Name: Medindo a atividade enzimática de Lactase no laboratório de ensino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Aprenda a medir a atividade enzimática da lactase usando ensaio colorimétrico em laboratório educacional. Este método acessível permite que estudantes observem cinética enzimática e compreendam fatores que afetam reações.

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PAL foi financiado por um Parkinson UK Research Fellowship (grant F1002). Este trabalho foi apoiado por um novo investigador MRC Research Grant (Sr/L010933/1) e pelo programa de MRC concede senhor/N026004/1 para PAL e pela bolsa de estudo BBSRC BB/M017222/1 a jato. Agradecemos a coorte de 2014-15 de aposentado parte 1 alunos da Universidade de Reading para tomar parte na primeira iteração deste coortes prático e subsequentes para seus comentários e sugestões.

Nota: O protocolo abaixo foi desenvolvido para ser realizado ao longo de duas horas (incluindo a conclusão de planilhas de classe) em um laboratório de ensino purpose-built. As etapas experimentais foram deliberadamente colocar juntos para excluir a análise mais detalhada da cinética enzimática (realizada no âmbito deste curso usando o modelo de dados); no entanto — conforme observado na discussão — o protocolo fornece um modelo para análises mais avançadas, dependendo do tempo, instalações e o nível de realização.
SEGURANÇA: Este prático deve ser efectuado de acordo com as regras da prática boa de laboratório químico (GCLP) — equipamento de protecção pessoal, incluindo o casaco de laboratório afivelados, luvas descartáveis e óculos de segurança deve ser usado em todos os momentos no laboratório .
1. extrair a enzima
<ol><li>Esmaga um comprimido de lactase, contendo 200 mg de enzima, para um mesmo pó usando um almofariz e um pilão.</li>
	<li>Coloque o pó resultante em um tubo de 15 mL rotulados de "suspensão" e ressuspender em 10 mL de soro de 100 mM tamponado fosfato (PBS).</li>
	<li>Vórtice para 1 min maximizar a extração da enzima.</li>
	<li>Transferi 1 mL da suspensão para um tubo de 1,5 mL centrífuga e centrifugar por 1 min a 10.000 x g de partículas sólidas de sedimentos.</li>
	<li>Transferi 500 µ l do sobrenadante para um tubo limpo 1,5 mL rotulado "Extrato da Lactase".</li>
</ol>2. observar a reação colorimétrica
<ol><li>Lugar 390 µ l de PBS a 100 mM em um tubo de 1,5 mL rotulados "A reação".</li>
	<li>Adicione 100 µ l de solução ONPG 5mm e misture bem, num Vortex. Atenção: Esta prática usa orto-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) como um substituto para a lactose. Desde ONPG é um composto fenólico, devem ser manuseado com cuidado. Em caso de contacto com a pele com ONPG, a pele exposta deve ser lavada imediatamente. Todos os derramamentos devem ser limpou imediatamente com toalhas de papel para ser escoado o fluxo adequado de resíduos.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de extrato para o tubo de reação A e misture bem, num Vortex.</li>
	<li>Observar a mistura de reação por 5 minutos e observe quaisquer alterações colorimétricas para a solução.</li>
</ol>3. medir a atividade da enzima
<ol><li>Configurar dois tubos de 1,5 mL: um rotulado "Reação B", uma marcada "controle".</li>
	<li>Adicionar 390 µ l de PBS a 100 mM para a reação do tubo B, 400 µ l de PBS de 100 mM para o tubo de controle e em seguida, adicionar 100 µ l de ONPG de 5 mM a cada tubo.</li>
	<li>Misture o conteúdo num Vortex.</li>
	<li>Adicionar 10 µ l de extracto de lactase no tubo de reação B, misturar vortexing e permitir a reação proceder para 1 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Decorrido 1 min, adicione 500 µ l de carbonato de sódio 1 M para ambos os tubos para inibir a enzima lactase, aumentando o pH, encerrando assim a reação.</li>
	<li>Transferir 500 µ l de cada tubo em cubetas de espectrofotômetro limpo e medir a absorbância a 420 nm, utilizando o Espectrofotômetro.</li>
	<li>Observe a absorvância para reação B e amostras de controle e em seguida, subtrair o valor do controle do valor de reação para derivar a mudança de absorbância devido à hidrólise de ONPG na presença da enzima activa.</li>
</ol>4. efeito da temperatura na atividade enzimática
<ol><li>Configurar o controle de três tubos e três tubos de reação conforme descrito na seção 3 e rotular estes "4 ° C", "Temperatura ambiente" e "37 ° C".</li>
	<li>Após a adição da enzima extrair, incubar um tubo no gelo, um em temperatura ambiente e um a 37 ° C (em um banho de água pré-aquecida).</li>
	<li>Permitir que as reações prosseguir por 1 min e então terminar a reação adicionando 500 µ l de carbonato de sódio 1 M para cada tubo.</li>
	<li>Medir a absorbância a 420 nm para cada tubo, conforme descrito na seção 3. Registre os valores, subtraindo o valor do controle do valor de reação em cada caso.</li>
</ol>

