Medindo a atividade enzimática de Lactase no laboratório de ensino
6 de agosto de 2018
A atividade enzimática da lactase é essencial para o processamento catabólico de lactose o dissacarídeo. Aqui, a atividade da lactase encontrado em suplementos dietéticos é analisada usando um ensaio colorimétrico. Isto fornece aos alunos uma plataforma experimental para a compreensão da atividade da lactase e enzima cinética.
Este método é uma ferramenta útil para apresentar aos alunos os conceitos que regem as reações enzimáticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é adequada para alunos com muito pouca experiência em laboratório úmido, fornecendo resultados robustos para os alunos observarem e interpretarem. Para iniciar o protocolo, rotule uma suspensão de tubo de 15 mililitros.
Esmague um comprimido de lactase contendo 200 miligramas de enzima em um pó uniforme usando um almofariz e pilão. Coloque o pó resultante no tubo rotulado e ressuspenda-o em 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato 100 milimolar, ou PBS. Vortex a solução por um minuto para maximizar a extração da enzima.
Em seguida, transfira um mililitro da suspensão para um tubo de 1,5 mililitro e gire a amostra por um minuto a 10.000 vezes G para sedimentar as partículas sólidas. Transfira 500 microlitros do sobrenadante para um tubo limpo de 1,5 mililitro rotulado com extrato de lactase. Coloque 390 microlitros de PBS 100 milimolares em um tubo de 1,5 mililitro rotulado como reação A. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução ONPG de cinco milimolares e misture bem por vórtice.
Adicione 10 microlitros de extrato no tubo de reação A e vórtice o conteúdo. Observe a mistura de reação frequentemente por cinco minutos e observe quaisquer alterações colorimétricas da solução. Configure dois tubos de 1,5 mililitro, um rotulado na reação B, um controle rotulado.
Adicione 390 microlitros de PBS 100 milimolares ao tubo B de reação, 400 microlitros de PBS 100 milimolares ao tubo de controle e, em seguida, adicione 100 microlitros de ONPG de cinco milimolares a cada tubo. Misture o conteúdo por vórtice. Adicione 10 microlitros de extrato de lactase ao tubo de reação B, misture por vórtice e deixe a reação prosseguir por um minuto à temperatura ambiente.
Decorrido um minuto, adicione 500 microlitros de carbonato de sódio molar a ambos os tubos para inibir a enzima lactase aumentando o pH, interrompendo a reação. Transfira 500 microlitros de cada tubo para cubetas de espectrofotômetro limpas e meça a absorbância em 420 nanômetros. Configure três tubos de controle e três tubos de reação e rotule-os quatro graus Celsius, temperatura ambiente e 37 graus Celsius.
Após a adição do extrato enzimático, incube um tubo no gelo, um em temperatura ambiente e outro a 37 graus Celsius em banho-maria pré-aquecido por um minuto. Em seguida, pare a reação adicionando 500 microlitros de carbonato de sódio molar a cada tubo. Meça a absorbância em 420 nanômetros para cada tubo.
Registre os valores, subtraindo o valor de controle do valor da reação em cada caso. Usando o protocolo, o controle permanece claro enquanto a solução de reação contendo extrato do comprimido de lactase fica amarela à medida que o ONPG é hidrolisado, liberando ortonitrofenol. Após a análise das amostras usando o espectrofotômetro, a produção de ortonitrofenol é menor quando a reação é incubada em gelo e mais alta quando a reação é realizada a 37 graus Celsius.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter as reações na temperatura apropriada antes de adicionar o extrato enzimático.
Visão Geral
Este artigo apresenta um ensaio colorimétrico para medir a atividade enzimática da lacase, que é crucial para a digestão da lactose. O método é projetado para estudantes com experiência mínima em laboratório, permitindo que observem e interpretem efetivamente a cinética enzimática.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Cinética enzimática
- Educação em técnicas de laboratório
Fundo
- A lacase é uma enzima que quebra a lactose em glicose e galactose.
- Compreender a atividade enzimática é fundamental em bioquímica e campos relacionados.
- Ensaios colorimétricos fornecem uma representação visual das reações enzimáticas.
- Este método é acessível para estudantes com experiência laboratorial limitada.
Propósito do Estudo
- Introduzir os estudantes à cinética enzimática através de um experimento prático.
- Fornecer um método confiável para medir a atividade da lacase.
- Aprimorar a compreensão dos fatores que afetam as reações enzimáticas.
