Name: Murino Experimental Modelo de desenvolvimento do tumor original e Peritoneal Metástase via Ortotópico injetar células do ovário Carcinoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda a desenvolver um modelo murino de carcinoma ovariano com inoculação ortotópica para estudar a formação tumoral primária e metástase peritoneal. Este método permite investigar a disseminação peritoneal em oncologia.

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Os autores agradecem os membros do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia e Biologia do Câncer para suas discussões úteis e assistência técnica. Este estudo foi apoiado por uma Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) Grant-in-Aid para a Investigação Científica (15K15604; a H. Kajiyama).

O protocolo de tratamento segue as orientações para a experimentação animal adotado pela Universidade de Nagoya. 1. Preparação de suspensões de células <ol><li> linha de células humanas ovário clara carcinoma de células. <ol><li> Manter ES-2 em células 12 meio RPMI-1640 com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e penicilina / estreptomicina (penicilina: 100 unidades / ml, estreptomicina: 0,1 mg / ml). As células de cultura a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 a 5% humidificada. </li><li> Recolher as células em fase de crescimento logarítmico em 0,05% de solução de EDTA de tripsina / 0,02% (tripsina / EDTA). <ol><li> Em primeiro lugar, retirar os meios de idade a partir do recipiente de cultura de células, em seguida, lavar as células uma vez com PBS (PBS sem Ca2 + / Mg2 +, 3 - 4 2 ml por 25 cm). </li><li> Em seguida, adicione 1 ml por 25 cm 2 de tripsina / EDTA. Rodar o recipiente de cultura de células para cobrir a monocamada de células com tripsina / EDTA. Depois de retirar e descartar tripsina / EDTA, devolver o celularrecipiente de cultura na incubadora durante 3-5 minutos ou até que as células são separadas. </li><li> Examinar as células sob um microscópio para assegurar que as células são separadas da superfície do recipiente de cultura de células e flutuante. </li><li> Adicionar soro fresco contendo meio de crescimento para inactivar a tripsina (5 ml por cada 25 cm2), e re-suspender as células. Transferir as células ressuspensas a um tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 min. Realizar centrifugação quer a 4 ° C ou à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante e as células com meio de crescimento re-suspensão (5 ml por 25 cm2). </li></ol></li><li> Contagem de células (por exemplo, por exclusão de tripano azul), em seguida, re-suspender em meio de crescimento a uma densidade de 2 x 10 8 células / ml. Colocar as células em suspensão em gelo. </li></ol></li><li> Descongelar matriz extracelular congelado (ECM) à base de alíquotas de hidrogel num banho de gelo. </li><li> Adicionar a suspensão de células com ali quotas de hidrogel à base de ECM, na proporção de 1: 1 (célula C definitivaoncentration: 1 x 10 5 células / ml de hidrogel baseado em médio ECM) e misture bem. Coloque as suspensões de células preparadas num banho de gelo até à sua utilização. </li></ol> 2. ortotópico inoculação com suspensões de células NOTA: A cirurgia não requer um conjunto dedicado. A cirurgia pode ser executada em uma bancada de laboratório em uma área do quarto que é separado e possui uma actividade mínima. Um capuz laminar também pode ser usado. instrumentos cirúrgicos esterilizados devem ser utilizados e as tesouras não deve ser usado para fazer incisões na pele. <ol><li> Use camundongos nu feminino (BALB / c nu / nu) com 8 semanas de idade, para este modelo de inoculação ortotópico. </li><li> Em primeiro lugar, anestesiar o rato usando inalação com isoflurano (2-4%). Verifique a profundidade da anestesia, verificando a falta de retirada mediante pitada dedo do pé firme. Após o rato é anestesiado, aplique uma pomada oftálmica estéril branda para os olhos para evitar a secagem, se necessário. </li><li> Coloque o rato anestesiado em um operating barriga do lado do palco para baixo. Desinfectar a área cirúrgica várias vezes com álcool e uma esfoliação à base de clorexidina à base de iodo ou. </li><li> Faça um ~ 2 cm de incisão vertical perto da espinha entre o arco costal direito e fêmur. Usar uma cobertura cirúrgica esterilizada em torno do local da incisão. Fixar as superfícies da pele incisão com grampos para manter a abertura. Nota: Os retractores pode ser usado em vez das braçadeiras. </li><li> Em seguida, fazer uma segunda incisão (aproximadamente 1 cm) no peritoneu parietal sob a primeira incisão para abrir a cavidade abdominal. Fixar as superfícies abdominais incisão. Clipe da gordura do tecido que rodeia o tubo falópico e ovário ipsilateral com uma braçadeira para remover o ovário a partir da cavidade abdominal. Com cuidado, coloque o ovário e trompa de Falópio em gaze. Em seguida, coloque barriga para o lado do mouse para baixo sob o microscópio de dissecação. </li><li> Colocar a suspensão de células em uma seringa de insulina (1/2 cc, 29 g) imediatamente antes da injecção. Cuidadosamente injectar a suspensão de células preparada (1- 2 ul) para o ovário. Para vários segundos, reter a agulha dentro do ovário para garantir a gelificação do hidrogel à base de ECM. Depois de a gelificação, as células de tumor injectadas no interior do ovário. </li><li> voltar cuidadosamente o ovário no corpo. Suturar a segunda incisão com seda médica estéril e, em seguida, selar a pele com grampos de sutura. </li><li> Após a cirurgia, os ratos serão administradas uma a analgesia (por exemplo, o meloxicam, intramuscular (IM) ou subcutânea (SC), 0,2 mg / kg) durante um período de 24 h inicial. </li></ol> Tratamento 3. pós-cirúrgica <ol><li> Coloque cada rato em uma gaiola separada em papel limpo, com um pacote quente para manter o mouse morna até que recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Em seguida, retornar os animais para suas gaiolas de criação e de monitoramento. Monitorar os ratos por dia durante 3 - 7 dias após o tratamento cirúrgico. </li><li> Monitoramento de ratos pós-operatória <ol><li> Em caso de sinais de dor, administrar analgesiasics diária (por exemplo, o meloxicam, IM ou SC, 0,2 mg / kg). </li><li> Se os ratos têm sinais de infecção (por exemplo, vermelhidão, inchaço, secreção), administrar a injecção diária com um reagente anti-infeccioso (por exemplo, penicilina, im, 100.000 UI / kg). </li></ol></li><li> Remover materiais fechamento da pele 10 - 14 dias após o tratamento pós-cirúrgico. </li></ol> 4. Análise de tumores e metástases NOTA: O tumor será formada nas injectados ovário de 2 - 3 semanas após a inoculação. <ol><li> Sacrificar os ratos por dióxido de carbono, e depois recolher as amostras (por exemplo, tumores, metástases e órgãos) 13-15 para posterior análise 14,16-20. NOTA: Se um sistema de imagem in vivo está disponível, células portadoras de enzimas que produzem bioluminescência (por exemplo, a luciferase) ou a proteína fluorescente (por exemplo, GFP) pode ser utilizado no presente protocolo. Este protocolo modificado irá fornecer informações úteis paraa dinâmica da disseminação de células de cancro a partir do tumor primário. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Os modelos animais são essenciais para analisar os mecanismos de desenvolvimento de tumores, progressão, metástase, e a eficácia do fármaco contra as células cancerosas. Os ratinhos portadores de células cancerosas do ovário humano, também têm sido usados ​​como um modelo animal. Aqui, descrevemos um procedimento menos invasivo para a administração de células tumorais de ovário em um sítio ortotópico. Usando este procedimento, a inoculação para o ovário através de uma abordagem retroperitoneal pelo flanco dorsal oferece...