<ol><li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerg%2C+JM+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 8th, Palgrave Macmillan. (2015).</li>
<li>Jittam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+seaweed+enzyme-catalyzed+bromination+of+bromophenol+red%3A+An+inquiry-based+kinetics+laboratory+experiment+for+undergraduates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).</li>
<li>Troelsen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult-type+hypolactasia+and+regulation+of+lactase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression.</a> Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).</li>
<li>Juers, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+view+of+the+action+of+Escherichia+coli+%28lacZ%29+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase.</a> Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).</li>
<li>Plimmer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+presence+of+lactase+in+the+intestines+of+animals+and+on+the+adaptation+of+the+intestine+to+lactose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose.</a> Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).</li>
<li>Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+citric+and+alpha-ketoglutaric+acids+in+the+mammalian+body%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body.</a> The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).</li>
<li>Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactose+intolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Lactose intolerance.</a> Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).</li>
<li>Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+differentiation+of+congenital+lactase+deficiency+from+adult-type+hypolactasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia.</a> Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).</li>
<li>Swallow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+lactase+persistence+and+lactose+intolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of lactase persistence and lactose intolerance.</a> Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).</li>
<li>Enattah, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+introduction+of+two+lactase-persistence+alleles+into+human+populations+reflects+different+history+of+adaptation+to+milk+culture%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture.</a> American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).</li>
<li>Lowe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rapid+detection+of+lactose+fermentation+in+paracolon+organisms+by+the+demonstration+of+beta-D-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Laboratory+Technology%22%5BJournal%5D)">The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase.</a> Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).</li>
<li>Russo, S. F., Moothart, L. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed063p242">Kinetic study of the Enzyme Lactase.</a> Journal of Chemical Education. 63, 242(1986).</li>
</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Um detalhado conhecimento e compreensão das enzimas, reações enzimáticas e cinética enzimática é necessária para uma vasta gama de tópicos abrangendo biologia, biomedicina e farmacologia. O protocolo descrito acima usa lactase como um exemplo de uma enzima relevante para a saúde humana, para demonstrar reações enzimáticas, fornecendo as competências-chave que podem ser usadas em experimentos de laboratório-baseado mais avançados.
Este protocolo foi deliberadamente concebido para ser tão robusto como possíveis, permitindo que os estudantes com pouca ou nenhuma experiência de laboratório molhado para produzir resultados interpretáveis em um curto espaço de tempo. No ano letivo de 2014/2015 da faculdade de farmácia da Universidade de Reading, um total de 144 estudantes, organizados em grupos de 3, realizado o experimento "medindo lactase", com todos os grupos capazes de detectar algum nível de atividade enzimática de tablet de lactase extratos.
