Análise automatizada de C. elegans Comportamento Swim Usando CELEST Software
7 de dezembro de 2016
Uma metodologia eficiente e simples para a análise baseada em computador do comportamento de natação nematóide em líquido é descrito. O método requer pouco ou nenhum investimento para C. elegans laboratórios. O hardware utilizado é padrão, e o software de computador para a análise comportamental (CELEST) é uma fonte aberta um.
O objetivo geral desta metodologia é avaliar quantitativamente o comportamento de natação de C.Elegans usando o software de Visão Computacional chamado CeleST, para C.Elegans Swim Test"Este método de análise pode ajudar a abordar o impacto de mutações genéticas ou intervenções farmacológicas no comportamento de natação de C.elegans. Ele também pode facilmente pontuar o declínio associado à idade nas capacidades das locomotivas. As principais vantagens dessa técnica são que vários animais podem ser rastreados simultaneamente, com diferentes aspectos da postura de natação analisados para pontuar oito parâmetros de comportamento de natação e avaliação automatizada de dados.
Comece obtendo um microscópio estéreo e uma câmera digital CCD, bem como um computador com software de gravação de vídeo digital e software de visão computacional para a análise do comportamento de natação de C.Elegans. No software de gravação de vídeo digital, defina as seguintes configurações: Cubra o microscópio com um pano escuro para evitar o brilho na área de queda de natação na lâmina do microscópio e melhore a qualidade da imagem. Ajuste a distância de trabalho e a ampliação do microscópio para uma visão completa da área de natação e ajuste o espelho base para obter um contraste nítido dos animais contra o fundo.
Em seguida, defina a iluminação para campo escuro para visualizar os corpos dos adultos como brancos contra um fundo preto. Em seguida, pipete 60 microlitros de tampão 1 x M9 em um anel de 10 milímetros, pré-impresso em uma lâmina de microscópio, e certifique-se de que a gota cubra totalmente a área interna do anel. Transfira quatro nematóides adultos para a gota de 1 x tampão M9, minimizando o transporte de bactérias que podem turvar o líquido.
Minimize as bactérias no poço de natação, permitindo que os nematóides rastejem brevemente em uma região não assentada da placa antes de serem transferidos ou misturando levemente o poço de natação para dispersar traços de bactérias menores antes de gravar. Em seguida, posicione a lâmina carregada com nematóides adultos na base do microscópio para registrar seu comportamento de natação em líquido em vídeos de 30 segundos. Para gravar, selecione Nova sequência na RAM sob o título Início e pressione o botão vermelho de gravação.
Por fim, após a conclusão da gravação, clique no título Início e selecione Exportar sequência completa, para fragmentar o vídeo em uma sequência de quadros de imagem. Comece iniciando o software de Visão Computacional para análise do comportamento de natação de C.elegans do Mat Lab clicando no botão Executar. Na tela inicial do programa de análise de natação, use os botões Adicionar um vídeo"ou Adicionar vários vídeos" para carregar sequências de quadros de imagem, um de cada vez ou em grupos, anexando rótulos relevantes, como genótipo, data, teste e duração.
Em seguida, clique em Processar vídeos"para permitir o rastreamento simultâneo de vários animais nas sequências carregadas. Na nova tela que aparece, selecione os vídeos desejados na caixa à esquerda e clique em Adicionar à lista"Em seguida, demarque a zona de natação selecionando três pontos dentro do ringue e inicie o processamento clicando em Processar todos os vídeos listados acima. Veja o progresso do processamento de vídeo na parte inferior central da tela.
Depois de concluído, feche a tela de processamento de vídeo. Comece clicando em Computar medidas"para abrir uma nova tela onde os vídeos processados podem ser carregados um de cada vez para validar ou rejeitar o rastreamento de animais individuais. Use esta etapa manual para se concentrar nas áreas de rastreamento perdido, mostradas nos blocos vermelhos, e contrastar com o rastreamento bem-sucedido, observado nos blocos verdes.
