Name: Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda a reprogramar fibroblastos embrionários de rato com fatores de transcrição para induzir um programa hemogênico e gerar células precursoras hematopoéticas in vitro. Este método avança a pesquisa em hematopoiese.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do NHLBI para K.M. e I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira recebeu uma bolsa de estudos da Revson Senior Biomedical. Agradecemos ao Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility e S. D'Souza pela assistência com materiais e protocolos. Também agradecemos às instalações de Citometria de Fluxo, Genômica e Camundongos do Monte Sinai.

declaração de ética: linhas de células do rato são derivados seguindo as orientações de cuidados de animais da Icahn Escola de Medicina Monte Sinai, e deve ser feito em conformidade com qualquer instituição de acolhimento. 1. rato embrionário de fibroblastos (MEF) Isolamento de ratinhos C57BL / 6 <ol><li> Configurar o acasalamento cronometrado 13. Uma vez que um plug vaginal é visualizado, considerar este dia 0,5. </li><li> Separar as fêmeas ligados na data plugue e consultá-los no dia 10-11 para confirmar a gravidez. </li><li> No Dia 13,5-14,5 eutanásia ratos fêmeas grávidas via inalação de CO 2 seguido por deslocamento cervical. </li><li> Mergulhe abdome da fêmea grávida de 70% de etanol, dissecar a cavidade abdominal com uma tesoura esterilizada e pinças para baixo da linha média, e remover cirurgicamente os cornos uterinos contendo os embriões 14. Retire os embriões delicadamente enquanto o corte do tecido abdominal restante. NOTA: Recuperar cerca de 8 embriões com 4 em cada lado. </li><li> Coloque o útero hORNs contendo os embriões numa placa de 10 centímetros, com 5-10 ml de fosfato estéril tamponada gelada solução salina (PBS). </li><li> Com tesouras e pinças esterilizadas, fazer uma incisão ao longo dos cornos uterinos para isolar os sacos que transportam os embriões. Transferir os sacos para uma nova placa de 10 cm com 5-10 ml de PBS estéril refrigerados e colocar em gelo. </li><li> Coloque alguns dos sacos para uma nova placa de 10 cm com 5-10 ml de PBS estéril gelada. Com uma tesoura e uma pinça estéril delicadamente cortados abertos os sacos (sem cortar muito profundo), a fim de evitar a perfuração dos embriões. </li><li> Separa-se os embriões a partir da placenta, cortando o cordão umbilical. </li><li> Transferir os embriões para um novo prato de 10 cm, que inclua 5-10 ml de PBS refrigerados e deixar em gelo ao completar as dissecações restantes. </li><li> Decapitar os embriões usando uma pinça estéril. Cuidadosamente cortar a linha média do embrião usando tesouras e pinças esterilizadas, a partir da área decapitado de abrir o abdômen. Posição forceps baixo tele órgãos viscerais (incluindo o coração, fígado, pulmões e) e raspe-los para fora 15. </li><li> Corte o tecido restante em pequenos pedaços com uma tesoura e pinça e transferência para um tubo cônico de 50 ml contendo 10 ml de tripsina. </li><li> Pipetar cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL 20-30 vezes para misturar e dissociar o tecido. </li><li> Incubar a mistura de tecido e tripsina num banho de água a 37 ° C durante 45 min, agitando ocasionalmente. </li><li> Pipetar cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL durante cerca de 5 minutos para misturar os conteúdos. </li><li> Adicionar células tripsinizadas a 3X volume de padrão de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com soro bovino fetal a 10% (FBS), 10 ug / mL de penicilina / estreptomicina (P / S), e 1 mM de L-glutamina (G-GLUT) em placas de 10 cm (~ 10 mL) e a cultura a 37 ° C até à confluência (aproximadamente 2-4 dias). Cultura sobre 1-2 embriões por placa de 10 cm. NOTA: células congelar depois de placas são confluentes. As células congeladas podem ser descongeladas e passadas mais 2 vezes. As células podem ser alternativamentedividir 2 vezes antes da congelação, e então mais uma vez depois de ter sido descongelado. </li></ol> 2. produção virai <ol><li> Expandir células 293T em placas de 10 cm com 10 ml de DMEM com 10% de FBS, 1% de P / S, e 1% de L-GLUT para transfecção. <ol><li> Tripsinizar as células 293T com 2 ml de tripsina, incuba-se a 37 ° C durante 5 min, recolher as células em tubos de 15 ml, rotação a 300 xg, e placa de forma adequada (10 ml por placa de 10 cm). </li></ol></li><li> 24 h antes da transfecção, dividir confluentes placa de 10 cm de células 293T 1: 6 e 10 centímetros em sementes revestidas com gelatina (0,1% de gelatina em PBS) placas. NOTA: 4 placas por vírus será necessário. <ol><li> Para placas de revestimento em gelatina, adicionar, pelo menos, 2 ml de solução de gelatina a 0,1% para revestir o fundo de placas de 10 cm. Incubar a 37 ° C durante pelo menos 20 min. Aspirar fora gelatina antes da adição de células nas placas. </li></ol></li><li> Num tubo de 15 ml, adicionar 84 ug de plasmídeo (por exemplo GATA2, Gfi1b, cFos, ou ETV6 (sub-clonado no vect pFUW-TetOou 16) ou FUW-M2rtTA 17), psPAX2 84 ug, 42 ug e pMD2.G. Adicionar água (H 2 O) para compensar o volume de 2 ml. Prepare um tubo para cada fator (por exemplo. GATA2, Gfi1b, CFOs, ETV6 e FUW-M2rtTA). </li><li> Adicionar 250 ul de CaCl2 2M a cada tubo contendo a mistura de 2 ml de composto de 84 ug do gene escolhido (GATA2, Gfi1b, cFos, ETV6 ou FUW-M2rtTA) + 84 ug psPAX2 + 42 ug pMD2.G + H2O . </li><li> Usando uma pipeta de Pasteur inserido na pipeta-ajuda, a libertação das bolhas na 2.25 ml de ADN + H 2 O + H 2 2 CaCl mistura. À medida que as bolhas estão a ser produzido, coloque a ponta de uma pipeta P1000 contra o vidro e, lentamente, 2 ml de ejectar mM 100 N, N-bis (2-hidroxietil) -2-aminoetano salina ácido sulfónico (BES) para baixo a uma pipeta de Pasteur ml de cada vez. </li><li> Incubar todos os tubos na capa de cultura à temperatura ambiente durante pelo menos 15 min. NOTA: A 4,25 ml de uma mistura (agora ADN + H2O + 2M CaCl2 </sub&gt; + BES solução salina) fica um pouco nublado. </li><li> À medida que a mistura de incubação, meios aspirado em pratos de 293T e adicionar 10 ml de DMEM + 10% de FBS + 1 mM de L-glutamina + 25 nM de cloroquina. NOTA: Esta mídia não contém P / S. </li><li> Após pelo menos 15 min de incubação (ou até mudar o media em células 293T), adicionar a 4,25 mL de ADN + H2O + 2 M de CaCl2 BES + mistura de solução salina, gota a gota às células 293T, distribuindo uniformemente por 4 placas de células por tubo (ou seja, ligeiramente mais do que 1 ml da mistura por placa). </li><li> Incubar as placas durante a noite (O / N) a 37 ° C. </li><li> 24 horas após a incubação, substituir a mídia em todas as placas com 4 ml DMEM padrão (veja o passo 1.15). </li><li> Manter as células em uma incubadora de 32 ° C a partir de agora. </li><li> 24 horas após a etapa 2.10, recolher mídia em separado tubos de 50 ml. Substitua o material coletado de cada placa com 4 ml de DMEM padrão. NOTA: 4 placas por resultados iniciais mistura tubo em 16 ml de meio recolhidos. <ol><li> UMAepois de 12 horas de incubação, recolher mídia novamente nos mesmos tubos de 50 ml e substituir com mais 4 ml de DMEM padrão. </li><li> Após 12 horas de incubação, recolher os meios de comunicação e adicione aos mesmos tubos de 50 ml. NOTA: cada tubo agora deve conter cerca de 48 ml de meios contendo vírus. </li></ol></li><li> Para concentrar o vírus coletadas, primeiro