Carcinoma epitelial do ovário (EOC) representa a maior taxa de mortalidade relacionada ao câncer entre as doenças malignas ginecológicas 1. EOC está associada a um mau prognóstico, principalmente devido ao seu final sintomatologia, e é muitas vezes associado a várias disseminações intraperitoneal e metástases à distância 2-4. disseminação peritoneal é um processo multi-passo. Em primeiro lugar, as células de tumor a partir de separar as lesões primárias, e migrar para dentro da cavidade abdominal. Quando as células tumorais anexar ao mesotélio peritoneal, eles começam a invadir os tecidos através do mesotélio 5,6. A fim de melhor compreender a biologia do tumor (por exemplo, a progressão do câncer e resposta terapêutica), modelos de ratos fornecer uma riqueza de informações. Um xenoenxerto de cancro humano com células é amplamente utilizada para modelos de ratos em que as células de cancro humano são inoculados por via subcutânea, por via intraperitoneal, por via intravenosa, e ortotopicamente. Um modelo animal com um ortotopicamente grafted tumor pode gerar mais eficientemente e com precisão os resultados que reflectem o ambiente tumoral em seres humanos, em comparação com um modelo animal com um tumor heterotopicamente enxertado. Por isso, para muitos tumores humanos, os modelos de transplante ortotópico foram estabelecidas 7-11. Aqui, descrevemos a inoculação ortotópico de células EOC humanos através de uma abordagem retroperitoneal pelo flanco dorsal, que tem capacidade de invasão limitada em comparação com a inoculação ventral. Esta técnica pode proporcionar uma variedade de informações úteis sobre EOC, particularmente o mecanismo de difusão intraperitoneal.