Há uma série de passos críticos no presente protocolo. Em primeiro lugar, é essencial que a extração inicial seja eficiente, permitindo que a solubilização de suficiente enzima activa para análises subsequentes. Em nossa experiência, primeiro ano estudantes podem alcançar isto seguindo o protocolo descritos; no entanto algumas orientações de manifestantes de laboratório era necessária neste momento. Embora parece um ponto óbvio, um fator chave no sucesso deste protocolo é a capacidade de cuidadosamente medir volumes, corretamente rotular tubos e siga as instruções. Enquanto um certo nível de proficiência pode ser assumido por muitos alunos, monitoramento cuidadoso e um pedido claro para que os alunos pedir ajuda no caso em que eles não tem certo de o que fazer em seguida fornece a maior probabilidade de um ensaio bem sucedida.
Avaliação de estudante pode ser efectuada em-classe planilha (disponível como material suplementar), pedindo os alunos observar dados de experimentos, comentário sobre seus resultados e link para informações de plano de fundo/leitura do material da palestra, ou por mais detalhada, sem avaliação de classe com o modelo de dados fornecido permitindo análises cinéticas ser tentada e avaliada.
O protocolo apresentado aqui é um exemplo simples de um ensaio de atividade de lactase sob condições de laboratório de ensino, e há muitas oportunidades para aumentar a complexidade do experimento para permitir análises mais avançadas. Em particular, o protocolo apresentado fornece uma introdução ao conceito de cinética enzimática, mas não permite a análise cinética de dados experimentais. Como tal, recomendamos Visualizar o protocolo descrito como um modelo inicial para classes, com os detalhes precisos, adaptados para atender os objetivos específicos e talentos da coorte estudante realizar os experimentos. Exemplos de experimentos prolongados poderiam incluir: repetidas medições em diferentes temperaturas, usando concentrações de substrato diferentes para permitir a análise estatística, análise cinética de dados (apropriados para estudantes de bioquímica/majors), começando com vários comprimidos diferentes e permitindo que os alunos a avaliar diferente atividade da enzima em cada um (com a adição de tabuletas controle, apropriadas para estudantes de ciência forense/majors), avaliação do impacto de desnaturação térmica ou realização de competição experiências por adição de lactose ou inibidores de lactase (tabela 1). Um protocolo detalhado para análise cinética de lactase já havia sido publicado12.
Uma força importante deste protocolo é que ele combina uma introdução básica à cinética de enzimologia e enzima com um estudo de caso da vida real da enzimologia na medicina. Isso faz com que este laboratório experiência de particular relevância para os estudantes de medicina, farmácia, ciências biomédicas e assuntos relacionados. Importante, o fato de que haja uma condição médica séria e uma questão dietética mais generalizada associada com catabolismo à lactose fornece a oportunidade de criar uma vasta gama de questões éticas e médicas com os alunos. Isto poderia incluir as questões que envolvem testes genéticos para condições médicas e associado a discussões relacionadas a terapia genética e aconselhamento genético, bem como a utilização e venda de suplementos medicinais. Uma limitação importante é que o protocolo não permite a estimativa precisa da concentração de enzima, devido às matérias-primas usadas para a extração. Uma modificação para dar conta disto, no entanto, seria usar a enzima de grau reagente para o ensaio. Importante, isto também permitiria um cálculo mais preciso da cinética para a enzima lactase.
Em conclusão, análise da atividade da lactase em um laboratório de ensino ambiente fornece uma introdução robusta, atraente e interessante para o campo da biologia de enzima para fase inicial estudantes universitários.