filtro da mídia recolhidos através 0,45 filtros de ligação de baixa proteína. </li><li> Despeje a mídia filtrados contendo vírus em virais tubos concentração centrífuga (cerca de 16 ml de cada vez). </li><li> Centrifugação a 4000 xg, a 4 ° C durante 25 min e remover escoamento. NOTA: Um pequeno volume de meios concentrados e vírus será visível no filtro. </li><li> Adicionar mais 16 ml de meios contendo vírus filtrou-se para o volume de suporte + vírus concentrado remanescente no filtro e misturar por inversão do tubo. </li><li> tubo de centrifugação de novo a 4000 xg, a 4 ° C durante 25 min e descarte de fluxo. </li><li> Adicionar restantes filtradacoleção para a mídia + volume de vírus concentrado deixado no filtro e misture invertendo o tubo. </li><li> Girar mais uma vez a 4000 xg, a 4 ° C durante 10-20 minutos (dependendo do volume no filtro) e assegurar que o volume restante de meio concentrado + vírus deixado no filtro é de cerca de 1 ml. Se for maior do que 1 ml de meio concentrado + vírus permanece no filtro, girar novamente a 4.000 xg durante 1 min e repetir até 1 ml é deixado no filtro. </li><li> Alíquota de 200 ul do vírus concentrado em tubos de 1,5 ml e congelamento a -80 ° C ou utilizar imediatamente. </li></ol> 3. Reprogramação MEF <ol><li> Pré-revestimento 6 bem-placas com 0,5 ml de 0,1% de gelatina em PBS por poço, assegurando que a gelatina cobre toda a área do poço. Colocar numa incubadora a 37 ° C e incubar durante pelo menos 20 min. Após a incubação, as placas de remover e aspirar a gelatina. </li><li> MEFs placa com DMEM padrão a uma densidade de 25.000 células por poço (150.000 célulaspor placa de 6 poços) na placa de 6 poços gelatinizado (s) a partir do passo 3.1 e deixa-se repousar O / N em uma temperatura de 37 ° C incubadora. </li><li> Preparar um cocktail de vírus de 100 ul por mistura de 50 ul M2rtTA e os restantes 50 ul de uma mistura de GATA2, Gfi1b, cFos, e ETV6 (12,5 ul cada). </li><li> media aspirado de MEFs e adicionar 2 mL DMEM padrão com / ml de brometo de Hexadimetrina 8 mg. </li><li> Transduzir cada poço das placas de MEF com 15 ul de coquetel de vírus e incubar O / N a 37 ° C. NOTA: Este é o Dia 0 do processo de reprogramação. </li><li> No dia 1, após 16-20 h de incubação, à substituição de suportes com 2 ml de DMEM fresco suplementado com padrão de 1 ug / ml de DOX por poço. </li><li> Preparar meios de cultura hematopoiética suplementado com hidrocortisona (10 -6 M), 100 ng / ml de factor de células estaminais (SCF), 100 ng / ml de tirosina-quinase 3 de ligando FMS-relacionados (Flt3L), 20 ng / ml de interleucina-3 (IL- 3), 20 ng / mL de interleucina-6 (IL-6), e 1 ug / ml de DOX. </li><li> No Dia 4 aspirate meios de comunicação de cada poço e lavar as células com 1 ml de PBS por poço. </li><li> Aspirar PBS, dissociar as células com 1 ml de tripsina a 0,05% por poço e recolher as células. </li><li> Contar as células com um hemocitómetro, centrifugação a 300 xg durante 5 min, ressuspender em 12 ml de meio hematopoiéticas descrito no passo 3.7 e placa 60.000 células por placa de 6 poços em placas revestidas com gelatina a 0,1% (2 ml por poço, 10.000 células por poço ). </li><li> Substituir meios com meio de cultura fresco suplementado hematopoiéticas cada 6 dias durante a duração da cultura (35 a 36 dias). </li><li> Analisar a utilização de células intermédios ou células hematopoiéticas-like emergentes através de imuno-coloração 12, a análise FACS 8,12, qRT-PCR 12, e mRNA sequenciamento 12 para confirmar a aquisição de endotelial hegemônicos ou marcadores HSC-like e expressão gênica. </li></ol> 4. unidade de formação (UFC) Ensaios Placentário agregação e Colony em metilcelulose <ol><li> Dissecar placentas