no SNC. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de avaliar as configurações de limite ideais no ImageJ apenas para o realce específico da coloração celular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar os efeitos de tratamentos específicos no sistema nervoso central, proliferação de células T e respostas de migração. Alterando os tempos de tratamento antes e depois da infiltração das células imunes.