As enzimas são um tipo especializado de proteína que agem como catalisadores biológicos, por reações químicas na vida organismos1. A ação de enzimas é fundamental para a vida, fornecendo energia, eliminação de resíduos e permitindo que os organismos funcionar. Enzimas de compreensão é, portanto, fundamental para uma compreensão completa da vida. Esse conhecimento é essencial para uma grande variedade de programas de grau de nível de Universidade, variando de ciências médicas de biologia. Enquanto um fundo detalhado desde princípios de catálise até modelos teóricos da atividade da enzima pode ser fornecido aos estudantes utilizando palestras e material de leitura, as propriedades de reacções enzimáticas são melhor compreendidas pelas mãos na experiência prática de enzimas em ação como previamente demonstraram2. Este protocolo fornece um simples para seguir o paradigma experimental para medir a atividade da enzima em condições de laboratório, utilizando lactase como um exemplo de uma enzima com uma actividade relevante para a saúde e nutrição humana.
A lactase hidrolase glicosídica (CE-3.2.1.23/26) é uma enzima de central importância nutricional para mamíferos3. A atividade da lactase é altamente conservada através da evolução e deriva da família de enzimas beta-galactosidase — uma família presente de Escherichia coli através de Homo sapiens (Figura 1, PDB 1JZ8)4. A importância fundamental da lactase num cenário nutricional humano decorre de seu papel em permitir que a quebra da lactose em seus componentes monossacarídeos constituintes, que podem ser usados para gerar energia no corpo. Lactase catalisa a hidrólise da ligação glicosídica em lactose dissacarídeo, liberando a galactose e a glicose (Figura 2)5. Esses monossacarídeos são usados principalmente para a geração de adenosina trifosfato (ATP) através do ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa6. Durante o desenvolvimento infantil e neonato, lactase é altamente expresso no sistema digestivo humano, quebrando à lactose recebida do leite materno de que lactose é o componente primário de hidrato de carbono e uma das principais fontes de nutrição durante os primeiros anos 7. a importância médica de lactase é destacada por deficiência de lactase congênita (CID), uma rara condição autossômica recessiva, causada por mutações no gene da lactase (LCT) que codifica para a enzima de lactase8. Recém-nascidos com CID apresentam pouca atividade de lactase, assim eles não podem ser alimentados com leite materno, qualquer outro tipo de leite ou fórmula que contenha lactose.
Durante a infância, expressão de lactase normalmente é reduzida; no entanto, esta redução após o desmame varia geograficamente, com aproximadamente 35% dos adultos em todo o mundo continua a expressar a enzima9. Expressão sustentado de lactase, conhecido como persistência da lactase, permite que indivíduos continuar a digerir leite e produtos lácteos de uma variedade de fontes. Por outro lado, a perda de expressão de lactase pode levar à intolerância à lactose, também conhecido como adulto-tipo hypolactasia (ATH), resultante de uma incapacidade de quebrar a lactose no intestino. ATH é caracterizada por uma compilação acima de lactose no cólon após a ingestão de lactose, contendo produtos alimentares. No cólon, a lactose acumulada é fermentada pela fauna microbiana do intestino, liberando gases incluindo hidrogênio, metano e dióxido de carbono. A produção desses gases em indivíduos com deficiências de enzima lactase promover distensão abdominal, flatulência aumentada, dor, náusea e borborygmi (rumbling estômago)7. Aumento dos níveis de lactose no tracto digestivo também pode levar a fezes soltas.
O controle da expressão do gene LCT é modulado por polimorfismos localizados em intrões do gene MCM6 nas proximidades. Indivíduos com expressão sustentado de lactase carregam polimorfismos que funcionam como potenciadores distais fortes para a expressão do gene LCT , compensando assim o normal no Regulamento da transcrição de LCT durante o desmame e, consequentemente, sustentar a expressão de lactase na idade adulta3. Polimorfismos de potenciador sugeridos que foram selecionadas positivamente após a domesticação do gado e camelos no Oriente Médio há mais de cinco mil anos de9,10.
Os sintomas resultantes de ATH podem ser gerenciados por reduzir a ingestão de lactose, por exemplo, removendo produtos lácteos da dieta. Uma abordagem alternativa para ATH e a abordagem de escolha para CID, é o uso de suplementos de lactase, amplamente disponíveis em farmácias. Estes suplementos fornecem lactase isolado de uma variedade de fontes, incluindo leveduras e bactérias, em um formulário líquido ou comprimido-based que pode ser tomado com ou adicionado à lactose contendo alimentos. O suplemento vai hidrolisar uma proporção de lactose presente nos alimentos de produtos de glicose e galactose, assim permitindo a sua absorção e evitar o acúmulo de substrato de lactose não digerida no intestino.
Baseado no uso de suplementos de lactase, como uma dieta ajuda, nós desenvolvemos uma experiência de laboratório de enzimologia simples apropriada para primeiro ano biomédica ciência ou farmácia estudantes. Este experimento de laboratório aproveita-se de suplementos de lactase comercialmente disponível e usa orto-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) para fornecer um ponto de extremidade colorimétrico para medir a clivagem das ligações glicosídicas por lactase ( Figura 3)11. ONPG atua um substrato artificial para a lactase, que quando submetidos à hidrólise por esta enzima produz a D-galactose e orto-nitrofenol. O último produto tem uma cor amarela, absorve luz no comprimento de onda de 420 nm. Através da quantificação quaisquer alterações em absorvância a 420 seguinte nm a exposição de ONPG a lactase, é possível estimar a atividade desta enzima. Este experimento de laboratório fornece uma demonstração de atividade enzimática hidrolase. Construindo em repetições adicionais e realização de ensaios em diferentes condições, é possível incorporar mais sofisticadas análises de cinética enzimática, proporcionando um valioso exemplo de vida real de enzimas em ação relevante para a saúde humana.