de C5 grávida7BL / 6 ratinhos como previamente descrito 18 em E12.5 e manter o tecido em gelo. </li><li> Para iniciar placenta dissociação 19, lavar tecido placentário em 2-5 mL de 0,2% de colagenase de tipo I, em PBS com FBS a 20% e mecanicamente dissociar com uma agulha 18G montada numa seringa de 5 ml por passagem da placenta e PBS através da agulha, pelo menos Três vezes. </li><li> Após dissociação mecânica, manter as células da placenta em 2-5 ml de solução de colagenase a 37 ° C durante 1,5 h. </li><li> células passagem por 20-25 agulhas G montado em 5 ml seringas várias vezes para mais mecanicamente dissociar as células da placenta. </li><li> Filtrar suspensões de células individuais através de 70 mm filtros celulares. </li><li> Contagem de células com um hemocitómetro e irradiar a 2.000 cGy para a inativação mitótico 20. </li><li> Adicionam-se 10 ml de meio de cultura hematopoiética suplementado com 100 ng / mL de SCF, com 100 ng / ml Flt3L, 20 ng / ml de IL-3, 20 ng / ml de IL-6, e 10 ng / ml de trombopoietina (TPO) com 10 cm prato. NOTA: DOX não é necessária nesta fase. </li><li> Colocar um filtro de 0,65 uM directamente em meios de cultura hematopoiética no prato, permitindo-lhe flutuar para criar uma interface líquido-gás e ajustar o prato de lado. </li><li> Dissociar dia 25 MEFs transduzidas (derivadas do passo 3.11) como descrito nas etapas 3.8-3.10 e misturar 33000 dos MEFs transduzidas com 167.000 células dos agregados da placenta a partir do passo 4.6 (1: 6, razão). </li><li> Para gerar um agregado 18,21, primeiro giro para baixo do MEF e mix de células da placenta a partir do passo 4.9 por 5 min a 300 x g. Aspirar a mídia e ressuspender as células sedimentadas em 30-50 ul de DMEM padrão, utilizando uma pipeta P200, chamando a suspensão única célula na 200 mL nonbevelled ponta da pipeta. </li><li> Ocluir a ponta da pipeta com a película de parafina. Colocar a ponta bloqueados para um tubo de centrífuga de 15 ml e girar durante 5 minutos a 300 xg de modo forma-se uma pelota no final coberto da ponta. </li><li> Remova a ponta do tubo de 15 ml com cuidado e lugara ponta na extremidade da pipeta P200. Descartar o filme de parafina e extrudir o sedimento de células sobre o filtro flutuante a partir do passo 4.8. NOTA: A placa, no máximo, 3 agregados por filtro. </li><li> Cultura os agregados que flutuam sobre os filtros de 0,65 | iM durante 4-5 dias em 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Recolher os agregados (no máximo 3 por filtro) com um raspador de células, combiná-los, e digest com 0,2% de colagenase, seguindo o mesmo protocolo, como feito com o conjunto da placenta para dissociar as células (passos 4,2-4,5). </li><li> Após a dissociação, lavar os agregados com 2-5 ml de PBS suplementado com 5% de FBS e gire as células a 300 xg durante 5 min. </li><li> Ressuspender as agregados em 500 ul de DMEM sem FBS, P / S, ou L-GLUT. Aqui esta ressuspensão e 500 ul de adicioná-lo aos 3 ml de 1% de meio de metilcelulose suplementado com 10 ng / ml de TPO, evitando-se cuidadosamente a formação de bolhas. volumes iguais placa desta mistura em placas de cultura de 3 35 x 10 mm não-tratada paraCFU ensaia 12. </li><li> Como controle, a cultura irradiada agregados da placenta sem misturar em MEFs reprogramadas 4-5 dias e coloque em ensaios CFU como descrito acima nos passos 4.7-4.16. NOTA: Estes agregados por si só não formam colônias. </li><li> Contagem das colónias hematopoiéticas manualmente ao microscópio após 10-14 dias de cultura a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Cytospin 22 pegou colônias para mostrar fenótipo morfológico de células individuais. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.