Encontre o Validade do corpo segmentado"na primeira barra de cores na tela na metade inferior. Observe que a porcentagem de quadros válidos está em verde e a porcentagem de quadros rejeitados está em vermelho. Em seguida, navegue e modifique blocos de quadros válidos ou rejeitados utilizando o próximo bloco, Alternar validade"Dividir bloco"e Isolar quadro"opções.
No caso raro de dois animais se cruzarem em uma zona de natação sem aglomeração, troque seus números de identificação em um intervalo de quadros específico com o botão Switch". Por fim, clique em Salvar e calcular medidas"para salvar a entrada de validade antes de enviar outro vídeo processado. Em seguida, selecione Fechar"para sair da tela Calcular medidas.
Observe que o software calcula mapas de curvatura do desempenho de natação de animais individuais em segundo plano, bem como os oito parâmetros indicados posteriormente. Na tela inicial do programa de software de Pesquisa Visual Computacional, clique em Exibir resultados"para obter a saída da análise. Em seguida, crie grupos de amostra para tratamento estatístico selecionando as sequências de quadros analisadas desejadas na caixa à esquerda e movendo-as para um grupo de amostra existente mais recente clicando nos botões Adicionar à amostra selecionada "ou Adicionar a uma nova amostra".
Clique em Mostrar gráficos para essas amostras" para ir para uma segunda tela que exibe os gráficos e as principais estatísticas das amostras para cada um dos oito parâmetros por seleção na parte superior da tela. Em seguida, selecione histogramas 2D" para traçar combinações de quaisquer dois parâmetros por meio da medida no eixo X e medir nos menus suspensos do eixo Y à esquerda da tela. Clique em Fechar"para sair e retornar à tela Exibir resultados".
Em seguida, selecione o botão de exportação no canto superior esquerdo da tela para salvar dados numéricos detalhados como um arquivo csv para abrir e manipular ainda mais em um programa de planilha. Por fim, selecione Fechar"para sair da tela Exibir resultados" e volte para a tela inicial. Clique em Sair"para garantir o salvamento do banco de dados que contém as sequências de vídeo analisadas.
Certos parâmetros de natação, como taxa de iniciação de ondas, índice de atividade, pincelada e velocidade de deslocamento, diminuíram gradualmente com a idade, mesmo em origens genéticas favoráveis. Por outro lado, o número de ondas corporais, assimetria, alongamento e parâmetros de ondulação tenderam a aumentar com a idade em adultos mutantes do tipo selvagem e idosos. Embora todos os nematóides comecem como adultos saudáveis, alguns perdem rapidamente sua aptidão física, enquanto outros mantêm o vigor por longos períodos de tempo, indicando que os maus idosos têm uma saúde consideravelmente menor do que os graciosos idosos.
Uma vez dominada, a análise de quatro vermes nadadores pode ser adquirida em questão de minutos. A computação leva cerca de seis minutos por vídeo e pode ser feita remotamente. É viável processar 250 animais por dia.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como adquirir vídeos de provas de natação e processar dados para obter avaliação da locomoção em líquido.
Visão Geral
Este artigo apresenta uma metodologia simples para analisar o comportamento de natação de C. elegans utilizando o software de código aberto CeleST. A abordagem é economicamente viável e utiliza equipamentos laboratoriais padrão, tornando-a acessível para diversas configurações de pesquisa.
Principais Componentes do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Análise comportamental
- Genética
Contexto
- C. elegans é um organismo modelo amplamente utilizado em estudos genéticos e comportamentais.
- O entendimento do comportamento de natação pode fornecer informações sobre os efeitos de mutações genéticas e intervenções farmacológicas.
- As alterações relacionadas à idade nas capacidades locomotoras podem ser avaliadas quantitativamente.
- Técnicas de visão computacional aumentam a precisão da análise comportamental.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para avaliar quantitativamente o comportamento de natação de C. elegans.
- Avaliar o impacto de fatores genéticos e ambientais no comportamento de natação.
- Facilitar a análise da diminuição da locomoção associada à idade.