<table><tbody><tr><td>Comprimido de lactase</td><td>Lamberts</td><td>8511-60</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (em pó)</td> <td>Sigma</td><td>P3813</td><td>Dissolvido em água deionizada até uma concentração final de 100 mM</td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Sigma</td><td>N1127</td><td>Dissolvido em água deionizada até uma concentração final de 5 mM</td></tr><tr><td>Carbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>451614</td><td>Dissolvido em água deionizada até uma concentração final de 1 M</td></tr><tr><td>Água desionizada</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pilão e almofariz</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Jenway 6315</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Cuvetes</td><td>Jenway</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Vortex genie 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balde de gelo</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balanças</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medindo a atividade enzimática de lactase no laboratório de ensino

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Compreender como funcionam as enzimas e isto aos exemplos da vida real, são fundamental para uma ampla gama de graduação em ciências biológicas e biomédicas. Tão fácil de seguir protocolo foi desenvolvido para estudantes de graduação de farmácia primeiros ano e fornece uma introdução de nível básico de reacções enzimáticas e procedimentos analíticos para análise enzimática. A enzima de escolha é a lactase, como este representa um exemplo de uma enzima disponível comercialmente relevante para a prática de doença humana/farmacêutica. Lactase é extraído de comprimidos de suplemento dietético e avaliados usando um ensaio colorimétrico baseado a hidrólise de um substrato artificial para lactase (Orto-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside, ONPG). Lançamento do Orto-nitrofenol após a clivagem hidrolítica de ONPG pela lactase é medido por uma alteração na absorbância a 420 nm e o efeito da temperatura sobre a reação enzimática é avaliada por realizar a reação no gelo, à temperatura ambiente e em 37 ° C. Análise mais avançada pode ser implementada usando este protocolo, avaliar a atividade da enzima em condições diferentes e usando diferentes reagentes.

Resultados representativos para a seção 2 do protocolo são mostrados na Figura 4A. A reação de controle, na ausência da enzima lactase, permanece clara enquanto a solução de reação, contendo extrato do comprimido de lactase, fica amarela como ONPG é hidrolisado liberando orto- nitrofenol. Figura 4B mostra a quantificação utilizando unidades arbitrárias da secção 4 do protocolo, seguir análise de amostras usando o Espectrofotômetro. Produção de orto-nitrofenol é mais baixa quando a reação é incubada no gelo e mais alto quando a reação é realizada a 37 ° C.
<img alt="Diagrama de estrutura de proteínas, destacando sítio ativo; modelagem molecular para análise de ligação." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1 : Escherichia coli beta-galactosidase. (A) estrutura de cristal da beta-galactosidase de Escherichia coli, mostrando a estrutura tetramérica da ativo complexo. (B) Allolactose (mostrado em vermelho) ligado ao sítio ativo da beta-galactosidase. Imagens geradas a partir de PDB 1JZ84. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de reação de hidrólise da lactose; a lactase converte a lactose em D-galactose e D-glicose." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2 : Acção enzimática de lactase. Hidrólise da lactose por lactase para produzir beta-D-galactose e beta-D-glicose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de reação de hidrólise enzimática: ONPG para D-galactose e Orto-nitrofenol por lactase." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3 : Hidrólise de orto-nitrofenol - beta -D-galactopyranoside. Hidrólise ONPG pela lactase para produzir beta-D-galactose e orto-nitrofenol (que é na cor amarela), que permite a estimativa da atividade da lactase de medição de absorbância a 420 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Experiência de espectrofotometria: cubetas, tabela comparativa de dados de absorbância e gráfico de impacto de temperatura." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4 : Hidrólise ONPG. Resultados representativos de hidrólise ONPG, mostrando tubos de controle e reação (A) e dados representativos da secção 4 do protocolo registrados em planilhas em sua classe, mostrando a absorvância cru em unidades arbitrárias em 420 nm, corrigida para o fundo e em três temperaturas diferentes (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Condição experimental</td>
			<td>Variáveis experimentais</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura</td>
			<td>0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentração de substrato</td>
			<td>0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inibição competitiva</td>
			<td>à lactose ONPG além de 0 mM, 1 mM, 5 mM ou 10 mM 5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dependência do tempo</td>
			<td>0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desnaturação térmica</td>
			<td>Extrato da lactase aquecido a 100 ° C durante 10 min antes de ensaio</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: potencial estendido condição experimental. Sugere-se experiências estendidas, a efectuar em triplicado, investigar aspectos específicos da biologia do lactase.