<table><tbody><tr><td>Matriz matrigel&nbsp;</td><td>Seringa de</td> insulina de <td>hidrogel à base de ECM</td>BD <td>354234</td></tr><tr><td></td><td>TERUMO</td><td>SS-05M2913</td><td>1/2 cc, 29 G x 1/2"</td></tr> <tr><td>Agulha de sutura com sutura</td><td></td><td></td><td>11 mm, 3/8, Nylon6-0</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Aplicador de clipe de ferida</td><td>CellPoint Scientific</td><td>204-1000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Clipes de ferida Reflex 7 mm</td><td>CellPoint Scientific</td><td>203-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

murino experimental modelo de desenvolvimento do tumor original e peritoneal metástase<em&gt; via</em&gt; ortotópico injetar células do ovário carcinoma

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

carcinoma epitelial do ovário (EOC) está associada a um prognóstico ruim porque mostra disseminação peritoneal. Para melhorar o prognóstico, é importante controlar a disseminação peritoneal. No entanto, ainda não está claro como as células tumorais separar de lesões primárias e anexar ao mesotélio. O estabelecimento de um modelo animal apropriado é necessário para obter uma compreensão do mecanismo de disseminação peritoneal in vivo. No estudo actual, introduz-se o processo a partir da injecção local de células EOC para dentro da superfície do ovário murino para o desenvolvimento de metástases, incluindo o peritoneu e os órgãos distantes. Foram utilizados ratinhos nus fêmea (BALB / c nu / nu) com 8 semanas de idade. Sob um campo de vista microscópico, células EOC (1 x 10 5 células / ml de matriz de médio extracelular (ECM) à base de hidrogel / ovário unilateral / mouse) foram injetados em ovários murino através de uma abordagem retroperitoneal pelo flanco dorsal. Este método proposto é um less procedimento invasivo para o mouse e minimiza os danos ao ovário. Aqui, descrevemos os passos metodológicos para o desenvolvimento da formação do tumor original e metastático do EOC.

<html> Seis ratinhos nus tinham os seus ovários inoculados com a linha de células de carcinoma de células claras humano ES-2, tal como descrito no presente protocolo. Como mostrado na Figura 1A, após 2 semanas, 5 dos 6 ratos tinha um tumor no ovário inoculados com células ES-2, mas não havia nenhum tumor no ovário contralateral sem inoculação (utilizado como um controlo). Além disso, 2 dos 5 camundongos mostraram várias disseminações peritoneal com ascite. Células metasti...

Para esclarecer o processo de várias etapas de difusão peritoneal de carcinoma dos ovários, o presente estudo apresenta um modelo experimental murino de desenvolvimento do tumor original e metástases através de inoculação peritoneal ortotópico com essas células tumorais.

Murino Experimental Modelo de desenvolvimento do tumor original e Peritoneal Metástase<em&gt; via</em&gt; Ortotópico injetar células do ovário Carcinoma

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

O objetivo geral deste procedimento é observar o desenvolvimento da formação de tumores originais e metastáticos no carcinoma de ovário epitelial. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da oncologia ginecológica, como compreender a biologia tumoral ou a disseminação peritoneal. A principal vantagem desta técnica é que a inoculação ortopédica de carcinoma epitelial de ovário humano, ou células EOC, é realizada por meio de uma abordagem retroperitoneal cultivada com flanco dorsal. Para preparar uma linhagem celular de carcinoma de células claras de ovário humano, plaque e mantenha as células ES2 em meio RPMI-1640 com 10% de FBS e PenStrep a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Na fase de crescimento logarítmico, remova o meio antigo da cultura e use três a quatro milímetros de PBS para lavar as células uma vez. Em seguida, adicione um milímetro de tripsina/EDTA e agite o recipiente para cobrir toda a monocamada. Remova e descarte a solução de tripsina e retorne as células ao incubador por três a cinco minutos. Após examinar as células ao microscópio para garantir que as células se desprendeu e estão flutuando, adicione cinco milímetros de meio de crescimento fresco contendo soro para inativar a tripsina e re-suspender as células antes de transferi-las para um tubo cônico de 15 milímetros. Centrifugue a suspensão a 300 vezes G e temperatura ambiente