Métodos Utilizados
- Utilização de um microscópio estereoscópico e câmera CCD digital para gravação de vídeo.
- Aplicação do software CeleST para rastreamento e análise do comportamento natatório.
- Gravação do comportamento de natação em um ambiente controlado com interferência bacteriana mínima.
- Processamento dos dados de vídeo para extrair parâmetros comportamentais-chave e gerar análises estatísticas.
Resultados Principais
- Vários C. elegans podem ser rastreados simultaneamente, permitindo uma análise abrangente.
- Foram observadas diminuições relacionadas à idade em certos parâmetros de natação.
- Alguns nematoides mantiveram a aptidão física por mais tempo do que outros, indicando variabilidade no envelhecimento.
- O método permite uma análise rápida do comportamento de natação, aumentando a eficiência da pesquisa.
Conclusões
- O software CeleST fornece uma plataforma robusta para analisar o comportamento de natação de C. elegans.
- Essa metodologia pode contribuir significativamente para estudos sobre genética e envelhecimento.
- Pesquisas futuras podem aproveitar essa abordagem para explorar questões comportamentais e fisiológicas adicionais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise automatizada do comportamento de natação de C. elegans permite triagem fenotípica em alta escala para a descoberta de compostos neuroativos e validação de alvos. Ao quantificar parâmetros de locomoção em meio líquido, o método apoia a redução de riscos mecanicistas de intervenções genéticas e farmacológicas em um sistema modelo escalável e reprodutível. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta ao associar respostas comportamentais à função de circuitos neuronais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da avaliação quantitativa da função neuromuscular em mutantes genéticos.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica ao monitorar simultaneamente oito parâmetros de comportamento natatório em centenas de animais.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao identificar compostos que alteram a diminuição associada à idade na capacidade locomotora.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho downstream por meio da demarcação padronizada da zona de natação e rastreamento automatizado.
- Resultados Quantitativos: Gera mapas de curvatura e oito parâmetros baseados na postura, sem limites de corte, permitindo avaliação confiável de compostos.
- Escalabilidade: Processa 250 animais por dia com computação remota, apoiando a reutilização da plataforma em diferentes campanhas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Relaciona fenótipos de comportamento de natação a modelos de envelhecimento e neurodegeneração por meio de tendências de parâmetros relacionados à idade.
- Continuidade Tradutiva: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao manter leituras comportamentais consistentes entre fluxos de trabalho.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir ao revelar fenótipos novos em contextos genéticos bem caracterizados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes, fornecendo leituras comportamentais quantitativas que contribuem para a compreensão mecanicista e a priorização de compostos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias por meio da análise automatizada da postura natatória e da dinâmica de movimento.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios e reprodutibilidade por meio do rastreamento simultâneo de múltiplos animais e processamento padronizado de vídeos.
- Análises: Fornece saídas estatísticas e estatísticas-chave para cada um dos oito parâmetros, permitindo comparação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Estabelece conexão com a continuidade pré-clínica por meio do alinhamento de biomarcadores relacionados à idade nas trajetórias de declínio da locomoção.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma capacidade reutilizável para triagem comportamental em diversos projetos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da redução da ambiguidade mecanicista na função neuromuscular.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio da avaliação automatizada de dados e mínima intervenção manual.
- Valor Estratégico: Decisões de prosseguimento ou interrupção melhores, eficiência de capital e redução de riscos biológicos em fases avançadas por meio da desconsideração fenotípica precoce.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base em limiares quantitativos de comportamento de natação.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na operação de software de visão computacional e no manejo de C. elegans.
- Exige microscópio estereoscópico, câmera digital CCD e computador com o software CeleST para captura e análise de vídeos.
- Exige padronização entre equipes na demarcação da zona de natação e na rotulagem dos vídeos quanto ao genótipo, data, ensaio e duração.
- Envolve considerações de adaptação entre diferentes sistemas modelo devido à dependência de ensaios de locomoção em meio líquido.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de minimizar a contaminação bacteriana nos poços de natação para manter a qualidade da imagem.