A atividade enzimática da lactase é essencial para o processamento catabólico de lactose o dissacarídeo. Aqui, a atividade da lactase encontrado em suplementos dietéticos é analisada usando um ensaio colorimétrico. Isto fornece aos alunos uma plataforma experimental para a compreensão da atividade da lactase e enzima cinética.

Medindo a atividade enzimática de Lactase no laboratório de ensino

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Este método é uma ferramenta útil para apresentar aos alunos os conceitos que regem as reações enzimáticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é adequada para alunos com muito pouca experiência em laboratório úmido, fornecendo resultados robustos para os alunos observarem e interpretarem. Para iniciar o protocolo, rotule uma suspensão de tubo de 15 mililitros.Esmague um comprimido de lactase contendo 200 miligramas de enzima em um pó uniforme usando um almofariz e pilão. Coloque o pó resultante no tubo rotulado e ressuspenda-o em 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato 100 milimolar, ou PBS. Vortex a solução por um minuto para maximizar a extração da enzima.Em seguida, transfira um mililitro da suspensão para um tubo de 1,5 mililitro e gire a amostra por um minuto a 10.000 vezes G para sedimentar as partículas sólidas. Transfira 500 microlitros do sobrenadante para um tubo limpo de 1,5 mililitro rotulado com extrato de lactase. Coloque 390 microlitros de PBS 100 milimolares em um tubo de 1,5 mililitro rotulado como reação A. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução ONPG de cinco milimolares e misture bem por vórtice.Adicione 10 microlitros de extrato no tubo de reação A e vórtice o conteúdo. Observe a mistura de reação frequentemente por cinco minutos e observe quaisquer alterações colorimétricas da solução. Configure dois tubos de 1,5 mililitro, um rotulado na reação B, um controle rotulado.Adicione 390 microlitros de PBS 100 milimolares ao tubo B de reação, 400 microlitros de PBS 100 milimolares ao tubo de controle e, em seguida, adicione 100 microlitros de ONPG de cinco milimolares a cada tubo. Misture o conteúdo por vórtice. Adicione 10 microlitros de extrato de lactase ao tubo de reação B, misture por vórtice e deixe a reação prosseguir por um minuto à temperatura ambiente.Decorrido um minuto, adicione 500 microlitros de carbonato de sódio molar a ambos os tubos para inibir a enzima lactase aumentando o pH, interrompendo a reação. Transfira 500 microlitros de cada tubo para cubetas de espectrofotômetro limpas e meça a absorbância em 420 nanômetros. Configure três tubos de controle e três tubos de reação e rotule-os quatro graus Celsius, temperatura ambiente e 37 graus Celsius.Após a adição do extrato enzimático, incube um tubo no gelo, um em temperatura ambiente e outro a 37 graus Celsius em banho-maria pré-aquecido por um minuto. Em seguida, pare a reação adicionando 500 microlitros de carbonato de sódio molar a cada tubo. Meça a absorbância em 420 nanômetros para cada tubo.Registre os valores, subtraindo o valor de controle do valor da reação em cada caso. Usando o protocolo, o controle permanece claro enquanto a solução de reação contendo extrato do comprimido de lactase fica amarela à medida que o ONPG é hidrolisado, liberando ortonitrofenol. Após a análise das amostras usando o espectrofotômetro, a produção de ortonitrofenol é menor quando a reação é incubada em gelo e mais alta quando a reação é realizada a 37 graus Celsius.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter as reações na temperatura apropriada antes de adicionar o extrato enzimático.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A atividade da descarboxilase induzível lisina é monitorado pela reação do substrato L-lisina e cadaverina o produto com 2,4,6 trinitrobenzensulfonic-ácido para formar adutos que têm solubilidade diferencial em tolueno.