Gerando hspCs de novo a partir de células somáticas facilmente atingíveis oferece um método único para estudar a hematopoiese in vitro, e a oportunidade para potencialmente aplicar esta tecnologia para o sistema humano. Esta tradução iria gerar uma nova ferramenta para o estudo da doença hematológica humano em um prato, bem como fornecer plataformas de teste de drogas e direccionamento de genes oportunidades para o tratamento de numerosas desordens com novos agentes terapêuticos ou de transpla...

A hematopoiese é um processo complexo de desenvolvimento em que as células estaminais hematopoiéticas (HSCs) brotam endotélio hegemônicos presente numa variedade de sítios hematopoiéticas embrionárias, tais como a aorta-gônadas-Mesonefros e da placenta 1,2. A incapacidade de cultura hsc in vitro evita a análise em profundidade deste processo, bem como a aplicação clínica destes estudos. Para ultrapassar esta limitação, estudos anteriores têm tentado derivar HSCs de novo, quer por meio de diferenciação das células estaminais pluripotentes (PSCs) 3, ou plasticidade induzida em células somáticas e diferenciação dirigida utilizando meios de reprogramação 4,5. Estes estudos, no entanto, não geram células engraftable clinicamente seguras ou permitir o estudo da hematopoiese desenvolvimento definitivo &quot;em um prato.&quot; O romance de trabalho estabelecido por Yamanaka e seus colegas para gerar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de fibroblastos somática pferece um quadro de fator de transcrição (TF) estratégias superexpressão baseados em célula destino reprogramação 6,7. Este trabalho levou os pesquisadores em vários campos para gerar tipos de células de escolha através de TF reprogramação de células somáticas de fácil obtenção. O objetivo da estratégia de reprogramação descrito aqui é para induzir um processo hegemônicos a partir de células somáticas de rato usando uma abordagem de reprogramação TF base com o objetivo de traduzir esses achados para o sistema humano para reprogramar fibroblastos específicos do paciente, a fim de estudar hematopoiese humana in vitro e gerar produtos derivados de sangue específicos do paciente para a modelagem de doenças, testes de drogas e transplante de células estaminais. O primeiro passo para assegurar reprogramação adequada neste sistema de ratinho foi desenvolver uma linha repórter que serviu como uma leitura para a expressão de CD34, um marcador conhecido nas células progenitoras endoteliais e HSCs. Para fazer isso, as linhagens de camundongos transgênicos huCD34-tTA e TetO-H2BGFP foram usadas para generate rato transgénico fibroblastos embrionários duplos (MEFs), agora denotado 34 / H2BGFP, que apresentam fluorescência verde após a ativação do promotor CD34 8. Isto permitiu o rastreio de uma variedade de TFs conhecidos que sejam necessários em diferentes pontos durante a especificação e desenvolvimento hematopoiético. Começando com 18 TFs em PMX vetores retrovial (determinado através da mineração literatura e profiling de etiqueta GFP manter HSCs do descrito anteriormente 34 / H2BGFP ratos), 34 / H2BGFP MEFs foram transduzidas com todos os factores e cultivadas em AFT024 HSC-apoiando células estromais. Após a detecção de 34 / H2BGFP ativação, TFs foram posteriormente removido do cocktail reprogramação até o melhor conjunto de TFs para ativação repórter foi identificado. Após esta primeira tela, os factores foram transferidos para um sistema de vector indutível pFUW DOX para permitir a expressão controlável de TFS. Uma vez que estes dois sistemas controláveis ​​DOX são incompatíveis (34 células / H2BGFP e os vectores indutíveis pFUW), MEFs deDe tipo selvagem C57BL / 6 murganhos foram necessários. Foi também necessário para proporcionar um microambiente adequado permitir hemogenesis para prosseguir e criar progenitores clonogï¿½icas multilinhagem. Os estudos atuais que tentam reprogramar células somáticas em células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (hspCs) reuniram-se níveis variados de sucesso 9-11. Até à data, a geração de ambos rato transplantáveis ​​e hspCs humanos com a longo prazo e capacidade de repovoamento auto-renovação não foi alcançado utilizando o mesmo conjunto de FT. Neste protocolo, nós fornecemos uma descrição detalhada da estratégia previamente estabelecido para induzir reproducibly hemogenesis em MEFs. Nós demonstramos que a introdução de um conjunto mínimo de TFs (GATA2, Gfi1b, CFOs e ETV6) é capaz de instigar um programa complexo de desenvolvimento in vitro que fornece uma plataforma através da qual hematopoiese desenvolvimento e aplicação clínica de reprogramação hematopoiéticas podem ser mais bem estudadas 12.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; Filtros M</td><td>Corning</td><td>430625</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra filtros centrífugos</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS Gemini's Benchmark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas 18 G</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>20 G agulhas</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>25 G Agulhas</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo I</td><td>Sigma</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Meios mielocultos</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R & D Systems</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>Flt3L</td><td>R & D Sistemas</td><td>427-FL</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R & D Systems</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>R & D Systems</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R & D Systems</td><td>488-TO</td> Doxiciclina <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Polibreno (brometo de hexadimerina)</td><td>Sigma</td><td>AL-118</td><td></td></tr><tr><td>Durapore 0.65 &mu; Filtros de membrana M</td><td>Millipore</td><td>DVPP14250</td><td></td></tr><tr><td>Meio de metilcelulose</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>Methocult M3434</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07904</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 camundongos</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G-1890 100g</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO</td><td>Addgene</td><td>Plasmídeo #20321</td><td></td></tr><tr><td>Gata2</td><td>Origene</td><td>MR226728</td><td></td></tr><tr><td>Gfi1b</td><td>Origene</td><td>MR204861</td><td></td></tr><tr><td>cFos&nbsp;</td><td></td><td>Plasmídeo Addgene #19259</td><td></td></tr><tr><td>Etv6</td><td>Origene</td><td>MR207053</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Plasmídeo Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td> Plasmídeo <td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>FUW-M2rtTA</td><td>Plasmídeo Addgene</td><td>#20342</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm cultura pratos</td><td>Thermo Scientific</td><td>171099</td><td></td></tr></tbody></table>

reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com fatores de transcrição para induzir um programa hegemônicos

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Este protocolo detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) por meio da superexpressão de fatores de transcrição (TFs). Primeiro, projetamos uma tela repórter usando MEFs de camundongos humanos CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) duplamente transgênicos. As células CD34+ desses camundongos marcam histonas H2B com GFP e cessam a marcação após a adição de doxiciclina (DOX). Os MEFS foram transduzidos com TFs candidatos e, em seguida, observados para o surgimento de células GFP+ que indicariam a aquisição de um destino de células hematopoiéticas ou endoteliais. Começando com 18 TFs candidatos, e através de um processo de eliminação combinatória, obtivemos um conjunto mínimo de fatores que induziriam a maior porcentagem de células GFP+. Descobrimos que Gata2, Gfi1b e cFos eram necessários e a adição de Etv6 forneceu a indução ideal. Uma série de análises de expressão gênica feitas em diferentes momentos durante o processo de reprogramação revelou que essas células pareciam passar por uma célula precursora que passou por uma transição endotelial para hematopoiética (EHT). Como tal, esse processo de reprogramação mimetiza a hematopoiese do desenvolvimento "em um prato", permitindo o estudo da hematopoiese in vitro e uma plataforma para identificar os mecanismos subjacentes a essa especificação. Esta metodologia também fornece uma estrutura para a tradução deste trabalho para o sistema humano, na esperança de gerar uma fonte alternativa de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) específicas do paciente para uma série de aplicações no tratamento e estudo de doenças hematológicas.

A hematopoiese é um processo de desenvolvimento complexo que começa em vários locais embrionárias. Células endoteliais hegemônicos residem nestes locais e dar origem a HSCs via celular brotamento 23. Este processo actualmente não pode ser reproduzido pela colocação de HSCs ou precursores hematopoiéticos em cultura, que necessitam de uma metodologia para a obtenção de alguma forma destas células in vitro, quer por HSPC expansão ex vivo ou geração de novo.<...

