Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

O objetivo geral deste protocolo de indução hemogênica é desencadear um processo de desenvolvimento em fibroblastos de camundongo por meio da superexpressão de fatores de transcrição para gerar células precursoras hematopoiéticas in vitro que produzam células hematopoiéticas após cultivo prolongado. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de programação hematopoiética, como, por exemplo, se é possível desenvolver um protocolo capaz de obter HSCs autênticas de novo, com potencial para múltiplas linhagens e enxerto. A principal vantagem desta técnica é que, por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição, o processo de desenvolvimento pode ser iniciado em células reprogramadas sem a necessidade de passar por um estágio intermediário pluripotente.

Após o cultivo de fibroblastos embrionários de camundongo ou MEFS e a produção do vírus de acordo com o protocolo descrito, utilize gelatina a 0,1 por cento em PBS para pré-revestir placas de 6 poços. Certifique-se de que a gelatina cubra toda a área do poço. Coloque as placas no incubador a 37 graus Celsius por pelo menos 20 minutos.

Em seguida, remova as placas e aspire a gelatina. Plaque os MEFs com DMEM padrão em uma densidade de 25.000 células por poço e deixe as células sedimentarem a 37 graus celsius durante a noite. Prepare um coquetel viral de 100 microlitros misturando 50 microlitros de M2RTTA e 12,5 microlitros de cada um de GATA2, GFI1B, CFOS e ETV6.

Aspire o meio dos MEFs e adicione dois mililitros de DMEM padrão com 8 microgramas por mililitro de brometo de hexadimetrina. Em seguida, transduza cada poço de MEFs com 15 microlitros do coquetel viral e incube a 37 graus celsius durante a noite. Após 16 a 20 horas de incubação, substitua o meio em cada poço por dois mililitros de DMEM padrão fresco, suplementado com um micrograma por mililitro de DOX.

Incubar a 37 graus Celsius por três dias. No quarto dia, preparar o meio de cultura hematopoiético suplementado com hidrocortisona, fator de crescimento de células-tronco, ligante da tirosina quinase três relacionada ao MFS, interleucina três, interleucina seis e DOX. Em seguida, aspirar o meio dos MEFs e usar um mililitro de PBS para lavar as células.

Em seguida, após aspirar o PBS, adicione um mililitro de tripsina a 0,05 por cento por poço para dissociar e coletar as células. Usando o hemocitômetro, conte as células, centrifugue a 300 vezes g por cinco minutos e utilize 12 mililitros do meio hematopoético recém-preparado para ressuspender as células. Em seguida, plaque 10.000 células por poço em placas de seis poços revestidas com gelatina.

A cada seis dias, substitua o meio por meio de cultura hematopoético suplementado fresco durante todo o período de cultivo. Analise as células de acordo com o protocolo descrito no texto. Após dissecar placentas de camundongos prenhes de acordo com o protocolo descrito no texto, use dois a cinco mililitros de colagenase tipo um a 0,2 por cento em PBS com 20 por cento de FBS para lavar o tecido e, com uma agulha de 18 gauge acoplada a uma seringa de cinco mililitros, dissocie mecanicamente o tecido na solução de PBS.

Incube as células placentárias em dois a cinco mililitros de solução de colagenase a 37 graus Celsius por 1,5 hora. Em seguida, passe as células várias vezes por agulhas de 20 a 25 mm acopladas a seringas de 5 mililitros para dissociá-las mecanicamente. A seguir, filtre as suspensões de células individuais através de peneiras celulares de 70 mícrons.

Em seguida, utilizando um hemocitômetro, conte as células e irradie com 2.000 centigray volts para inativação mitótica. Adicione dez mililitros de meio de cultura hematopoético suplementado com os seguintes componentes a uma placa de dez centímetros. Coloque o filtro de 0,65 mícron diretamente sobre o meio de cultura na placa, permitindo que flutue para criar uma interface líquido-gás e reserve a placa.

Dissocie os MEFs transduzidos do dia 25 conforme demonstrado anteriormente neste vídeo e misture 33.000 dos MEFs transduzidos com 167.000 células dos agregados placentários inativados mitoticamente. Para gerar um agregado, centrifugue a mistura de células MEF e placentárias a 300 vezes g durante cinco minutos. Aspire o meio e utilize de 30 a 50 microlitros de DMEM padrão para ressuspender as células em pellet, aspirando a suspensão de células únicas em uma ponteira de pipeta não biselada de 200 microlitros.

Em seguida, com filme de parafina, tampe a ponteira da pipeta. Depois, coloque a ponteira tampada em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifugue a 300 × g durante cinco minutos para que um pellet se forme na extremidade tampada da ponteira. Remova cuidadosamente a ponteira do tubo de 15 mililitros e coloque-a na extremidade de uma pipeta P200.

Descarte o filme de parafina e extrude o pellet celular para o filtro flutuante no recipiente com meio de cultura. Incube os agregados nos filtros flutuantes a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono por quatro a cinco dias. Usando uma espátula celular, colete os agregados, combine-os e digira-os com colagenase a 0,5 por cento.

Após a dissociação, utilize dois a cinco mililitros de PBS com cinco por cento de FBS para lavar os agregados e centrifugue a 300 vezes g durante cinco minutos. Re-suspenda os agregados em 500 microlitros de DMEM sem FBS, Pen-Strep ou L-glutamina. Adicione toda a suspensão a três mililitros de meio de metilcelulose a um por cento suplementado com dez nanogramas por mililitro de Tepo, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas.

Plaque volumes iguais dessa mistura em três placas de cultura não tratadas de 35 por 10 milímetros para ensaios de UFC. Como controle, cultive agregados placentários irradiados. Finalmente, conte manualmente as colônias hematopoéticas sob microscópio após 10 a 14 dias de cultivo a 37 graus Celsius com 5 por cento de dióxido de carbono.

No processo de reprogramação de MEFs em HSCs, as células são transduzidas com fatores de transcrição conforme mostrado aqui. Após três dias de expansão e exposição ao DOX para iniciar a ativação do transgene, as células são dissociadas, divididas e cultivadas em placas recobertas com gelatina e meio hematopoético suplementado. No dia 20 em cultura, após a transdução com o meio de reprogramação, os MEFs 34/H2BGFP adotam mudanças morfológicas evidentes, incluindo uma morfologia endotelial distinta da dos MEFs.

O cultivo adicional até o dia 35 resulta na emergência de várias células redondas semelhantes a hematopoéticas a partir de intermediários semelhantes a endoteliais que são GFP positivos e apresentam coloração positiva para os marcadores hematopoéticos Sca1 e CD45. O cultivo prolongado resulta em células expressando CD45, mantendo a expressão do repórter humano CD34. Após agregação placentária, as células em cultivo adquirem potencial clonogênico e geram colônias em metilcelulose contendo diversas morfologias hematopoéticas e células semelhantes a blastos.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de executar cada etapa lentamente para não se confundir. Quaisquer erros serão difíceis de identificar até semanas após o início do reprogramamento. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de formação de células em mosaico e ensaios de células iniciadoras de cultivo de longa duração, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se as células derivadas possuem realmente função hematopoética, conforme demonstrado nos ensaios funcionais.

Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de programação de células-tronco hematopoéticas explorarem outras estratégias de reprogramação e protocolos de otimização em células sanguíneas, endoteliais e outros tipos celulares. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir um programa hemogênico em fibroblastos de camundongo, da superexpressão de fatores de transcrição e de como realizar ensaios funcionais nas células derivadas. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.