Um ensaio para medir a atividade do Escherichia coli Induzível Lisina Decarboxyase

Este vídeo descreve um ensaio colorimétrico para medição de lactato em lisados celulares usando a enzima lactato desidrogenase. Esta enzima converte lactato em piruvato, juntamente com a conversão de NAD em NADH que reage com corantes de tetrazólio e dá um produto colorido que pode ser medido espectrofotometricamente para quantificar o lactato.

Ensaio Colorimétrico para Quantificação de Lactato em Amostras de Teste

O vídeo demonstra um ensaio para avaliar a atividade de sequestro autofágico em massa em células de mamíferos. Ele utiliza eletroporação para liberar proteínas citosólicas, incluindo lactato desidrogenase (LDH). As frações LDH sequestradas e LDH celular total são determinadas para avaliar o sequestro de LDH, fornecendo informações sobre a atividade geral de sequestro em massa.

Quantificando a atividade de sequestro autofágico em massa em células de mamíferos

Este vídeo demonstra a medição in vitro da atividade enzimática da α-galactosidase A e da α-glicosidase ácida em amostras usando substratos sintéticos de 4-metilumbeliferil.

Medição in vitro da atividade da enzima α-galactosidase A e da α-glicosidase ácida

Nós descrevemos um método reprodutível de preparação de células acinares pancreáticas de rato de um rato com a finalidade de examinar os sinais de cálcio de células acinares e lesão celular com estímulos fisiologicamente e patologicamente relevantes. Um método para a infecção adenoviral destas células também é fornecido.

Preparação de células pancreáticas acinares para Fins de cálcio Imaging, celulares Medidas ferimento e infecção adenoviral

Descreveremos um protocolo para mapear a distribuição espacial da atividade enzimática por enzimas que geram nicotinatmide adenina dinucleótido fosfato (NAD(P)H) + H + diretamente em amostras de tecido.

Metabolismo de mapeamento: Monitorar a atividade de lactato desidrogenase diretamente no tecido

Deteção de endotoxinas em nanomateriais engenharia representa um dos grandes desafios no campo da nanomedicina. Aqui, apresentamos um estudo de caso que descreve a estrutura composta por três diferentes formatos LAL para estimar a contaminação potencial de endotoxinas em nanopartículas.

Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

A estabilidade térmica da atividade da enzima é facilmente medida por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A maioria dos ensaios de estabilidade da proteína atualmente usado medida desdobramento de proteínas, mas não fornecem informações sobre a atividade enzimática. ITC permite a determinação direta do efeito das modificações da enzima na estabilidade da atividade enzimática.

Medição de estabilidade enzimática por calorimetria de Titulação Isotérmica

Lente de desenvolvimento envolve interações com outros tecidos. Mutantes olho várias zebrafish são caracterizados por um tamanho de lente anormalmente pequena. Aqui demonstramos um experimento de transplante de lente para determinar se este fenótipo é devido a causas intrínsecas ou interações com defeito com os tecidos que circundam a lente.

Transplante de lente em Zebrafish e sua Aplicação na Análise de Mutantes Eye

Projeto sobre Realidade Virtual Sistema Multi-sensor inteligente para o tratamento da ansiedade relacionada com Disorders (Intrepid) visa o desenvolvimento de um sensor multi-sensíveis ao contexto do sistema de realidade virtual para o tratamento de distúrbios relacionados a ansiedade.

O uso de Biofeedback na Clínica de Realidade Virtual: O Projeto INTREPID

Aprenda a medir a atividade enzimática da lactase usando ensaio colorimétrico em laboratório educacional. Este método acessível permite que estudantes observem cinética enzimática e compreendam fatores que afetam reações.

Medindo a atividade enzimática de Lactase no laboratório de ensino

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