O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

O objetivo geral deste protocolo de indução hemogênica é desencadear um processo de desenvolvimento em fibroblastos de camundongo por meio da superexpressão de fatores de transcrição para gerar células precursoras hematopoiéticas in vitro que produzam células hematopoiéticas após cultivo prolongado. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de programação hematopoiética, como, por exemplo, se é possível desenvolver um protocolo capaz de obter HSCs autênticas de novo, com potencial para múltiplas linhagens e enxerto. A principal vantagem desta técnica é que, por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição, o processo de desenvolvimento pode ser iniciado em células reprogramadas sem a necessidade de passar por um estágio intermediário pluripotente.Após o cultivo de fibroblastos embrionários de camundongo ou MEFS e a produção do vírus de acordo com o protocolo descrito, utilize gelatina a 0,1 por cento em PBS para pré-revestir placas de 6 poços. Certifique-se de que a gelatina cubra toda a área do poço. Coloque as placas no incubador a 37 graus Celsius por pelo menos 20 minutos.Em seguida, remova as placas e aspire a gelatina. Plaque os MEFs com DMEM padrão em uma densidade de 25.000 células por poço e deixe as células sedimentarem a 37 graus celsius durante a noite. Prepare um coquetel viral de 100 microlitros misturando 50 microlitros de M2RTTA e 12,5 microlitros de cada um de GATA2, GFI1B, CFOS e ETV6.Aspire o meio dos MEFs e adicione dois mililitros de DMEM padrão com 8 microgramas por mililitro de brometo de hexadimetrina. Em seguida, transduza cada poço de MEFs com 15 microlitros do coquetel viral e incube a 37 graus celsius durante a noite. Após 16 a 20 horas de incubação, substitua o meio em cada poço por dois mililitros de DMEM padrão fresco, suplementado com um micrograma por mililitro de DOX.Incubar a 37 graus Celsius por três dias. No quarto dia, preparar o meio de cultura hematopoiético suplementado com hidrocortisona, fator de crescimento de células-tronco, ligante da tirosina quinase três relacionada ao MFS, interleucina três, interleucina seis e DOX. Em seguida, aspirar o meio dos MEFs e usar um mililitro de PBS para lavar as células.Em seguida, após aspirar o PBS, adicione um mililitro de tripsina a 0,05 por cento por poço para dissociar e coletar as células. Usando o hemocitômetro, conte as células, centrifugue a 300 vezes g por cinco minutos e utilize 12 mililitros do meio hematopoético recém-preparado para ressuspender as células. Em seguida, plaque 10.000 células por poço em placas de seis poços revestidas com gelatina.A cada seis dias, substitua o meio por meio de cultura hematopoético suplementado fresco durante todo o período de cultivo. Analise as células de acordo com o protocolo descrito no texto. Após dissecar placentas de camundongos prenhes de acordo com o protocolo descrito no texto, use dois a cinco mililitros de colagenase tipo um a 0,2 por cento em PBS com 20 por cento de FBS para lavar o tecido e, com uma agulha de 18 gauge acoplada a uma seringa de cinco mililitros, dissocie mecanicamente o tecido na solução de PBS.Incube as células placentárias em dois a cinco mililitros de solução de colagenase a 37 graus Celsius por 1,5 hora. Em seguida, passe as células várias vezes por agulhas de 20 a 25 mm acopladas a seringas de 5 mililitros para dissociá-las mecanicamente. A seguir, filtre as suspensões de células individuais através de peneiras celulares de 70 mícrons.Em seguida, utilizando um hemocitômetro, conte as células e irradie com 2.000 centigray volts para inativação mitótica. Adicione dez mililitros de meio de cultura hematopoético suplementado com os seguintes componentes a uma placa de dez centímetros. Coloque o filtro de 0,65 mícron diretamente sobre o meio de cultura na placa, permitindo que flutue para criar uma interface líquido-gás e reserve a placa.Dissocie os MEFs transduzidos do dia 25 conforme demonstrado anteriormente neste vídeo e misture 33.000 dos MEFs transduzidos com 167.000 células dos agregados placentários inativados mitoticamente. Para gerar um agregado, centrifugue a mistura de células MEF e placentárias a 300 vezes g durante cinco minutos. Aspire o meio e utilize de 30 a 50 microlitros de DMEM padrão para ressuspender as células em pellet, aspirando a suspensão de células únicas em uma ponteira de pipeta não biselada de 200 microlitros.Em seguida, com filme de parafina, tampe a ponteira da pipeta. Depois, coloque a ponteira tampada em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifugue a 300 × g durante cinco minutos para que um pellet se forme na extremidade tampada da ponteira. Remova cuidadosamente a ponteira do tubo de 15 mililitros e coloque-a na extremidade de uma pipeta P200.Descarte o filme de parafina e extrude o pellet celular para o filtro flutuante no recipiente com meio de cultura. Incube os agregados nos filtros flutuantes a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono por quatro a cinco dias. Usando uma espátula celular, colete os agregados, combine-os e digira-os com colagenase a 0,5 por cento.Após a dissociação, utilize dois a cinco mililitros de PBS com cinco por cento de FBS para lavar os agregados e centrifugue a 300 vezes g durante cinco minutos. Re-suspenda os agregados em 500 microlitros de DMEM sem FBS, Pen-Strep ou L-glutamina. Adicione toda a suspensão a três mililitros de meio de metilcelulose a um por cento suplementado com dez nanogramas por mililitro de Tepo, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas.Plaque volumes iguais dessa mistura em três placas de cultura não tratadas de 35 por 10 milímetros para ensaios de UFC. Como controle, cultive agregados placentários irradiados. Finalmente, conte manualmente as colônias hematopoéticas sob microscópio após 10 a 14 dias de cultivo a 37 graus Celsius com 5 por cento de dióxido de carbono.No processo de reprogramação de MEFs em HSCs, as células são transduzidas com fatores de transcrição conforme mostrado aqui. Após três dias de expansão e exposição ao DOX para iniciar a ativação do transgene, as células são dissociadas, divididas e cultivadas em placas recobertas com gelatina e meio hematopoético suplementado. No dia 20 em cultura, após a transdução com o meio de reprogramação, os MEFs 34/H2BGFP adotam mudanças morfológicas evidentes, incluindo uma morfologia endotelial distinta da dos MEFs.O cultivo adicional até o dia 35 resulta na emergência de várias células redondas semelhantes a hematopoéticas a partir de intermediários semelhantes a endoteliais que são GFP positivos e apresentam coloração positiva para os marcadores hematopoéticos Sca1 e CD45. O cultivo prolongado resulta em células expressando CD45, mantendo a expressão do repórter humano CD34. Após agregação placentária, as células em cultivo adquirem potencial clonogênico e geram colônias em metilcelulose contendo diversas morfologias hematopoéticas e células semelhantes a blastos.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de executar cada etapa lentamente para não se confundir. Quaisquer erros serão difíceis de identificar até semanas após o início do reprogramamento. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de formação de células em mosaico e ensaios de células iniciadoras de cultivo de longa duração, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se as células derivadas possuem realmente função hematopoética, conforme demonstrado nos ensaios funcionais.Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de programação de células-tronco hematopoéticas explorarem outras estratégias de reprogramação e protocolos de otimização em células sanguíneas, endoteliais e outros tipos celulares. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir um programa hemogênico em fibroblastos de camundongo, da superexpressão de fatores de transcrição e de como realizar ensaios funcionais nas células derivadas. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