Métodos Utilizados
- Preparação de extrato de lacase a partir de suplementos dietéticos.
- Medição colorimétrica da produção de orto nitrofenol.
- Comparação da atividade enzimática em diferentes temperaturas.
- Uso de espectrofotometria para quantificar mudanças de absorção.
Principais Resultados
- A mistura da reação torna-se amarela à medida que o ONPG é hidrolisado pela lacase.
- A atividade enzimática é mais alta a 37 graus Celsius e mais baixa no gelo.
- Amostras de controle permanecem claras, confirmando a especificidade do ensaio.
- Os resultados demonstram o impacto da temperatura na cinética enzimática.
Conclusões
- O ensaio colorimétrico ilustra efetivamente a atividade da lacase.
- Este método é adequado para fins educacionais em bioquímica.
- Compreender a cinética enzimática é essencial para futuros estudos em processos metabólicos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This educational protocol demonstrates a foundational enzyme activity assay using lactase, a therapeutically relevant target in gastrointestinal disorders. The colorimetric method provides a scalable, reproducible approach for teaching enzyme kinetics principles applicable to early-stage target validation and assay development in biopharma R&D. By linking enzymatic function to a clinically significant substrate (ONPG), the assay supports mechanistic de-risking and predictive confidence in enzyme-targeted therapeutic strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lactase enzyme function and substrate specificity, supporting target hypothesis testing in gastrointestinal disease models.
- Operational Value: Uses commercially available lactase from dietary supplements, offering a low-cost, accessible system for preliminary target engagement studies.
- Predictive Value: Quantitative absorbance measurements at 420 nm allow assessment of enzyme activity under varying conditions, informing structure-activity relationships and lead candidate screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: The ONPG-based colorimetric reaction produces a quantifiable yellow product (ortho-nitrophenol), enabling high-throughput compatible readouts for enzyme inhibition or activation screening.
- Reproducibility: Standardized extraction from tablets and controlled incubation conditions (ice, room temp, 37°C) ensure consistent results across replicates, supporting assay robustness.
- Scalability: Simple tube-based format with spectrophotometric detection allows adaptation to multi-well platforms for compound library screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Lactase deficiency is directly linked to lactose intolerance, making this assay a relevant tool for evaluating enzyme replacement therapies or dietary interventions.
- Translational Continuity: Temperature-dependent activity profiling (lowest on ice, highest at 37°C) mirrors physiological conditions, aiding in the prediction of in vivo enzyme behavior.
- Mechanistic De-risking: Clear differentiation between reaction and control tubes confirms assay specificity, reducing false-positive risks in downstream therapeutic validation.
Pipeline & Workflow Integration
The lactase activity assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation through functional enzyme measurement and enabling assay development for screening campaigns focused on gastrointestinal targets.
- Discovery Biology: Measures lactase-mediated hydrolysis of ONPG to assess enzyme function, supporting biological de-risking of lactase as a therapeutic target.
- Screening: Produces quantitative, colorimetric outputs suitable for evaluating modulator effects in enzyme-focused screening workflows.
- Analytics: Spectrophotometric measurement at 420 nm provides objective data for comparing enzymatic activity across conditions, enabling data-driven hit selection.
- Translational Research: Links enzyme activity to lactose metabolism, connecting in vitro findings to clinical relevance in malabsorption disorders.
- Enterprise Reuse: Protocol uses standard lab equipment (vortex, centrifuge, spectrophotometer), facilitating broad adoption across discovery and preclinical teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into enzyme-substrate interactions, enhancing target confidence and reducing ambiguity in early target validation.
- Operational Value: Employs robust, standardized steps (tablet extraction, centrifugation, temperature-controlled incubation) ensuring reproducibility and minimal variability.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions by delivering clear, quantitative activity data that reduces reliance on indirect or surrogate markers.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lactase-targeted interventions based on empirical activity profiles under physiologically relevant conditions.
Implementation Considerations
- Requires basic biochemical competencies in enzyme handling, spectrophotometry, and solution preparation.
- Depends on access to a spectrophotometer capable of absorbance measurement at 420 nm and a centrifuge for supernatant clarification.
- Necessitates standardization of extract preparation and reaction timing to ensure consistent results across users and batches.
- Adaptation to other enzymes may require substrate and buffer optimization, as ONPG specificity is limited to galactosidase activity.
- pH shift via sodium carbonate addition is critical for reaction termination; incomplete quenching may affect absorbance accuracy.