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Modelos animais ortotópico de câncer de ovário replicar melhor as doenças humanas e, portanto, melhorar nosso entendimento sobre a progressão do câncer e da resposta do tumor à terapia. Um modelo de camundongo recebe uma injeção de intrabursal luciferase células que expressam tumor de ovário. O tratamento é administrado através de gavagem oral. O crescimento do tumor é monitorado...

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Um modelo ortotópico de câncer de ovário seroso em camundongos imunocompetentes para In vivo Imaging Tumor e Monitoramento de Tumor respostas imunes

Neste vídeo, demonstramos o desenvolvimento de um modelo tridimensional in vitro do revestimento da cavidade peritoneal. Essa cultura organotípica pode ajudar a investigar a adesão, invasão e proliferação de células de câncer de ovário.

Modelagem de metástase de câncer de ovário no revestimento da cavidade peritoneal: um método para estabelecer um modelo 3D in vitro do revestimento peritoneal

Neste vídeo, demonstramos a injeção intrauterina de células de câncer de ovário em um modelo de camundongo. Este modelo murino ortotópico nos ajuda a monitorar de forma não invasiva o crescimento do tumor e avaliar a eficácia de novas terapias para a prevenção e tratamento do câncer de ovário recorrente.

Injeção intra-uterina de células cancerígenas: uma técnica para entregar células cancerígenas para estabelecer o modelo intra-peritoneal de camundongo com câncer de ovário

Este vídeo descreve o protocolo para a criação de um modelo experimental murino para estudar o desenvolvimento tumoral e a metástase peritoneal. Este modelo de câncer de ovário é gerado pela inoculação ortotópica de células epiteliais humanas de câncer de ovário nos ovários de uma fêmea.

Inoculação ortotópica de células de câncer de ovário em ovário murino: um procedimento para estabelecer um modelo de camundongo com câncer de ovário para estudar a disseminação peritoneal de células

Descrevemos uma plataforma de imagem animal não invasiva que permite a detecção, quantificação e monitoramento do crescimento e recorrência do câncer de ovário. Este modelo de xenoenxerto intraperitoneal mimetiza o perfil clínico de pacientes com câncer de ovário.

Modelo murino de imagem não invasivo para detectar e monitorar o cancro do ovário Recorrência

A metástase do câncer de ovário é caracterizada por numerosas lesões intraperitoneais difusas, de modo que a quantificação visual precisa da carga tumoral é um desafio.  Aqui, descrevemos um método para quantificação in situ e ex vivo da carga tumoral metastática usando células tumorais marcadas com proteína fluorescente vermelha (RFP) e imagens ópticas.

A quantificação da Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metástase

O presente protocolo descreve a injeção de célula de osteossarcoma intratibia para gerar modelos de camundongos com osteossarcoma ortotópico e lesões de metástase pulmonar.

Injeção de células osteossarcoma intratibiais para gerar modelos de osteossarcoma ortotópico e metástase pulmonar

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo tridimensional (3D) ex vivo de interação célula-omento canceroso. O modelo fornece uma plataforma para elucidar mecanismos pró-tumorais dentro do nicho adiposo e para testar novas terapias.

Modelo Ex Vivo de Metástase Peritoneal de Câncer de Ovário Utilizando Omento Humano

Este manuscrito descreve o desenvolvimento de um modelo animal que permite testar diretamente os efeitos da hipóxia tumoral na metástase e decifrar os mecanismos de sua ação. Embora os experimentos descritos aqui se concentrem no sarcoma de Ewing, uma abordagem semelhante pode ser aplicada a outros tipos de tumores.

No modelo in vivo para o ensaio do efeito de hipoxia em metástase tumoral

Aprenda a desenvolver um modelo murino de carcinoma ovariano com inoculação ortotópica para estudar a formação tumoral primária e metástase peritoneal. Este método permite investigar a disseminação peritoneal em oncologia.

Murino Experimental Modelo de desenvolvimento do tumor original e Peritoneal Metástase via Ortotópico injetar células do ovário Carcinoma (Vídeo) | JoVE Journal

Murino Experimental Modelo de desenvolvimento do tumor original e Peritoneal Metástase

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