reprogramming-mouse-embryonic-fibroblasts-with-transcription-factors

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo mostra o procedimento para gerar células-tronco pluripotentes induzidas usando lentivírus induzível que expressam Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4.

Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

O Stemgent induzível Dox Mouse Set Lentivirus TF pode reprogramar fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) para pluripotentes induzidas da haste (iPS) células. Aqui demonstramos o protocolo para DOX induzível-expressão de fatores de reprogramação em ratos transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc para gerar colônias iPS que expressam marcadores comuns MES pluripotência.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

O fibroblasto embrionário de camundongo pode ser reprogramado em células-tronco pluripotentes induzidas com baixa eficiência pela expressão forçada dos fatores de transcrição Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Os raros intermediários da reação de reprogramação são FACS isolados por meio de marcação com anticorpos contra os fabricantes de superfície celular Thy-1.2, Ssea-1 e Epcam.

Marcador de superfície celular Purificação Mediada de iPS Intermediários celulares a partir de um modelo Reprogramável mouse

Este protocolo descreve a indução eficiente de endotélio hemogênico e progenitores hematopoiéticos multipotenciais a partir de células-tronco pluripotentes humanas por meio da expressão forçada de fatores de transcrição.

A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a geração e quantificação de diversos subtipos cardíacos reprogramados usando uma entrega mediada por retrovírus de Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Aqui nós apresentamos um método robusto para reprogramar fibroblastos embrionários primários em cardiomyocytes funcional através de superexpressão de GATA4 Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) juntamente com a inibição da sinalização do TGF-β. Nosso protocolo gera cardiomyocytes bater tão cedo quanto pós-transdução de 7 dias com até 60% eficiência.

Supressão de sinalização pró-fibróticos potencializa mediada por fator de reprogramação de fibroblastos embrionários de rato em Cardiomyocytes induzida

Aqui apresentamos nosso protocolo para produzir induzido eritroide progenitores (iEPs) de fibroblastos adulto de rato usando orientada por factor de transcrição direta linhagem reprogramação (DLR).

Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

Este protocolo demonstra a indução de um programa hemogenic em fibroblastos dérmicos humanos pela expressão forçada dos fatores de transcrição GATA2, GFI1B e FOS para gerar células-tronco e progenitoras hematopoiéticas.

Reprogramação hemogénica de fibroblastos humanos pela expressão forçada de fatores de transcrição

A validação experimental da atividade do intensificador é melhor abordada pela análise de perda de função. Apresentado aqui é um protocolo eficiente que usa deleção mediada por CRISPR / Cas9 para estudar a regulação específica do alelo da transcrição gênica em células F1 ES que contêm um genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos

células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC) derivam de células endoteliais especializadas (hegemônicos) durante o desenvolvimento, mas pouco se sabe sobre o processo pelo qual algumas células endoteliais especificar a tornar-se sangue formando. Nós demonstramos um método baseado citometria de fluxo que permite o isolamento de células endoteliais em simultâneo hegemônicos e HSPC de tecidos embrionários de murídeo.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

Aprenda a reprogramar fibroblastos embrionários de rato com fatores de transcrição para induzir um programa hemogênico e gerar células precursoras hematopoéticas in vitro. Este método avança a pesquisa em hematopoiese.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

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